25種黔產(chǎn)中藥材提取物體外抑菌活性的篩選

周藝 李洪菲 郭建軍 任歡 汪群豪 陳曉青

【摘 要】 目的：選取25種黔地中藥材，研究其70%乙醇提取物對臨床常見致病菌的體外抑菌活性。方法：中藥粗粉用70%乙醇回流提取，通過紙錠瓊脂擴(kuò)散法測定提取物的抑菌圈，微量倍比稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：25種黔產(chǎn)中藥材醇提物中，有15種中藥材對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚腥草、金錢草等5種中藥材對兩種病原菌的抗菌活性較為突出，抑菌圈d≥20 mm;對兩種病原菌的最低抑菌濃度范圍在7.82～31.25 mg/mL之間;對兩種病原菌的最低殺菌濃度范圍在15.625 ～62.50 mg/mL之間。結(jié)論：首次篩選出的5種抗菌活性較強(qiáng)的黔產(chǎn)中藥材，可為抗耐藥性的中藥抑菌劑和抑菌日化產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 黔產(chǎn)中藥材;金黃色葡萄球菌;大腸桿菌;最低抑菌濃度;最低殺菌濃度

【中圖分類號】R285.5? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? ? 【文章編號】1007-8517（2020）9-0032-07

Screening of antibacterial activity in vitro of 25 kinds of Chinese medicinal materials from guizhou

ZHOU Yi1 LI Hongfei3 GUO Jianjun2，3* REN Huan3 WANG Qunhao3 CHEN Xiaoqing4

1.High School， Anshun University，Anshun 561000，China;

2. College of Biotechnology，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang 212000，China;

3.College of Agriculture，Anshun University，Anshun 561000，China;

4.Chongqing Youliang Health Management Co.， Ltd，Chongqing 400000，China

Abstract：Object Selecte 25 kinds of traditional Chinese medicinal materials from guizhou， to study the antibacterial activity of 70% ethanolextract on common clinical pathogenic bacteria in vitro.Methods The traditional Chinese medicine powder was extracted by refluxing with 70% ethanol， and the bacteriostatic circle of the extract was measured by paper ingot AGAR diffusion method， and the minimum bacteriostaticconcentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） were determined bythe microfold dilution method. ResultsAmong the 25 kinds of alcohol extracts of guizhou traditional Chinese medicinal materials， 15 showed different degrees of bacteriostatic effects on n S. aureus and E. coli. Among them， Coptis chinensis Franch， Prunella vulgaris L， Rheum officinale Baill， Houttuynia cordata Thunb， Lysimachia christinae Hance have prominent antibacterial activities against the two pathogenic bacteria， with a bacteriostatic circle d ≥ 20 mm; The MIC of the two pathogens ranged from 7.82 mg/mL to 31.25 mg/mL. The MBC of the two pathogens ranged from 15.625 mg/mL to 62.50 mg/mL. Conclusion? Five kinds of guizhou Chinese medicinal materialswith strong antibacterial activity were screenedout， which provided certain scientific basis for the development of traditional Chinese medicine bacteriostatic agent and bacteriostatic daily chemical products.

Keywords：Chinese medicinal materials in guizhou;S.aureus; E. coli;MIC; MBC

大腸桿菌（Escherichia coli， EC）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， SA）現(xiàn)已成為世界上醫(yī)院內(nèi)常見的致病菌，被列為世界范圍內(nèi)最難解決的感染病菌之一[1-2]。大腸桿菌是哺乳動物小腸內(nèi)的共生菌且廣泛存在于生物體中。在人類中，大腸桿菌對腸道的感染部位分為腸外和腸內(nèi)，主要通過被污染的食物經(jīng)攝食進(jìn)入體內(nèi)而致病，引起急性腹瀉、血壓驟降以及人體脫水，腸道外感染會引發(fā)器官化膿等[3]。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，它可以使生物體內(nèi)的器官局部化膿感染，嚴(yán)重的會引起肺炎、心包炎、腸炎和敗血癥等[4]。

由于全世界范圍內(nèi)抗生素的不合理的應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性對人類的危害變得越來越嚴(yán)重，人們把目標(biāo)投向了來源廣泛、安全性高、廉價(jià)易得、抗耐藥機(jī)制獨(dú)特的中藥材[5-6]。貴州是中國中藥資源大省，自古“黔地?zé)o閑草，夜郎多靈藥”，特定的氣候條件適宜多種藥用植物的生長繁殖，且品質(zhì)優(yōu)良。本實(shí)驗(yàn)通過研究25種黔產(chǎn)中藥材對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的體外抑菌作用，以期篩選出抗菌活性較強(qiáng)的黔產(chǎn)中藥材，在天然中藥材中找到解決耐藥性問題的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 供試25種中藥材均購于貴州省藥材總公司。25種黔產(chǎn)中藥材種名和科屬見表1[7]。大腸桿菌（Escherichia coli， EC）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）由安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院提供。氫氧化鈉、氯化氫、氯化鈉、無水乙醇，均為分析純試劑（購自貴州博奧瑞杰生物科技有限公司）。SHP150型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），XD2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），SPDJ型凈化工作臺（上海浦東物理興學(xué)化學(xué)儀器廠），LDZX50FB高壓滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）。

