腎元顆粒對(duì)db/db糖尿病腎病小鼠血管鈣化的改善作用及其機(jī)制

王 嵐，朱國(guó)雙，孫 龍，王小琴

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061；2. 湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科 湖北省中醫(yī)藥研究院腎病研究所，湖北 武漢 430061)

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN) 作為糖尿病(diabetic mellitus，DM)最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一[1]，在發(fā)達(dá)國(guó)家是終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)患者的首要病因[2]。在中國(guó)，DN發(fā)病率逐年升高，而在DN中普遍存在的心血管并發(fā)癥與血管鈣化密切相關(guān)，是影響患者生存質(zhì)量和生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。關(guān)注并加強(qiáng)DN血管鈣化發(fā)病機(jī)制的研究具有重要臨床意義。鈣磷代謝異常是導(dǎo)致DN患者血管鈣化的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)生與腎臟產(chǎn)生的克老素(Klotho)蛋白和骨骼分泌的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23)表達(dá)異常有關(guān)聯(lián)[4-5]。由于FGF23主要作用于腎臟，因此伴隨著腎臟受損，腎臟中Klotho蛋白隨之減少，導(dǎo)致體內(nèi)鈣磷代謝出現(xiàn)紊亂，最終誘發(fā)血管鈣化的形成。腎元顆粒是由黃芪、淫羊藿和酒制大黃組成，方中以黃芪為君，補(bǔ)先天元?dú)庖灾I填精，健后天脾氣以助運(yùn)化水谷，推動(dòng)血液運(yùn)行作用。本課題組前期研究[6-7]證實(shí)：腎元顆粒(批號(hào)：20190602) 可以上調(diào)腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)，降低體內(nèi)異常升高的FGF23水平，還可以調(diào)控體內(nèi)鈣磷代謝。本研究的側(cè)重點(diǎn)從前期的鈣磷代謝延伸到血管鈣化，通過(guò)建立db/db DN小鼠血管鈣化模型，探討給予腎元顆粒藥物后，小鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)改變以及血清中FGF23水平變化, 并觀察腎臟和胸主動(dòng)脈組織中Klotho、Pit1、Runx2和SM22α表達(dá)水平，為腎元顆粒治療DN胸主動(dòng)脈鈣化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)7周齡db/db DM小鼠20只，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：32002100006025。同系背景野生型(wild type，WT)小鼠10只，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)-2015-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：32002100006026，均購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院。

1.2 藥品、主要試劑和儀器腎元顆粒(湖北省中醫(yī)院，批號(hào)：20190602)；FGF23 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物有限公司，批號(hào)：201812)，兔抗小鼠Klotho(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AH08097988)，兔抗小鼠SM22α (英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab14106)，兔抗小鼠Runx2(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab23981)，內(nèi)參β-actin(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號(hào)：SV25)，兔抗小鼠Pit-1(美國(guó)Novus，批號(hào)：NBP1-32252)，山羊抗兔二抗HRP、ABScript Ⅱ cDNA第一鏈合成試劑盒和2×通用型SYBR Green快速qPCR預(yù)混液(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)：9300014001、9619580410和9619030716)，熒光驢抗兔二抗CY3(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GB22403)，總RNA提取試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：HP192402)。Clear First-1000核酸蛋白儀(上海閃譜生物科技有限公司)，MA-6000實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(加拿大Molarray生物科技公司)，TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司)，Supply Mini-Protean3電泳儀、Trans Blor Turho Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和Universal Hood 11CCD成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，BX43+DP2b Olympus光學(xué)顯微鏡、照相系統(tǒng)和Fluoview FV500型激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Olympus公司)，EG1150H型自動(dòng)生物組織包埋機(jī)和RM2255型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.3 動(dòng)物分組和給藥實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，db/db和WT小鼠于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，濕度為44%～65%，日照和夜照比為12 h∶12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只db/db小鼠隨機(jī)分為模型組和腎元顆粒組，每組10只，另取WT小鼠10只作為空白組，以連續(xù)3次空腹靜脈血糖≥16.7 mmol·L-1、尿量大于空白組150%且持續(xù)出現(xiàn)白蛋白尿判定為DN造模成功[8]，造模成功后，模型組和腎元顆粒組小鼠給予高磷飼料(含磷1.2%和鈣1.6%)，空白組小鼠給予普通飼料。腎元顆粒組小鼠給予腎元顆?；鞈乙?6.0 g·kg-1，按臨床用藥劑量經(jīng)動(dòng)物與人體間的等效劑量換算公式所得[9]，并且在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]中已得到驗(yàn)證)，給藥劑量均為20 mL·kg-1，模型組和空白組小鼠給予等量雙蒸水，連續(xù)灌胃12周。

