三七總皂苷對慢性心力衰竭大鼠心功能的改善作用及其機制

高瑞敏，康玲玲

(河北醫(yī)科大學附屬唐山工人醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北 唐山 063000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各種心血管疾病的終末階段，是一種復(fù)雜性、系統(tǒng)性的臨床綜合征，具有容易復(fù)發(fā)和預(yù)后差的特點[1]。目前，臨床上對CHF的治療主要采用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、醛固酮拮抗劑和β-受體阻滯劑等，但不能從根本上解決其發(fā)病率高和死亡率高的狀況[2-3]。近年來，中藥在防治CHF方面展現(xiàn)出安全、高效和不良反應(yīng)少的優(yōu)勢。三七總皂苷是中藥三七的主要成分之一，具有改善心肌缺血再灌注損傷、增加血液循環(huán)和改善血流供應(yīng)的作用[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase, JNK)和p38激酶3個亞族，對心肌保護發(fā)揮重要作用[6]。目前國內(nèi)關(guān)于三七總皂苷應(yīng)用于CHF治療效果的研究[7-8]表明：三七總皂苷能有效改善CHF患者心功能，降低細胞凋亡相關(guān)因子水平，但對其作用機制研究甚少。本研究旨在觀察三七總皂苷對CHF模型大鼠心臟功能的影響，探討其作用機制，為臨床治療CHF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器SPD級SD大鼠75只，體質(zhì)量(220±20) g，購自河北省以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，動物使用許可證號：SYXK(冀)2015-0064。自由飲水攝食，環(huán)境溫度(22±3)℃，相對濕度(50±5) %，12 h/12 h晝夜周期照明。卡托普利片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(國藥準字H31022986)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司，二奎啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購自北京泰格美科技有限公司，ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)和白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。色多普勒超聲診斷儀(型號Vivid i，美國GE公司)，光學顯微鏡(型號Eclipse 50i，日本Nikon公司)，電泳儀 (型號GP200，托摩根生物科技有限公司)，酶標儀(型號Multiskan FC，美國賽默飛世爾公司)。

1.2 模型制備和分組[9]大鼠于造模前采用多普勒超聲檢查心臟，取心功能正常大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)麻醉，于左上腹切開上皮，暴露腹并結(jié)扎腹主動脈，使腹主動脈管腔形成50%環(huán)形縮窄，縫合切口，術(shù)后每天肌肉注射40萬U青霉素，連續(xù)3 d。造模4周后，進行心臟彩超檢測，以左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)<45% 視為CHF大鼠模型制備成功。排除死亡大鼠后，共60只大鼠造模成功，將60只造模成功大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、低、中和高劑量三七總皂苷組，每組12只。另取12只大鼠作為假手術(shù)組。陽性對照組大鼠灌胃給予卡托普利(100 mg·kg-1)[10]；低、中和高劑量三七總皂苷組大鼠分別灌胃給予三七總皂苷(10、30和60 mg·kg-1)[11]; 假手術(shù)組和模型組大鼠分別灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥8周，假手術(shù)組大鼠開腹后不結(jié)扎腹主動脈。觀察各組大鼠一般情況。

1.3 彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠心臟功能指標末次給藥后，麻醉大鼠，仰臥固定于鼠板，采用彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室后壁舒張期厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness, LVPWD)和LVEF，連續(xù)檢測3個心臟周期求得平均值。隨后行右頸總動脈插管，將導管從右頸總動脈插入，逆向進入左心室，末端連接血壓換能器，測定心輸出量(cardiacoutput, CO)、左室舒張壓(left ventricular diastolic pressure, LVEDP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressuer, LVSP)、左心室壓力最大上升速率(maximal rate of increase of left ventricular pressure, +dp/dt max)/左心室壓力最大下降速率(maximal rate of decrease of left ventricular pressure, -dp/dt max)，連續(xù)檢測3次取平均值。

1.4 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)取出固定心肌組織，常規(guī)制備石蠟切片(5 μm) ，經(jīng)烘烤、二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，HE染色，樹脂封片后，置于光學顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡率將切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫封閉10 min，加入蛋白酶37℃孵育20 min，山羊血清封閉20 min，加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。加入5%辣根過氧化酶47℃孵育30 min，PBS清洗3次，二氨基聯(lián)苯按(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察，隨機取5個視野記錄陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白表達水平取各組大鼠心肌組織，加入600 μL RIPA裂解液，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，提取組織總蛋白，10% SDS-PAGE分離等量蛋白后進行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5% 脫脂奶粉封閉，添加抗ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38和 β-actin抗體(1∶500)，4 ℃ 過夜孵育，加入二抗(1∶5 000)，室溫搖床孵育 1 h，采用ECL發(fā)光顯影后置于凝膠成像儀內(nèi)觀察各蛋白表達，采用Image J軟件對各蛋白條帶進行量化分析。以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平取大鼠腹主動脈血，室溫下放置15 min后，2 500 r·min-1離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況造模結(jié)束后，模型組大鼠死亡2只，死亡原因為CHF發(fā)作，假手術(shù)組、陽性對照組和低、中及高劑量三七總皂苷組大鼠未出現(xiàn)死亡。

2.2 各組大鼠心臟功能指標與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、LVEDP和-dp/dt max明顯升高(P<0.05)，LVEF、CO、LVSP和+dp/dt max明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量三七總皂苷組大鼠LVEDD、LVESD、LVPWD、LVEDP和-dp/dt max明顯降低(P<0.05)，LVEF、CO、LVSP和+dp/dt max明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟功能指標

