含纈酪肽蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

郭小菲,劉立紅，艾 浩,2

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,遼寧 錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121000)

卵巢癌是我國女性生殖系統(tǒng)死亡率最高的惡性腫瘤。2015年我國卵巢癌死亡病例接近新發(fā)病例的一半。近年來隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有了新的認(rèn)識，卵巢癌是一種多基因參與的疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的過程。目前，雖然明確了與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白及其表達(dá)產(chǎn)物，但只有一小部分應(yīng)用于臨床。因此需要更加深入地探討卵巢癌的具體發(fā)病機制，尋找新的腫瘤標(biāo)記物。

含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)即酵母中的Cdc48，最初是在對釀酒酵母進(jìn)行基因篩選時發(fā)現(xiàn)的，因其相對分子質(zhì)量為97 000，又被稱為P97，屬于參與多種細(xì)胞活性相關(guān)的三磷酸腺苷酶超家族中的一員，在多種重要的細(xì)胞活動中起分子伴侶的作用，可以與30多種不同功能的細(xì)胞蛋白相互作用，影響包括細(xì)胞核和高爾基體膜形態(tài)改變、線粒體質(zhì)量控制、囊泡轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、膜融合、細(xì)胞程序性死亡、泛素/蛋白酶依賴性蛋白降解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解等生理過程[1]。VCP在多種腫瘤，如宮頸癌[2]、前列腺癌[3]和骨肉瘤[4]等組織中異常表達(dá)。目前關(guān)于VCP在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及其與NF-κB信號通路關(guān)系的報道較少。本文作者從組織和細(xì)胞兩個方面探討VCP在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。CB-5083是一種VCP選擇性、競爭性抑制劑，主要通過選擇性結(jié)合VCP D2結(jié)構(gòu)域上的ATP結(jié)合位點而發(fā)揮作用[5-6]。本研究根據(jù)ZHOU等[7]得出的CB-5083半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)為680 nmol·L-1作為CB-5083的終濃度進(jìn)行實驗。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2013年1月—2018年1月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科初診并行手術(shù)治療的94例卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)患者的臨床資料。取94例患者手術(shù)切除的癌組織石蠟標(biāo)本。所有卵巢癌患者術(shù)前均未行放療、化療和激素治療，且患者未并發(fā)其他臟器腫瘤。所有標(biāo)本的病理診斷均經(jīng)術(shù)后石蠟切片證實，石蠟組織切片診斷結(jié)果均由同一名病理科專家復(fù)檢?；颊吣挲g為15～75歲，平均年齡為(54.90±10.55)歲。年齡≤50 歲者32例，>50 歲者62例；手術(shù)病理分期使用2013年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)重新修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：早期(Ⅰ-Ⅱ期)35例、晚期(Ⅲ-Ⅳ期)59例。病理類型：漿液性腺癌46例，黏液性腺癌14例，子宮內(nèi)膜樣腺癌20例，透明細(xì)胞性癌14例；組織學(xué)分級：低分化44 例、中分化34例、高分化16例；術(shù)中發(fā)現(xiàn)有腹水者55例，無腹水者39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例；血清CA125>35 U·mL-1者58例，血清CA125≤35 U·mL-1者36例。同時收集同一時間段的交界性腫瘤(13例)、良性腫瘤(36例)和正常卵巢組織石蠟標(biāo)本(8例)，標(biāo)本所屬研究對象的年齡為15～62歲，平均年齡為(38.84±11.09)歲。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器卵巢癌SKOV-3細(xì)胞和卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC購自深圳市豪地華拓生物科技公司。抗VCP抗體、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG和BCA試劑盒購自廣州碧云天公司，抗IκBα、抗p-IκBα和NF-κB抗體購自美國AbSci公司， FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自沈陽市萬類生物科技公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hy Clone公司，CB-5083購自美國TargetMol公司。CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜購自美國Thermo Fisher公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，恒溫水溶箱購自上海精宏公司，電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和評分標(biāo)準(zhǔn)采用免疫組織化學(xué)SP法，將石蠟切片烘烤、脫蠟、脫水、抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性氧化酶30 min，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行組織抗原修復(fù)20 min，10%正常山羊血清室溫封閉1 h，加入抗VCP抗體工作液(1∶150 稀釋) 濕盒中4℃過夜。次日37℃復(fù)溫1 h，滴加山羊抗兔IgG置于37℃孵育1 h。DAB染色劑染色1 min，三蒸水洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡檢評分。 VCP免疫組織化學(xué)陽性染色為棕黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，少量分布于細(xì)胞核。免疫組織化學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn):顯微鏡下每個研究病例隨機觀察5個400 倍放大的視野，每次隨機觀察其中的100個細(xì)胞，著色細(xì)胞百分比<5%為0分，5%≤著色細(xì)胞百分比<25%為1分，25%≤著色細(xì)胞百分比<50%為2分，著色細(xì)胞百分比≥50%為3 分；胞質(zhì)基本不著色為0分，染成淡黃色為1分，染成棕黃色為2分，染成棕褐色為3分。將上述2項得分的乘積作為綜合得分，將免疫組織化學(xué)染色結(jié)果得分≥4分作為陽性表達(dá)。計算VCP陽性表達(dá)率并比較不同臨床病理特征EOC患者腫瘤組織中VCP陽性表達(dá)率。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗檢測2組細(xì)胞遷移率實驗分成2組，經(jīng)CB-5083處理的SKOV-3細(xì)胞作為處理組，未經(jīng)CB-5083處理的SKOV-3細(xì)胞作為對照組。將SKOV-3細(xì)胞采用CB-5083處理24 h后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后將對照組和處理組細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基并加入1 mg·L-1絲裂霉素C處理1 h，防止細(xì)胞增殖導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。采用200 μL槍頭垂直于板底劃出人工劃痕，分別于0、12和24 h在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。細(xì)胞遷移率=(0 h邊緣距離-12 h或24 h邊緣距離)/0 h邊緣距離×100%。