1.4 樣本采集和處理在給藥第12周后，將3組小鼠摘眼球取血，并以4 200 r·min-1離心15 min，取上層血清，保存于-80℃超低溫冰箱中，待用。取血完成后，脫頸處死小鼠，暴露腹腔，摘下左側(cè)腎臟組織，置于-80℃超低溫冰箱中保存，備用；移除腹腔組織，沿小鼠脊柱小心快速取下胸主動(dòng)脈，并剪切取1/3置于4%多聚甲醛中固定保存，用于組織病理形態(tài)表現(xiàn)觀察和免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測(cè)，將剩余部分胸主動(dòng)脈置于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.5 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清FGF23水平取各組小鼠血清，按FGF23試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取出FGF23試劑盒，室溫放置20 min。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、生物抗原和親和素-HRP進(jìn)行稀釋?zhuān)渲孟礈煲?。于?biāo)準(zhǔn)孔及樣品孔中分別加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各100 μL，然后分別加入100 μL抗原工作液。洗滌液重復(fù)洗板5次，加入親和素-HRP，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。再次洗滌液洗滌5次，拍干，加入顯色液90 μL，37℃顯色10 min，再加入終止液50 μL?？瞻卓字胁患訕?，僅加入顯色劑和終止液。將加樣后的96孔板放入酶標(biāo)儀中，于450 nm波長(zhǎng)處依次讀取各孔的吸光度(A)值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，根據(jù)各樣品A值計(jì)算各樣品濃度。

1.6 HE染色和von Kossa染色檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織病理形態(tài)表現(xiàn)取各組小鼠胸主動(dòng)脈，行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，60℃烤箱中烘烤0.5 h，脫蠟、乙醇水化處理，蘇木素浸泡5 min，乙醇分化，自來(lái)水沖洗，1%伊紅浸泡1 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，鏡下觀察拍照。將包埋好的小鼠胸主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟、脫水。2%硝酸銀液浸泡，紫外線下照射25 min，5%硫代硫酸鈉液中浸泡1 min，伊紅溶液復(fù)染。再次酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下拍照，觀察各組小鼠胸主動(dòng)脈組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 Real-time PCR法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動(dòng)脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α mRNA表達(dá)水平每組取5只小鼠腎臟和胸主動(dòng)脈組織(質(zhì)量均為50 mg)，根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，并采用核酸蛋白分析儀測(cè)定各待測(cè)樣本RNA純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到擴(kuò)增前cDNA。以1 μL cDNA為模板按擴(kuò)增流程進(jìn)行擴(kuò)增分析。采用2-△△CT法進(jìn)行定量分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)所需引物均由武漢谷歌生物科技有限公司合成提供，選取小鼠β-actin作為內(nèi)參。本研究所用引物序列見(jiàn)表1。

1.8 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動(dòng)脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α蛋白表達(dá)水平每組取5只小鼠腎臟和胸主動(dòng)脈組織，質(zhì)量均為50 mg，加入蛋白裂解液，放入組織勻漿機(jī)中勻漿，離心，吸取上清，進(jìn)行蛋白定量分裝，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂奶粉封閉，分別加入Klotho、Runx2、Pit-1和SM22α一抗稀釋液(1∶500)，4℃搖床過(guò)夜，TBST清洗，每次10 min，洗滌3次，二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜，滴加A、B顯色液，凝膠電泳圖像分析儀顯影成像，采用Image J軟件定量分析，以小鼠β-actin作為內(nèi)參蛋白。計(jì)算各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動(dòng)脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

