大黃素對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制

畢勇志，馬 芬，時(shí)俊霞，宋琳琳，李林澤

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，河南 開(kāi)封 475000；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 開(kāi)封 475000)

急性缺血性腦卒中是由于腦動(dòng)脈閉塞引起缺血和缺氧導(dǎo)致的腦組織壞死軟化的疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]。急性缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，有研究[2]表明：其發(fā)生通常伴隨著神經(jīng)元炎癥反應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要通路，研究[3-4]顯示：NF-κB p65可以直接誘導(dǎo)各種炎癥因子的表達(dá)。

大黃素是中藥大黃的主要有效成分，可通過(guò)血腦屏障，短期內(nèi)給予大鼠大劑量服用無(wú)明顯毒性[5]。藥理研究[6-7]表明：大黃素具有抗炎作用和神經(jīng)保護(hù)作用。大黃素可與葡萄糖結(jié)合為蘆薈大黃素-8-0-葡萄糖苷，降低活性氧生成和NF-κB活性，抑制炎性因子的分泌[8]。目前關(guān)于大黃素對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用尚未明確，本研究采用大腦中動(dòng)脈阻斷法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立局灶性腦缺血大鼠模型，探討大黃素對(duì)局灶性腦缺血的保護(hù)作用及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，為研究大黃素對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器60只SPF級(jí)SD 大鼠，雌性，6月齡，體質(zhì)量為(220±20)g，購(gòu)自河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(豫)2016-0006。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)室溫度為(22±3)℃，濕度為(55±5)%。大黃素購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度>98%，批號(hào)：20180301)。白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β, IL-1β) ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，兔抗人NF-κB購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因兔多克隆抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。MicroTec旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)甘特工具和機(jī)械制造有限公司)，AMR-100酶標(biāo)分析儀(成都昱強(qiáng)科技有限公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，低、中和高劑量大黃素組，每組10只。假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給予地塞米松[9](5 mg·kg-1)；低、中和高劑量大黃素組大鼠給藥劑量按照人與動(dòng)物體表面積等效劑量計(jì)算，按照中國(guó)藥典規(guī)定成人日用量乘以6.3倍，分別灌胃給予10、20和40 mg·kg-1大黃素。各組大鼠造模前3 d開(kāi)始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)給藥3 d后建立MCAO動(dòng)物模型。

1.3 MCAO動(dòng)物模型的建立[10]大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為350 mg·kg-1，酒精消毒后，沿頸部中線偏左側(cè)剖開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端處，結(jié)扎近心端，結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉，頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎處剪斷1個(gè)“V”型小口，將3.0 mm尼龍絲線插入動(dòng)脈，沿小口徹底剪斷頸外動(dòng)脈。將頸外動(dòng)脈殘端沿著頸內(nèi)動(dòng)脈拉直，緩慢推進(jìn)絲線，感到阻力時(shí)停止，離頸總動(dòng)脈分叉2 cm處結(jié)扎備線。阻塞動(dòng)脈90 min，緩慢輕柔拉出絲線，再灌注48 h。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行動(dòng)脈分離，但不插入絲線。待大鼠蘇醒后評(píng)估神經(jīng)功能缺損，大鼠不能伸展右側(cè)前肢、行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈或行走時(shí)向右側(cè)傾倒視為模型制備成功[11]。

1.4 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分各組大鼠于造模后24 h提尾懸空離地面約40 cm，觀察兩前肢狀態(tài)；將大鼠置于水平地面，輕按雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力；將大鼠置于地面，觀察其行走情況。按照BEDERSON等[12]的方法評(píng)分：行為完全正常，0分；提尾懸空時(shí)，大鼠手術(shù)對(duì)側(cè)前肢表現(xiàn)腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁，計(jì)1分；大鼠置于地面，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)阻力降低，計(jì)2分；將大鼠放置在地面上，圍繞手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)3分；無(wú)法自主活動(dòng)，計(jì)4分。分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明大鼠神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。

1.5 TTC染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積大鼠頸總動(dòng)脈取血后，斷頭取腦，沿冠狀切成5片，厚度為2 mm，將腦組織切片置于2%TTC染液中37℃避光處理30 min，染色后，玫瑰紅色為正常組織，白色為缺血組織。采用計(jì)算機(jī)Image-Pro Plus軟件測(cè)量腦梗死面積和切片厚度，計(jì)算腦梗死體積，腦梗死體積=梗死區(qū)面積/切片厚度，所有切片腦梗死體積之和為腦梗死總體積，計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=腦梗死總體積/大鼠腦組織總體積。

1.6 ELISA法檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中 IL-6、IL-1β和TNF-α水平取各組大鼠腦組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，分離缺血側(cè)海馬組織，置于玻璃勻漿器，加適量生理鹽水配成腦組織勻漿，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白α(nuclear transcription factor-κB inhibitor-α,IκBα)表達(dá)水平采用RIPA裂解液對(duì)各組大鼠缺血側(cè)海馬組織進(jìn)行裂解，12 000 r·min-1提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上樣量，取30 μg蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉稀釋的NF-κB p65和IκBα抗體置于4℃封閉過(guò)夜，5% 脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，其余各組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，但程度不同。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，中和高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和中及高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠行為學(xué)評(píng)分與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分

GroupBehavioral scoreSham operation0Model2.90±0.74Positive control1.60±0.70*△Emodin Low dose2.70±0.67 Medium dose 1.90±0.74*△ High dose1.80±0.79*△

*P<0.05vsmodel group；△P<0.05vslow dose of emodin group.