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，細胞核大小一致。模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)模糊，心肌細胞肥大，肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)肌絲溶解、斷裂，細胞核出現(xiàn)核碎裂、核溶解，可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量三七總皂苷組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)較完整，心肌細胞肥大減輕，心肌纖維排列較疏松，肌絲部分斷裂，可見部分炎性細胞浸潤。見圖1(插頁七)。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率假手術(shù)組未見陽性心肌細胞，模型組可見大量陽性心肌細胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量三七總皂苷組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖2(插頁八)。

2.5 各組大鼠心肌組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白表達水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量組大鼠胃癌組織中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。各組大鼠胃癌組織中ERK、JNK和p-38蛋白表達水平比較無明顯差異。見表2和圖3。

2.6 各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α和 IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組、低、中及高劑三七總皂苷量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠心肌組織中p-ERK p-JNK和p-p38蛋白表達水平

Groupnp-ERKp-JNKp-p38Sham operation120.39±0.110.45±0.050.61±0.05Model101.61±0.23*1.45±0.25*1.78±0.21*Positive control120.98±0.19△0.84±0.13△0.85±0.09△Panax notoginseng saponins Low dose121.33±0.25△1.24±0.15△1.32±0.11△ Medium dose121.25±0.17△1.20±0.17△1.05±0.08△ High dose121.08±0.20△1.01±0.16△0.76±0.10△

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

Lane 1:Sham operation group；Lane 2: Model group; Lane 3-5: Low, medium and high doses of panax notoginseng saponins groups；Lane 6: Positive control group.

圖3 各組大鼠心肌組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, and p-p38 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

引起CHF發(fā)生的基本機制是心肌重塑，而心肌細胞凋亡是CHF從代償走向失代償?shù)霓D(zhuǎn)折點。研究[12]表明:MAPKs信號通路激活是心肌細胞肥大和由收縮型向合成型演變的最后通路，參與心肌重構(gòu)的過程。此外，參與心肌重塑的因素還有TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞炎性因子[13]。MAPKs是細胞中的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，其作用是將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及其核內(nèi)，從而引起細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等反應(yīng)[14]。MAPKs是心肌細胞增殖、分化、凋亡、壞死、細胞骨架重組和間質(zhì)纖維化等多條通路的匯聚點[15]。ERK1/2、JNK和p38為MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路中最重要的3條亞通路。其中ERKl/2信號通路是經(jīng)典MAPKs信號轉(zhuǎn)導途徑，參與細胞的生長、發(fā)育、增殖和分化等多種病理生理過程，是多種促增殖信號轉(zhuǎn)導途徑的共同通路。發(fā)生CHF時，在壓力負荷增加的情況下，心臟牽張刺激、生長因子等與特異G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活蛋白激酶C，啟動Ras-Raf-MEK-ERK途徑，激活ERK1/2及其介導的信號通路，參與CHF的發(fā)展[16]。JNK信號傳導通路參與介導心功能不全期代償性心肌肥厚，在心力衰竭期具有抗心肌細胞調(diào)亡作用[17]。p38途徑被認為是與細胞增殖、分化或凋亡調(diào)控密切相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，是細胞外信號引起細胞增殖、分化等核反應(yīng)的共同途徑或匯聚點。研究[18]顯示：p38信號轉(zhuǎn)導通路被激活可能導致細胞在發(fā)生肥大過程后出現(xiàn)凋亡，在心力衰竭期具有促進心肌細胞凋亡作用。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞肥大、壞死，心肌纖維排列不規(guī)則，可見大量炎性細胞浸潤，出現(xiàn)大量心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為細胞質(zhì)致密化、收縮變小，細胞片段化形成細胞凋亡體，心肌組織中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表達水平明顯增加；與模型組比較，陽性對照組和低、中及高劑量三七總皂苷組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)明顯減少，心肌細胞凋亡率明顯降低，心肌組織中p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表達水平明顯降低，以高劑量三七總皂苷組效果更明顯，上述結(jié)果說明磷酸化是ERK、JNK和p38在心肌細胞內(nèi)的蛋白后修飾方式，p-ERK、p-JNK及p-p38是參與相關(guān)生物學活動的重要形式，三七總皂苷可對ERK、JNK和p38的磷酸化產(chǎn)生抑制作用。

TNF-α是由激活的單核-巨噬細胞分泌的細胞因子，在機體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中作為重要遞質(zhì)，抑制心肌收縮力，導致左心室功能降低，產(chǎn)生急性水腫，血清TNF-α水平可作為判斷心功能級別的一個重要指標[19]。TNF-α可促進IL-6表達，這些細胞因子通過增強組織細胞對TNF-α的敏感性，使TNF-α的負性肌力作用進一步加強[20]。IL-6作為一種多功能的細胞因子，主要有免疫調(diào)節(jié)、刺激造血和應(yīng)激反應(yīng)等作用[21]。錢留軍[22]的研究表明：CHF患者血清中IL-6水平隨病情加重而升高。本研究結(jié)果表明：三七總皂苷對CHF大鼠血清炎性細胞因子TNF-α和血清IL-6具有明顯的抑制作用，以高劑量三七總皂苷的抑制效果最為顯著。

綜上所述，三七總皂苷可能通過下調(diào)CHF模型大鼠心肌組織中ERK、JNK和p38蛋白磷酸化，抑制血清炎性因子分泌，發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡的作用。