1.2 藥材醇提物的制備 稱取30 g黔產(chǎn)中藥材，粉碎并過篩，以10倍體積（W/V）70%乙醇300 mL，回流提取兩次，每次1h，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用70%乙醇溶解定容至30 mL，4℃冰箱內(nèi)保存待測。注：100%藥液濃度定義為1 g中藥材濃縮至1 mL提取液的濃度。

1.3 培養(yǎng)基的配制 肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌20 min。肉湯瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl：5 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH7.2～7.4，121℃高壓滅菌20 min。

1.4 供試菌種的活化和菌懸液的制備 分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接入無菌斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，然后分別挑取活化好的1環(huán)菌種放入9 mL無菌肉湯培養(yǎng)基中，震蕩搖勻。稀釋成濃度約為0.1×108 CFU/mL的菌懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 抑菌環(huán)的測定 將已滅菌的肉湯瓊脂培養(yǎng)基倒入滅過菌的培養(yǎng)皿上（厚度為3 mm），用無菌棉簽取濃度為0.1×108 CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基。用無菌鑷子夾取浸透黔產(chǎn)中藥材提取物的紙錠（直徑為6 mm）放在含菌培養(yǎng)基表面，以無菌70%乙醇浸透的紙錠作對照，37℃培養(yǎng)24h，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 MIC的測定 采用倍比稀釋法，取9支試管，于每管中先加入無菌肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后于第1支試管中加入藥液2 mL混勻后再取出2 mL混合液放入第2支試管中，混勻后取出2 mL加入第3支試管中，以此類推，直到第9支試管混勻后棄掉2 mL，使得稀釋后各試管中的受試藥液濃度倍比降低，最后取0.1 mL菌懸液分別加入上述的試管中混勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察生長情況，受試藥物重復(fù)3次。將透明的最低藥液濃度定為最低抑菌濃度。

1.7 MBC的測定 將最低抑菌濃度以上的各濃度培養(yǎng)物分別取0.1 mL加到無菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒將菌液涂勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察生長情況，重復(fù)3次。將無菌生長的最低藥液濃度定為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物的抑菌圈直徑 通過紙錠瓊脂擴(kuò)散法測定提取物的抑菌圈。由表2可知，25種黔產(chǎn)中藥材中黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚腥草、金錢草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨等15種黔產(chǎn)中藥材分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌效果。連錢草、仙鶴草、紫珠、草赤芍、地骨皮、白芍、麥門冬、雞矢藤等8種中藥材對兩種病原菌的抑菌效果均不明顯。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚腥草、金錢草5種中藥材均對兩種病原菌的抑菌圈d≥20 mm，表明其抑菌效果最好，如圖1所示。70%乙醇作為對照組抑菌圈不明顯，表明其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響。

2.2 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物對兩種菌種的MIC 通過倍比稀釋法對25種黔產(chǎn)中藥材MIC測定。由表3可知，黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚腥草、金錢草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨、地榆等16種黔產(chǎn)中藥材對金黃色葡萄球菌的MIC范圍在15.625 ～250 mg/mL之間。黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚腥草、金錢草、夏枯草、野菊花、厚樸、川穹、金櫻子、五味子、白芨、透骨草等16種黔產(chǎn)中藥材對大腸桿菌的MIC范圍在7.82 ～250 mg/mL之間。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚腥草、金錢草5種中藥材對兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC在7.82 ～31.25 mg/mL之間，表明其抑菌效果最好。

2.3 25種黔產(chǎn)中藥材醇提物對兩種菌種的MBC 由表4可知，黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚腥草、金錢草、夏枯草、厚樸、野菊花、川穹、金櫻子、五味子、白芨、地榆等16種黔產(chǎn)中藥材對金黃色葡萄球菌的MBC范圍在31.25 ～1000 mg/mL之間。黃連、黃柏、大黃、苦參、虎杖、金銀花、魚腥草、金錢草、夏枯草、厚樸、野菊花、川芎、金櫻子、五味子、白芨、透骨草等16種黔產(chǎn)中藥材對大腸桿菌的MBC范圍在15.625 ～1000 mg/mL之間。其中，黃連、夏枯草、大黃、魚腥草、金錢草5種中藥材對兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBC范圍在15.625 ～62.5 mg/mL之間，說明其殺菌效果最好。

3 討論

本研究通過查閱文獻(xiàn)和醫(yī)學(xué)古籍，總結(jié)臨床醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)[8-11]，采用體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了15種黔產(chǎn)中藥材分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌效果。其中，黃連、大黃、魚腥草、夏枯草、金錢草5種中藥材對這兩種病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)只研究了25種黔產(chǎn)中藥材對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，而現(xiàn)如今多種多樣的致病性病原菌越來越廣泛，致病菌耐藥性問題較為嚴(yán)重，且傳染性疾病對社會恐慌影響較大。在后期的研究過程中，課題組將會繼續(xù)研究黔產(chǎn)中藥材對其它致病性病原菌的抑菌機(jī)理和抗耐藥性，希冀通過研發(fā)新型的“中藥綠色抗生素”，解決致病菌耐藥性問題，有助于合理深入開發(fā)利用貴州中藥資源。

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（收稿日期：2020-11-16 編輯：劉 斌）