胸腔積液中B7-H4蛋白聯(lián)合ADA和CEA水平檢測在胸腔積液鑒別診斷中的應(yīng)用價值

李銳成，郜趙偉，張惠中，林 芳，劉 沖，董 軻

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710038)

研究[1]顯示：可導(dǎo)致胸腔積液(pleural effusion，PE)的疾病有上百種，惡性PE多由惡性腫瘤(淋巴瘤、胃腸道腫瘤、卵巢腫瘤、乳腺腫瘤和肺部腫瘤等)轉(zhuǎn)移至胸膜，良性PE多繼發(fā)于各類炎癥(結(jié)核性胸膜炎、肺炎、結(jié)締組織病、器官功能障礙和系統(tǒng)性疾病等)[2-3]。多項研究[4-7]顯示：肺癌性惡性胸腔積液(malignant pleural effusion associated with lung cancer，LC-MPE)和結(jié)核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion，TPE)是滲出性PE產(chǎn)生的2種最常見原因，并且二者的臨床表征、影像學(xué)和實驗室檢查結(jié)果相似。LC-MPE所引起的喘息、憋悶和呼吸困難等臨床癥狀嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量、預(yù)后和生存期[8]。TPE是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)侵及胸膜后導(dǎo)致結(jié)核性胸膜炎產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)所致，如能早診斷早治療，則患者預(yù)后較好[9]。LC-MPE和TPE的致病機(jī)制、治療方案和預(yù)后轉(zhuǎn)歸不同，提示早期診斷十分重要。

多項研究[10-13]顯示：負(fù)性共刺激因子B7-H4過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、侵襲、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和嚴(yán)重程度密切相關(guān)?？扇苄訠7-H4水平可以作為腫瘤侵襲深度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤階段和預(yù)期壽命的預(yù)測指標(biāo)。研究[14]表明：實體腫瘤患者血清中也能檢測到B7-H4水平異常升高，表明B7-H4可作為惡性腫瘤的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后判斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物，但有關(guān)于B7-H4蛋白在LC-MPE和TPE中表達(dá)水平的關(guān)系卻尚未見報道，本研究探討了單項和聯(lián)合PE中腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和B7-H4蛋白檢測在診斷LC-MPE與TPE中的價值及其鑒別閾值，為2種疾病的鑒別診斷及早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象來源于2017年9月—2018年12月本院胸腔外科和呼吸科就診的PE待查患者202例,其中LC-MPE組120例(包括肺腺癌79例、肺鱗狀細(xì)胞癌20例和肺小細(xì)胞癌21例)，其中53例患者通過胸膜活檢確診，67例患者通過胸水病理細(xì)胞學(xué)確診；TPE組82例，10例患者通過胸水病理細(xì)胞學(xué)確診，52例患者在胸膜活檢中顯示典型的上皮樣細(xì)胞干酪性肉芽腫，其余20例患者根據(jù)試驗性用藥確診。本研究擬定試驗方案后，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得了受試者知情同意。

1.2 診斷、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) LC-MPE診斷：需滿足以下所有標(biāo)準(zhǔn)：① X線或CT檢查有肺部腫塊、陰影，抗結(jié)核治療無效或加重；② PE為滲出性，抗酸染色結(jié)果陰性或MTB培養(yǎng)陰性；③ 組織病理學(xué)檢查證實為肺癌[15]。

TPE診斷：需至少滿足以下1條標(biāo)準(zhǔn)：① PE為滲出性，PE抗酸染色結(jié)果陽性或MTB培養(yǎng)陽性；② 胸膜組織病理學(xué)檢查證實結(jié)核，如可見郎罕氏巨細(xì)胞、干酪樣壞死和典型的增殖樣結(jié)核改變等；③ 患者臨床表現(xiàn)有明顯的結(jié)核中毒癥狀(低熱、盜汗和乏力等)，并有一般胸膜炎癥狀(咳嗽、胸悶和胸痛等)，抗結(jié)核治療PE明顯吸收[16]。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ① PE初診患者且尚未采取任何有針對性的抗結(jié)核和抗腫瘤治療；② 年齡大于40歲；③ 肝、腎和心功能無明顯異常；④ 未并發(fā)其他部位腫瘤；⑤ 臨床資料完整，出院最終診斷明確；⑥ PE標(biāo)本新鮮，足量，抽取后立即送檢。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 入院前有手術(shù)和放化療史者；② 受試者標(biāo)本量不足1 mL者；③ 有嚴(yán)重心、肝和腎臟功能不全者；④ 妊娠者；⑤ 臨床資料不完善者；⑥ 標(biāo)本存在明顯溶血、嚴(yán)重脂血者；⑦診斷不清或尚未明確者；⑧ 免疫缺陷者。