1.5 平板克隆實驗檢測2組細(xì)胞克隆形成率實驗分成2組，經(jīng)CB-5083處理的SKOV-3細(xì)胞作為處理組，未經(jīng)CB-5083處理的SKOV-3細(xì)胞作為對照組。將SKOV-3細(xì)胞用CB-5083處理24 h后以每孔1 000個細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。每隔3 d換液1次，肉眼觀察出現(xiàn)集落(約15 d)后終止培養(yǎng)。PBS反復(fù)清洗3次，以4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色。自然晾干后拍照，記錄形成集落數(shù)量。細(xì)胞克隆形成率=細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 免疫熒光法檢測SKOV-3細(xì)胞和HOSEpiC細(xì)胞中VCP蛋白表達(dá)以及處理組和對照組SKOV-3細(xì)胞中VCP表達(dá)細(xì)胞爬片，以4%多聚甲醛固定15 min；0.1% Triton X-100打孔15 min；山羊血清封閉液封閉30 min；加入VCP抗體(稀釋比例1∶100)放入濕盒內(nèi)并轉(zhuǎn)移至4℃過夜；滴加熒光二抗(以下操作注意避光)；DAPI染核10 min；滴加抗熒光淬滅劑暗室內(nèi)用熒光顯微鏡觀察染色效果并拍照。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：于帶有攝影器材的倒置熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，F(xiàn)ITC 散發(fā)熒光為綠色，Cy3散發(fā)熒光為紅色，在普通光下選擇細(xì)胞分布均勻的部位觀察，每張爬片隨機選取10個高倍(放大200倍)視野，于熒光顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞熒光強度，并排除非特異性熒光，快速觀察以免熒光淬滅。定性判斷標(biāo)準(zhǔn)：(-)代表無熒光；(±)代表熒光極弱；(+)代表熒光不強但清楚可見；()代表熒光較為明亮；(～)代表熒光極為明亮。

1.7 Western blotting法檢測SKOV-3細(xì)胞和HOSEpiC細(xì)胞中VCP、NF-κB/P65、IκBα及p-IκBα蛋白表達(dá)水平采用BCA法檢測SKOV-3細(xì)胞中VCP、NF-κB/P65、IκBα及p-IκBα蛋白表達(dá)水平, 計算上樣體積。電泳, 轉(zhuǎn)膜, 封閉1 h, 一抗4℃孵育過夜, TBST洗膜3次, 二抗室溫孵育1 h, TBST洗膜3次, ECL顯影。凝膠成像儀獲取圖像, 實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 EOC、交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中VCP陽性表達(dá)率VCP蛋白在正常卵巢上皮、良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤和EOC組織中均有表達(dá)，其主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),少量表達(dá)于細(xì)胞核(圖1，見封三)。4種組織中VCP陽性表達(dá)率逐漸升高，分別為25.0%(2/8)、41.7%(15/36)、61.5%(8/13)和73.4%(69/94)，VCP陽性表達(dá)率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.839,P<0.05)。將EOC分別與其他3種組織進(jìn)行比較，采用Bonferroni法調(diào)整α水平，結(jié)果顯示:EOC與交界性卵巢腫瘤和EOC與正常卵巢組織中VCP陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，EOC與交界性卵巢腫瘤組織中VCP陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。

