搭載紫杉醇脂質(zhì)體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物靜電紡絲膜對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

孔維健，方紅娟，潘 肅，楊利麗，鄭 爽，齊治平，付 川，鐘 磊

(1. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2. 吉林省一汽總醫(yī)院電診科，吉林 長(zhǎng)春 130011)

近年來(lái)，如何促進(jìn)脊髓損傷后肢體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的恢復(fù)受到了較為廣泛的關(guān)注。正常脊髓中含有大量功能神經(jīng)元、神經(jīng)支持細(xì)胞和具有分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，脊髓損傷后，損傷部位及其下方部位神經(jīng)元大量壞死及萎縮，瘢痕細(xì)胞及炎癥細(xì)胞大量增生[1]。脊髓損傷后損傷部位的局部炎性微環(huán)境不利于神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)向神經(jīng)元分化，大多數(shù)NSCs均在炎性微環(huán)境誘導(dǎo)下分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和其他支持細(xì)胞[2]，替代了正常的脊髓組織，阻礙了神經(jīng)信號(hào)通路的重建。因此誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化在脊髓損傷恢復(fù)研究中具有重要意義。紫杉醇是一種臨床一線抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于乳腺癌和卵巢癌等疾病的治療。高濃度紫杉醇能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞中微管蛋白聚合，穩(wěn)定微管，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂和增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。目前有研究[4- 5]顯示：紫杉醇和紫杉醇類似物如埃坡霉素D對(duì)于神經(jīng)退行性病變?nèi)绨柶澓ＤY有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是低濃度紫杉醇能夠阻止軸突回縮球的形成，刺激神經(jīng)突延伸。生物可降解材料在組織工程學(xué)中具有廣泛應(yīng)用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)作為一種高分子生物材料，具有降解速率可調(diào)和細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程學(xué)研究中具有很大的應(yīng)用潛力[6]。但PLGA材料的疏水表面不利于細(xì)胞在其表面黏附生長(zhǎng)[7]。利用靜電紡絲技術(shù)可以使PLGA材料表面呈纖維樣交錯(cuò)分布，有利于細(xì)胞在其表面黏附生長(zhǎng)[8]。

目前關(guān)于紫杉醇脂質(zhì)體的研究主要集中在其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果方面，尚無(wú)關(guān)于紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)NSCs增殖和分化直接影響的研究。PLGA作為一種具有良好應(yīng)用前景的高分子材料，已經(jīng)廣泛用于表皮、脊髓和骨組織等組織工程修復(fù)研究[9-11]。本研究將紫杉醇和PLGA混合，利用靜電紡絲技術(shù)制成靜電紡絲膜，將NSCs在不同種類靜電紡絲膜上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同濃度紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)NSCs增殖和分化的影響，為脊髓損傷的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器2只孕14 d雌性SD大鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，體質(zhì)量350～400 g，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。PLGA(相對(duì)分子質(zhì)量為40 000，長(zhǎng)春圣博瑪生物材料有限公司)，紫杉醇脂質(zhì)體(南京綠葉思科藥業(yè)有限公司)，六氟異丙醇(德國(guó)Merck公司)，免疫熒光染色一抗Nestin(美國(guó)Abcam公司)，F(xiàn)luor 488綠色熒光二抗(A0428，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(海克隆公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)(美國(guó)Peprotech公司)，MTT試劑盒(型號(hào)C0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。電壓調(diào)節(jié)直流電源(型號(hào)DW-P203-1ACFD，天津東文公司)，掃描電鏡(SEM，荷蘭Philips公司)，激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)FV3000，日本Olympus公司)。

1.2 搭載紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜的制備靜電紡絲膜的制備方法參照文獻(xiàn)[12]。將100 mg PLGA溶于5 mL六氟異丙醇中，向溶液中加入10 μL不同濃度紫杉醇脂質(zhì)體，以達(dá)到相應(yīng)藥物濃度(1、5和10 μg·L-1),即為1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組。將所得混合溶液移至10 mL注射器中，靜電紡絲膜的制備采用電壓調(diào)節(jié)直流電源，施加電壓為20 kV，進(jìn)給速率為1 mL·h-1，發(fā)射板和收集板之間距離為10 cm。從收集板上獲得含有不同濃度紫杉醇脂質(zhì)體的PLGA靜電紡絲膜。采用相同方法制備不含藥物的純PLGA靜電紡絲膜，作為純PLGA靜電紡絲膜組。

1.3 紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜纖維直徑測(cè)定利用SEM對(duì)所制得的靜電紡絲膜進(jìn)行檢測(cè)，觀察所制得材料的微觀結(jié)構(gòu)和纖維直徑，并測(cè)量各組靜電紡絲膜的纖維直徑。

1.4 NSCs分離培養(yǎng)和鑒定從孕14 d雌性SD大鼠腹中胎鼠的大腦皮層中分離出NSCs，在T25培養(yǎng)瓶中以50 000 cm-3的密度進(jìn)行分離和純化，并在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有5%胎牛血清、2% B27、20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF和100 μg·L-1青霉素-鏈霉素雙抗。培養(yǎng)的原代NSCs每4 d傳代1次，培養(yǎng)基每2 d更換1次。傳代次數(shù)在第2～5代NSCs被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。采用免疫熒光染色對(duì)所分離得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)在細(xì)胞板中的NSCs采用PBS洗滌3次，每次5 min。向培養(yǎng)板中加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后吸去上清加入10%血清，室溫下封閉1 h。吸去上清后向每孔中分別加入50 μL一抗，37℃孵育1 h。PBS洗滌后吸去上清液，向孔中加入50 μL熒光二抗(Fluor488)，室溫下孵育1 h后吸去上清，PBS洗滌后滴加DAPI，吸去染劑并經(jīng)PBS洗滌后封片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在不同抗體標(biāo)記下的染色結(jié)果。