1.3 標(biāo)本收集和檢測方法

1.3.1 標(biāo)本收集方法 收取PE待查患者穿刺液樣本1～5 mL，首先用200目無菌濾網(wǎng)去除PE中的凝塊和絮狀沉淀等有形成分后采用15 mL離心管3 000 r·min-1離心10 min，再用加樣槍吸取1 mL上清置于一次性1.5 mL離心管中，于管蓋上做好標(biāo)記，置于-80℃冰箱保存，后依據(jù)明確的診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合要求的PE標(biāo)本待測B7-H4蛋白。

1.3.2 標(biāo)本檢測 相對應(yīng)的PE中ADA和CEA檢測分別由本院檢驗科生化室和免疫室完成，采用酶速率法檢測ADA水平，儀器為美國貝克曼COULTER-AU5800全自動生化分析儀，試劑為科華生物科技股份有限公司生產(chǎn)，結(jié)果以U·L-1表示；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測CEA水平，儀器為德國羅氏E-601型電化學(xué)發(fā)光自動分析儀，試劑為德國羅氏配套產(chǎn)品，結(jié)果以 μg·L-1表示；采用雙抗體夾心ELISA法檢測B7-H4蛋白水平，試劑為英國Abcam公司生產(chǎn)的Human B7-H4 SimpleStep ELISA Kit試劑盒，結(jié)果以ng·L-1表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 2組PE患者基本資料

202例患者中，男性135例，女性67例，平均年齡為(61.84±11.85)歲；LC-MPE組患者120例，男性80例，女性40例，平均年齡(61.75±10.85)歲；TPE組患者82例，男性55例，女性27例，平均年齡(61.94±13.25)歲。2組患者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組PE患者基本資料

“-”：No data.

2.2 2組患者PE中ADA、CEA和B7-H4蛋白水平

TPE組患者的ADA水平明顯高于LC-MPE組(P<0.05)； LC-MPE組患者CEA和B7-H4蛋白水平高于TPE組(P<0.05)。見表2。

2.3 ADA、CEA和B7-H4蛋白各單項指標(biāo)及聯(lián)合診斷對LC-MPE和TPE的鑒別診斷價值

采用ROC曲線分析ADA、CEA和B7-H4蛋白各單項指標(biāo)及聯(lián)合診斷：① ADA、CEA和B7-H4蛋白的最佳臨界值分別為15.50 U·L-1、3.26 μg·L-1和24.38 ng·L-1，相應(yīng)的靈敏度分別為93.30%、83.33%和79.90%，特異度分別為86.59%、96.34%和72.50%，AUC分別為0.927(95%CI：0.885～0.969)、0.925(95%CI：0.889～0.962)及0.836(95%CI：0.782～0.890)；② 各單項指標(biāo)YI均大于0.5(YI分別為0.800、0.800和0.518)，且ADA和CEA 的YI均大于0.7；③ 各單項指標(biāo)AUC均大于0.7(0.927、0.925 和0.836)；④ 各單項指標(biāo)均同時具備了YI大于0.5且AUC大于0.7的條件，具有較好的鑒別診斷價值，其中ADA的靈敏度最高(93.30%)，CEA特異度最高(96.34%)，B7-H4蛋白的診斷效能最低(靈敏度為79.90%，特異度為72.50%，YI為0.518，AUC為0.836)；⑤3項指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合鑒別診斷后，CEA+B7-H4蛋白模式有最高的靈敏度(100.00%)，ADA+CEA模式有最高的特異度(98.33%)，ADA+CEA+B7-H4蛋白模式有最高的診斷效能(靈敏度為93.90%，特異度為97.50%，YI為0.914，AUC為0.989)。見表3和圖1。

表2 2組患者PE中ADA、CEA和B7-H4水平

表3 ADA、CEA和B7-H4單項和三者聯(lián)合診斷LC-MPE和TPE的價值

“-”：No data.

圖1 ADA、CEA和B7-H4單項和三者聯(lián)合診斷LC-MPE和TPE的ROC曲線

Fig.1 ROC curves of single and combined detection of ADA,CEA,and B7-H4 for differential diagnosis of LC-MPE and TPE

3 討 論

ADA廣泛存在于淋巴組織豐富的器官，主要參與嘌呤核苷酸代謝，而作為重要免疫抑制因子的腺苷又是該代謝過程的中間產(chǎn)物[17]。因此，ADA可通過調(diào)節(jié)腺苷的方式在機(jī)體正常免疫系統(tǒng)的平衡穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[18]。ADA與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)聯(lián)，因而其活性檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用到多種疾病的輔助診斷，如結(jié)核病、肝病甚至自身免疫性疾病[19]。發(fā)生結(jié)核性胸膜炎時，因以淋巴細(xì)胞活性升高為主的細(xì)胞免疫機(jī)制被啟動導(dǎo)致淋巴細(xì)胞活性普遍升高[20]。ADA主要存在于淋巴細(xì)胞中且與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)有密切關(guān)聯(lián)[21-22]。本研究中LC-MPE患者PE中ADA水平低于TPE組，ROC曲線分析顯示：15.50 U·L-1為最佳臨界值，靈敏度、特異度、YI和AUC分別為93.30%、86.59%、0.800和0.927，顯示出極好的診斷效能，與ZHANG 等[23]報道結(jié)果相符。