2.2 各組大鼠腦梗死體積百分比假手術(shù)組大鼠腦組織無(wú)梗死，其余各組大鼠腦組織均出現(xiàn)不同程度壞死。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中及高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比均明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，中和高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠腦梗死體積百分比與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和圖1(插頁(yè)八)。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中及高大黃素劑量組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和中及高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比

GroupPercentage of cerebral infarction volume Sham operation0Model23.40±1.94Positive control11.56±1.39*△Emodin Low dose15.45±1.38* Medium dose13.03±1.44*△ High dose11.82±1.99*△

*P<0.05vsmodel group；△P<0.05vslow dose of emodin group.

表3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平

GroupIL-6IL-1βTNF-αSham operation1.045±0.2451.562±0.3540.458±0.084Model2.872.±0.354*2.645±0.403*1.256±0.256*Positive control1.135±0.175△#1.306±0.312△#0.521±0.102△#Emodin Low dose1.548±0.206△1.635±0.250△0.727±0.093△# Medium dose1.280±0.213△#1.458±0.231△#0.593±0.071△# High dose1.254±0.134△#1.425±0.176△#0.584±0.086△#

*P<0.05vssham operation group；△P<0.05vsmodel group；#P<0.05vslow dose of emodin group.

2.4 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中及高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低、中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量大黃素組比較，中和高劑量大黃素組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IκBα蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖2。

表4 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB表達(dá)水平

GroupNF-κB p65IκBα proteinSham operation0.753±0.0320.653±0.021Model1.310±0.025*0.165±0.023*Positive control0.944±0.024△ 0.473±0.031△Emodin Low dose1.215±0.027△#0.307±0.033△# Medium dose1.136±0.020△#○0.394±0.040△#○ High dose1.082±0.025△#○0.420±0.035△#○

*P<0.05vssham operation group；△P<0.05vsmodel group；#P<0.05vspositive control group;○P<0.05vslow dose of emodin group.

Lane 1: Sham operation group；Lane 2:Model group；Lane 3:Positive control group；Lane 4-6:Low, medium, and high doses of emodin groups.

圖2 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB p65 and IκBα proteins in hippocampus tissue at ischemic side of rats in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

急性缺血性腦卒中的病理生理過(guò)程復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制包括自由基損傷、興奮性氨基酸產(chǎn)生、鈣超載和炎癥反應(yīng)等一系列過(guò)程[13]。其中促炎性因子主要由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌，可加劇神經(jīng)元損傷[14]。因此抑制炎癥反應(yīng)是治療腦缺血的重要策略。本研究采用MCAO法制備局灶性腦缺血大鼠模型，觀察大黃素對(duì)模型大鼠腦缺血的保護(hù)作用，探討其神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

IL-1β是由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成及分泌的細(xì)胞因子，主要分布于腦組織，協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)活化B細(xì)胞和T細(xì)胞，還能通過(guò)誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞黏附[15]。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌功能、介質(zhì)釋放和抗原遞呈等過(guò)程。除此之外，IL-1β和TNF-α還可以通過(guò)激活細(xì)胞分泌細(xì)胞炎性因子，如誘導(dǎo)IL-6的合成。IL-6由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過(guò)程，是急性缺血期腦損傷程度的重要標(biāo)志之一[16]。IL-1β、TNF-α和IL-6對(duì)急性缺血性腦卒中的發(fā)生起重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積百分比均明顯增加，缺血側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，給予低、中和高劑量大黃素和地塞米松干預(yù)均能減輕腦梗死體積，降低大鼠腦組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提示腦缺血引起海馬組織損傷會(huì)引起炎性因子水平升高，與王喜豐等[18]研究結(jié)果一致，同時(shí)說(shuō)明給予不同劑量大黃素能夠通過(guò)抑制炎性因子的分泌，對(duì)局灶性腦缺血起保護(hù)作用。

NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，造成組織損傷。NF-κB以p65異二聚體形式與其抑制性蛋白IκBα結(jié)合，表現(xiàn)為非活化狀態(tài)。NF-κB能夠促進(jìn)IL-1β和TNF-α炎性細(xì)胞因子表達(dá)，同時(shí)，IL-1β和TNF-α進(jìn)一步活化NF-κB蛋白，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高，IκBα蛋白表達(dá)水平降低；給予不同劑量大黃素干預(yù)后，局灶性腦缺血模型大鼠海馬組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均明顯降低，IκBα蛋白表達(dá)水平升高，提示低、中和高劑量大黃素均能夠抑制NF-κB活性，可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路調(diào)控IL-6、IL-1β和TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)行為損傷癥狀，減少腦梗死面積[20-21]。

綜上所述，大黃素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，降低海馬組織中炎性細(xì)胞因子水平，減輕腦組織炎癥反應(yīng)，對(duì)局灶性腦缺血有神經(jīng)保護(hù)作用，為大黃素應(yīng)用于腦缺血的治療提供了依據(jù)。