卵巢癌FIGO分期為晚期者(Ⅲ-Ⅳ期)、低分化者及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者腫瘤組織中VCP陽性表達(dá)率高于卵巢癌FIGO分期為早期者(Ⅰ-Ⅱ期)、中分化者、高分化者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。VCP表達(dá)與患者的病理類型、年齡、是否有腹水和術(shù)前血清CA125水平無關(guān)聯(lián)。不同臨床病理特征EOC患者腫瘤組織中VCP表達(dá)見表1。

表1 不同臨床病理特征EOC患者腫瘤組織中VCP陽性表達(dá)率

2.2 2組細(xì)胞遷移率應(yīng)用劃痕實驗分析SKOV-3細(xì)胞的遷移率，結(jié)果顯示：處理組SKOV-3細(xì)胞遷移率明顯低于對照組(P<0.05)，提示VCP促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞遷移。見圖2。

2.3 2組細(xì)胞克隆形成率應(yīng)用平板克隆實驗分析SKOV-3細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示：處理組SKOV-3細(xì)胞克隆形成率(52.70%±3.64%)明顯低于對照組(68.80%±3.37%)(P<0.05)，提示VCP促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞增殖。見圖3(封三)。

2.4 SKOV-3和HOSEpiC細(xì)胞中VCP表達(dá)VCP主要分布于細(xì)胞質(zhì)，少量分布于細(xì)胞核。在SKOV-3細(xì)胞中熒光極弱(±)，在HOSEpiC細(xì)胞中熒光較為明亮()，在SKOV-3細(xì)胞中VCP表達(dá)明顯多于HOSEpiC細(xì)胞(圖4，見封三)，Westen blotting法檢測結(jié)果顯示：HOSEpiC細(xì)胞中VCP表達(dá)水平為0.493±0.680，SKOV-3細(xì)胞中VCP表達(dá)水平為0.980±0.034，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.5 處理組和對照組SKOV-3細(xì)胞中VCP表達(dá)對照組SKOV-3細(xì)胞中VCP熒光較為明亮()，處理組SKOV-3細(xì)胞中VCP熒光清晰可見但較弱(+)，處理組SKOV-3細(xì)胞中VCP熒光強度明顯低于對照組。見圖6(封三)。

A:Migration morphology;B:Histogram of migration rate(*P<0.05vscontrol group).

圖2 不同時間點2組SKOV-3細(xì)胞遷移情況

Fig.2 Migration of SKOV-3 cells in two groups at different time points

2.6 對照組和處理組SKOV-3細(xì)胞中VCP、NF-κB/P65、IκBα及p-IκBα蛋白表達(dá)水平Western blotting檢測結(jié)果顯示:處理24 h后，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，與對照組比較，處理組SKOV-3細(xì)胞中VCP蛋白表達(dá)水平降低26.39%、NF-κB/P65 蛋白表達(dá)水平降低56.60%，p-IκBα蛋白表達(dá)水平升高62.36%，處理組和對照組SKOV-3細(xì)胞中VCP、NF-κB/P65和IκB-α蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。處理組和對照組SKOV-3細(xì)胞中 p-IκBα蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

Lane 1:HOSEpiC cells;Lane 2:SKOV-3 cells.

圖5 Western blotting法檢測SKOV-3和HOSEpiC細(xì)胞中VCP表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expression of VCP in SKOV-3 and HOSEpiC cells detected by Western blotting method

A:Electrophoregram(Lane 1:Control group; Lane 2:Treatment group);B:Histogram(*P<0.05vscontrol group).

圖7 2組SKOV-3細(xì)胞中VCP、NF-κB/P65、IκB-α和p-IκBα蛋白表達(dá)情況

Fig.7 Expressions of VCP,NF-κB/P65,IκBα,and p-IκBα proteins in SKOV-3 cells in two groups