作為一種腫瘤相關(guān)抗原，CEA用于多種惡性腫瘤的篩查和診斷。當(dāng)腫瘤侵及胸膜時，腫瘤細(xì)胞會大量分泌CEA并釋放入PE，因其為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性糖蛋白，相對分子質(zhì)量較大，極難由PE入血，更不似血液中的CEA可經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝臟代謝降解，致使惡性PE中CEA水平遠(yuǎn)高于血清[24]。但因惡性PE產(chǎn)生復(fù)雜，起因于多種腫瘤，且以肺癌為著，肺癌有多種病理類型，導(dǎo)致國內(nèi)外PE中CEA標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一參考值范圍[25]。本研究結(jié)果顯示TPE組患者PE中CEA水平明顯低于LC-MPE組，CEA的最佳臨界值為3.26 μg·L-1，靈敏度、特異度、YI和AUC分別為83.33%、96.34%、0.800和0.925，顯示出極好的診斷效能。因本研究旨在探討LC-MPE與TPE之間的鑒別診斷而僅選擇TPE作為對照組，與多數(shù)研究以肺部良性疾病(肺炎和結(jié)核性胸膜炎等)為對照組不同，因此對照組選擇的不同導(dǎo)致結(jié)果與RADJENOVIC等[26]和SON等[27]的報道結(jié)果略有差異。

負(fù)性共刺激因子B7-H4屬于B7家族成員，研究[28]表明：B7-H4蛋白在某些惡性腫瘤中出現(xiàn)過度表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、逃逸和預(yù)后密切相關(guān)，如乳腺癌、腎細(xì)胞癌及卵巢癌等[29]。那么腫瘤患者體液標(biāo)本中B7-H4水平是否也出現(xiàn)異常升高？TPE患者體液標(biāo)本中B7-H4蛋白水平如何？針對LC-MPE和TPE在臨床診斷中的難以鑒別這一難題，檢測PE中的B7-H4蛋白水平是否有助于二者的鑒別診斷？基于上述文獻(xiàn)報道和臨床實際，本研究檢測2組患者PE中B7-H4蛋白水平，結(jié)果顯示：TPE組患者PE中B7-H4蛋白水平低于LC-MPE組。本研究中其最佳診臨界為24.38 ng·L-1，靈敏度、特異度、YI和AUC分別為79.90%、72.50%、0.518和0.836，顯示出較好的診斷效能。因此PE中B7-H4蛋白水平檢測可作為LC-MPE和TPE患者的鑒別診斷指標(biāo)。

近年來，多項指標(biāo)聯(lián)合檢測對PE性質(zhì)進(jìn)行鑒定的研究[30]多有報道，但將LC-MPE從MPE中獨立出來利用PE中B7-H4蛋白水平與TPE進(jìn)行鑒別診斷卻未見報道。本研究利用ROC曲線對ADA、CEA和B7-H4蛋白的單項診斷效能進(jìn)行初步評價(YI均>0.5，AUC均>0.7)，之后對此3項指標(biāo)進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合探討其在LC-MPE和TPE的鑒別診斷方面的價值。本研究采用平行試驗，納入4種聯(lián)合模式，ADA+CEA聯(lián)合模式診斷效能最高。3項同時聯(lián)合模式擁有4種聯(lián)合模式中最高的診斷效能。從單項指標(biāo)、2項聯(lián)合以至3項聯(lián)合納入指標(biāo)逐次遞增的同時，診斷性能也在隨之增高，且3項指標(biāo)同時聯(lián)合檢測的診斷效能最高。

綜上所述，在鑒別診斷LC-MPE和TPE時，聯(lián)合診斷的診斷效能高于單項指標(biāo)，應(yīng)盡量進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合診斷；ADA+CEA+B7-H4蛋白3項指標(biāo)聯(lián)合模式明顯提高了診斷效能，可作為一項理想的診斷模式，對有效鑒別LC-MPE和TPE、減少誤診漏診具有重要的臨床意義(尤其是在病理手段未能明確病因的情況下)。由于肺癌導(dǎo)致的PE以腺癌居多，導(dǎo)致本研究納入的鱗癌和小細(xì)胞癌的樣本量較少，存在病理分型引起的偏倚，未來本課題組將增加樣本量，納入更多肺鱗癌和小細(xì)胞癌病例，進(jìn)一步探討B(tài)7-H4蛋白在肺癌的治療監(jiān)測及預(yù)后評估中的臨床應(yīng)用價值。