表1 PCR引物序列

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平取各組小鼠胸主動(dòng)脈組織石蠟塊切片，厚度約為4 μm，常規(guī)脫蠟，EDTA高壓鍋煮沸抗原修復(fù)10 min，3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，山羊血清37℃封閉45 min后，甩掉封閉液，滴加一抗Pit-1，放入4℃過(guò)夜；滴加二抗工作液，37℃恒溫箱孵育30 min；再滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，DAB顯色45 s，顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，檢測(cè)免疫組織化學(xué)A值。Pit-1蛋白表達(dá)水平=A值/組織面積。

1.10 免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中SM22α和Runx2蛋白表達(dá)水平取各組小鼠胸主動(dòng)脈組織石蠟塊切片，厚度約為4 μm，2%雙氧水浸泡10 min，TBST漂洗10次，0.3%Triton X-100破膜，3%雙氧水滅活，血清封閉，加入一抗Runx2和SM22α，4℃過(guò)夜，加入熒光二抗CY3，避光孵育1 h，DA磷封片，激光共聚焦鏡下拍照，計(jì)算胸主動(dòng)脈組織中Runx2和SM22α免疫熒光A值。SM22α和Runx2蛋白表達(dá)水平=A值/組織面積。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清FGF23水平給藥12周后,與空白組比較，模型組小鼠血清FGF23水平升高(P<0.01)；給藥12周后，與模型組比較，腎元顆粒組小鼠血清FGF23水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 給藥12周后各組小鼠血清FGF23水平

GroupFGF23 Blank271.27±35.27Model386.84±41.89*Shenyuan Granule334.23±24.41△

*P<0.01vsblank group；△P<0.05vsmodel group.

2.2 各組小鼠血管病理形態(tài)表現(xiàn)空白組小鼠血管內(nèi)膜平整，中膜細(xì)胞排列整齊，中膜彈性纖維和膠原纖維未出現(xiàn)斷裂，無(wú)鈣鹽沉積；與空白組比較，模型組小鼠血管內(nèi)膜不平整，中膜細(xì)胞核排列紊亂，彈性纖維斷裂，同時(shí)伴有明顯的血管鈣化灶；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠血管內(nèi)膜稍不平整，中膜彈性纖維未出現(xiàn)明顯斷裂，細(xì)胞核排列較不齊整，中膜鈣化灶較模型組少。見(jiàn)圖1(插頁(yè)一)和圖2(插頁(yè)一)。

2.3 各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動(dòng)脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α mRNA表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，胸主動(dòng)脈組織中Runx2和Pit-1 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，SM22α mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，腎元顆粒組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，胸主動(dòng)脈組織中Runx2和Pit-1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，SM22α mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動(dòng)脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α mRNA表達(dá)水平

GroupKlothoPit-1SM22αRunx2Blank2.46±0.370.90±0.280.98±0.151.01±0.11Model1.06±0.22*2.61±0.40*0.38±0.06*1.95±0.21*Shenyuan Granule1.49±0.33△1.77±0.47△0.54±0.07△△1.72±0.16△

*P<0.01vsblank group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.4 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動(dòng)脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，胸主動(dòng)脈組織中Pit-1和Runx2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，SM22α蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；給藥12周后，與模型組比較，腎元顆粒組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，胸主動(dòng)脈組織中Pit-1和Runx2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，SM22α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3和表4。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4(插頁(yè)一)和圖5。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Runx2和SM22α蛋白表達(dá)水平與空白組比較，模型組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Runx2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，SM22α 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Runx2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，SM22α 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Runx2蛋白表達(dá)見(jiàn)圖6(插頁(yè)一)和圖7，SM22α蛋白表達(dá)見(jiàn)圖8(插頁(yè)一)和圖9。

Lane 1：Blank group；Lane 2：Model group；Lane 3：Shenyuan Granule group.