3 討 論

VCP屬于參與多種細(xì)胞活動的ATP酶家族中的一員，其在泛素依賴性蛋白酶體降解途徑中起關(guān)鍵作用[1]。 ASAI等[8]研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染VCP基因的鼠骨肉瘤細(xì)胞系中，當(dāng)腫瘤壞死因子α刺激時表現(xiàn)出持續(xù)活化的NF-κB，迅速降解p-IκBα，而降低細(xì)胞凋亡率，增加轉(zhuǎn)移潛能。研究表明：VCP在許多腫瘤組織中呈過表達(dá)狀態(tài)，包括前列腺癌[3]、骨肉瘤[4]和肝癌[9]。也有研究[10-11]表明：VCP表達(dá)可能是非小細(xì)胞肺癌患者總體生存率的獨立預(yù)后因素。ZHU等[12]發(fā)現(xiàn)：VCP表達(dá)與眼眶原發(fā)性黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(mucosa- associated lymphoid tissue lymphoma,MALT)相關(guān),VCP高表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤體積增大和生存期縮短呈顯著相關(guān)關(guān)系。MEYER等[13]發(fā)現(xiàn)：經(jīng)手術(shù)治療的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)陰性口咽鱗狀細(xì)胞癌患者中，VCP表達(dá)可作為HPV陰性口咽鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物。LUO 等[14]發(fā)現(xiàn):在接受放療的局部晚期食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者中,VCP可作為一項總體生存預(yù)后指標(biāo)。VCP抑制劑與放射治療相結(jié)合可作為有效治療ESCC的方法。ZHU等[15]發(fā)現(xiàn)：VCP表達(dá)水平與眼眶B細(xì)胞淋巴瘤的分期、腫瘤分級和復(fù)發(fā)率有關(guān)。VCP表達(dá)水平越低，患者生存期越長。MOHAMMED等[2]發(fā)現(xiàn)：VCP的免疫組織化學(xué)結(jié)果對CIN2/CIN3+的診斷敏感度為93.0%、特異度為88.0%，可作為宮頸癌篩查的重要生物標(biāo)志物。目前，VCP在EOC中的表達(dá)情況及其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。因此，研究VCP在EOC中的表達(dá)情況以及VCP如何調(diào)控SKOV-3細(xì)胞的遷移和增殖十分必要。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測94例EOC、13例交界性卵巢腫瘤、36例良性卵巢腫瘤和8例正常卵巢組織中VCP表達(dá)情況，結(jié)果顯示：VCP在EOC組織中呈高表達(dá)，不同臨床病理特征EOC患者腫瘤組織中VCP表達(dá)水平不同，VCP的表達(dá)與患者FIGO分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。因此VCP可能是判斷EOC患者嚴(yán)重程度的一個潛在指標(biāo)。

為了研究VCP在EOC發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題組采用VCP抑制劑CB-5083作用于SKOV-3細(xì)胞。CB5083是一種有效、選擇性、可口服的VCP生物可利用抑制劑[6]。劃痕實驗和平板克隆形成實驗表明：抑制VCP可抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖和遷移。上述研究結(jié)果提示：VCP在EOC的腫瘤發(fā)生調(diào)控中起重要作用，與VALLE等[11]的研究結(jié)果一致。NF-κB是一種廣泛分布于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因轉(zhuǎn)錄，在腫瘤抗凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。NF-κB通過激活cyclinD1轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖；通過調(diào)節(jié)抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤XL基因(B-cell lymphoma XL， Bcl-XL)和B細(xì)胞淋巴瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)等的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞凋亡；通過調(diào)控細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,CAM-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)在肝癌[16]、宮頸癌[17]和乳腺癌[18]等多種惡性腫瘤中檢測到異?；罨腘F-κB。 有研究[19]表明：VCP能促進(jìn)Cullin戒指泛素連接酶/依賴蛋白酶體降解IκBα，進(jìn)而激活NF-κB信號通路。目前研究者[4，8]認(rèn)為：VCP在大多數(shù)惡性腫瘤中是通過NF-κB通路發(fā)揮作用，但是關(guān)于其在EOC中作用機制研究較少，為了進(jìn)一步探討VCP在EOC發(fā)生過程中的作用機制，本研究應(yīng)用VCP抑制劑CB-5083處理SKOV-3細(xì)胞，采用Western blotting技術(shù)分析VCP與EOC發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：當(dāng)抑制VCP時，NF-κB/P65表達(dá)水平降低，IκBα表達(dá)水平無明顯變化，而p-IκBα表達(dá)水平升高，可見VCP是通過降解p-IκBα而激活NF-κB通路參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，本研究結(jié)果同劉鈞等[20]和ASAIT等[8]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，VCP 在EOC組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá)，可促進(jìn)EOC的遷移和增殖；抑制VCP表達(dá)后可以通過下調(diào)NF-κB信號通路來抑制SKOV-3細(xì)胞的遷移和增殖，其可能成為卵巢癌治療的靶點。