圖3 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動(dòng)脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Klotho protein in kidney tissue and Pit-1, Runx2, SM22α proteins in thoracic aorta tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動(dòng)脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達(dá)水平

GroupKlotho protein Pit-1proteinRunx2proteinSM22αproteinBlank0.75±0.080.12±0.010.03±0.010.73±0.09Model0.17±0.02*0.72±0.051*0.72±0.03*0.03±0.01*Shenyuan Granule0.47±0.06△0.64±0.01△△0.60±0.03△0.40±0.03△△

*P<0.01vsblank group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

A：Blank group；B：Model group；C：Shenyuan Granule group.*P<0.05vsblank group;△P<0.01vsmodel group.

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平

Fig.5 Expression levels of Pit-1 protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

*P<0.05 vs blank group; △P<0.01 vs model group.

Fig.7 Expression levels of Runx2 protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

3 討 論

*P<0.05 vs blank group; △P<0.01 vs model group.

Fig.9 Expression levels of SM22α protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

DM發(fā)生的基本機(jī)制為陰虛為本，燥熱為標(biāo)。隨著病程進(jìn)展，累及于腎，發(fā)為DN。此時(shí)，腎精虧虛，腎氣不足，脾運(yùn)不健，無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，則易脈絡(luò)瘀阻，表現(xiàn)為鈣和磷在血管壁異位沉積誘發(fā)血管鈣化。針對(duì)DN患者血管鈣化腎精虧虛、脾運(yùn)無(wú)力、脈絡(luò)瘀阻的病機(jī)，治以健脾補(bǔ)腎，活血化濁之法。 腎元顆粒(原名腎安顆粒)是湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院用于治療多種慢性腎臟病的制劑(批號(hào)：鄂藥制字 Z20070209), 由黃芪、淫羊藿和酒制大黃組成。方中以黃芪為君，補(bǔ)先天元?dú)庖灾I填精，健后天脾氣以助運(yùn)化水谷，推動(dòng)血液運(yùn)行；淫羊藿為臣，補(bǔ)腎化氣，強(qiáng)筋健骨；佐以酒制大黃，取其行瘀破積，蕩滌濁毒之功。三藥共奏健脾補(bǔ)腎，活血化濁之效。本課題組在前期研究[10]中將藥物的有效作用部位大黃蒽醌、淫羊藿苷和黃芪苷分離提取后，加工成無(wú)糖顆粒。隨機(jī)對(duì)照臨床研究[11-12]顯示：腎元顆粒在保護(hù)腎功能、改善鈣磷代謝和緩解臨床癥狀方面明顯優(yōu)于對(duì)照組藥物愛(ài)西特。對(duì)腎性骨病大鼠模型研究顯示：模型組大鼠腎組織中 Klotho蛋白、股骨組織中骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)表達(dá)水平較空白組明顯降低，并伴有血鈣水平降低，血磷水平升高。采用腎元顆粒干預(yù)后，模型組大鼠腎臟組織中 Klotho蛋白表達(dá)水平升高，股骨組織中OPG和BMP-7 表達(dá)水平升高，說(shuō)明腎元顆粒通過(guò)調(diào)控 Klotho基因表達(dá)及骨代謝，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鈣和磷的調(diào)節(jié)[13-15]。

血管鈣化是DM最常見(jiàn)的血管病變之一[16]。血管鈣化并非鈣磷被動(dòng)沉積的過(guò)程，其由活躍細(xì)胞介導(dǎo)，涉及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡和囊泡釋放機(jī)制，可使VSMC從收縮型分化為成骨細(xì)胞，并使血管中高效的骨誘導(dǎo)因子和成骨細(xì)胞形成的早期標(biāo)志物表達(dá)增加。Pit-1作為Ⅲ型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要表達(dá)于腎臟、腦、心臟、肺部、肝臟、平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞中[17-18]。在體外，沉默VSMC中Pit-1表達(dá)可明顯抑制高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化發(fā)生[19]， 表明血管中Pit-1高表達(dá)是血管發(fā)生鈣化的主要原因之一。在體內(nèi)，腎臟表達(dá)的Klotho蛋白與FGF23結(jié)合非常緊密，并與其受體形成三元復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)活性維生素D的合成和降解，促進(jìn)尿磷的排泄，增加鈣離子(Ca2+)吸收，調(diào)控體內(nèi)鈣磷代謝[20]。當(dāng)腎臟受損時(shí)，不僅伴隨著Klotho蛋白表達(dá)減少，而且還出現(xiàn)血清中FGF23水平明顯升高，這時(shí)血管鈣化發(fā)生率隨著Klotho蛋白表達(dá)減少而急劇增加[21-22]。研究[23]顯示:Klotho基因敲除小鼠中，小鼠不僅伴隨著明顯早衰和臟腑功能減退等表型，同時(shí)還伴有血管鈣化表型出現(xiàn)。腹腔注射Klotho蛋白后,小鼠血管鈣化表型可得到明顯的改善[24],表明在血管鈣化的機(jī)制中，Klotho具有明顯的抑制作用。研究[25]顯示:這種鈣化表型的出現(xiàn)與體內(nèi)急劇升高的FGF23水平相關(guān)。當(dāng)腎臟受損時(shí)，體內(nèi)水平升高的FGF23在失去Klotho蛋白的調(diào)控后，形成脫靶效應(yīng)。有研究[26]顯示:向VSMC中加入外源性FGF23可明顯激活Pit-1表達(dá)，介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞對(duì)磷的吸收，使得血管上磷離子內(nèi)流增加，導(dǎo)致VSMC向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化[27-28]，并形成血管鈣化。

本研究通過(guò)高磷飲食，構(gòu)建的小鼠體內(nèi)高磷環(huán)境以加速db/db小鼠胸主動(dòng)脈血管鈣化發(fā)生。胸主動(dòng)脈的von Kossa染色結(jié)果顯示：模型組小鼠在高磷飲食條件下，小鼠胸主動(dòng)脈出現(xiàn)了鈣鹽沉積；血清ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組小鼠血清FGF23水平明顯升高； Real-time PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示：模型組小鼠胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平明顯升高，而該結(jié)果與YAMAZAKI等[26]的研究結(jié)果相符。在本研究中隨著FGF23/Pit-1信號(hào)通路的激活，模型組小鼠血管中高效的骨誘導(dǎo)因子和成骨細(xì)胞形成的早期標(biāo)志蛋白R(shí)unx2表達(dá)水平明顯升高，且血管平滑肌標(biāo)記物SM22α蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明通過(guò)高磷飲食誘導(dǎo)的高磷環(huán)境可以誘導(dǎo)db/db小鼠出現(xiàn)胸主動(dòng)脈鈣化，而這種鈣化的出現(xiàn)與FGF23/Pit-1信號(hào)通路的激活有關(guān)。經(jīng)過(guò)腎元顆粒干預(yù)后，小鼠血清FGF23水平降低，腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)水平明顯升高，胸主動(dòng)脈組織中Pit-1蛋白表達(dá)水平降低，成骨細(xì)胞形成的早期標(biāo)志蛋白R(shí)unx2表達(dá)水平亦減少，血管平滑肌標(biāo)記物SM22α表達(dá)水平升高表明腎元顆粒對(duì)小鼠胸主動(dòng)脈鈣化具有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能是腎元顆粒通過(guò)增加腎臟組織中Klotho蛋白表達(dá)水平，抑制血清FGF23水平，降低胸主動(dòng)脈中被激活的Pit-1蛋白的表達(dá)水平，最終達(dá)到改善胸主動(dòng)脈血管鈣化的作用。

綜上所述，通過(guò)高磷飲食可誘導(dǎo)db/db小鼠胸主動(dòng)脈發(fā)生血管鈣化，而其作用機(jī)制可能與FGF23/Pit-1信號(hào)通路的激活有關(guān)。腎元顆?？赏ㄟ^(guò)增加腎臟組織中Klotho蛋白的表達(dá)，并抑制FGF23/Pit-1信號(hào)通路，并抑制VSMC向成骨樣細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，抑制進(jìn)而減少鈣化的發(fā)生而發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用。