1.5 MTT法檢測(cè)各組NSCs增殖活性將細(xì)胞密度為30 000 cm-3的NSCs分別加入鋪有不同靜電紡絲膜的細(xì)胞板中(1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜和純PLGA靜電紡絲膜)，在培養(yǎng)第1、4和7天采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟按MTT試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，向每孔中加入50 μL MTT溶液，37℃下孵育4 h。將培養(yǎng)液吸出后離心吸去上清液，各孔中加入100 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min后使結(jié)晶物充分溶解。將樣品在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各樣本吸光度(A)值。以A值代表各組NSCs增殖水平。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達(dá)水平將在各組靜電紡絲膜上生長(zhǎng)的NSCs培養(yǎng)7 d后，利用PrimeScriptTM試劑盒對(duì)NSCs中RNA進(jìn)行分離和純化。Tuj-1和GFAP分別代表神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，GADPH作為內(nèi)參校正基因。各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算，ΔCt值=目的基因Ct值-管家基因Ct值；ΔΔCt=材料組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)-對(duì)照組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)。RT-PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1 紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜纖維直徑紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜呈白色，質(zhì)地柔軟，表面呈網(wǎng)格狀，紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜形態(tài)見(jiàn)圖1。SEM結(jié)果顯示:微觀水平下各組靜電紡絲膜均呈纖維狀相互交錯(cuò)，純PLGA靜電紡絲膜組靜電紡絲膜平均纖維直徑為1 087 nm，混有紫杉醇脂質(zhì)體的PLGA靜電紡絲膜纖維直徑與純PLGA靜電紡絲膜比較略有減小。1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組靜電紡絲膜纖維直徑分別為1 015 、990 和917 nm，各組纖維直徑比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SEM下紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜的超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖1 紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜形態(tài)表現(xiàn)

Fig.1 Morphology of paclitaxel-liposome PLGA electrospinning membrane

2.2 免疫熒光染色鑒定NSCs分離和純化免疫熒光染色結(jié)果顯示：藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為Nestin蛋白表達(dá)。培養(yǎng)得到的NSCs呈球狀聚集，且多數(shù)細(xì)胞球中均有Nestin表達(dá)，說(shuō)明通過(guò)分離純化得到的細(xì)胞均為NSCs，能夠滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需求。見(jiàn)圖3(插頁(yè)六)。

圖2 SEM下紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜的超微結(jié)構(gòu)(Bar=10 μm)

Fig.2 Ultrastructure of paclitaxel-liposome PLGA electrospinning membrane under SEM(Bar=10 μm)

2.3 各組NSCs增殖活性第1天各組NSCs增殖活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第4天和第7天1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性與第1天比較有所升高，且高于對(duì)應(yīng)天數(shù)的純PLGA組,但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第4天5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性高于其他3組(P<0.05)。第7天各組NSCs增殖活性較第4天均有升高，5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性在所有組中仍最高，高于純PLGA靜電紡絲膜組(P<0.05)，但與1和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性的差距有所減小。見(jiàn)表2。

表2 各組NSCs增殖活性

GroupProliferation level of NSCs (A value)(t/d) 1 4 7 PLGA electrospinning membrane0.246 7±0.020 80.760 5±0.134 51.403 3±0.181 5PLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.260 0±0.062 40.956 6±0.145 71.733 3±0.187 4PLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.270 1±0.045 81.580 2±0.124 9*△2.180 0±0.108 2*PLGA electrospinning membrane carrying 10 μg·L-1 paclitaxel-liposomes0.256 7±0.061 10.901 5±0.174 4#1.506 7±0.132 0

*P<0.05vsPLGA electrospinning membrane group;△P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes group;#P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes group.

2.4 各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達(dá)水平與純PLGA靜電紡絲膜組比較， 1、5和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達(dá)水平升高。1和10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達(dá)水平與純PLGA靜電紡絲膜組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達(dá)水平高于其他3組(P<0.05)。隨著靜電紡絲膜中紫杉醇脂質(zhì)體濃度的增加，NSCs中GFAP mRNA表達(dá)水平逐漸減小，純PLGA靜電紡絲膜組NSCs中GFAP mRNA表達(dá)水平最高，10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中GFAP mRNA表達(dá)水平最低。見(jiàn)表3。

表3 各組NSCs中Tuj-1和GFAP mRNA表達(dá)水平

Group Tuj-1 mRNAGFAP mRNAPLGA electrospinning membrane1.000±0.0001.000±0.000PLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.148±0.1270.935±0.170PLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.764±0.189*△0.677±0.131*PLGA electrospinning membrane carrying 10 μg·L-1paclitaxel-liposomes1.228±0.176#0.403±0.123*△#

*P<0.05 compared with PLGA electrospinning membrane group;△P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 1 μg·L-1paclitaxel-liposomes;#P<0.05vsPLGA electrospinning membrane carrying 5 μg·L-1paclitaxel-liposomes.

3 討 論

NSCs在脊髓損傷和神經(jīng)損傷后再生中具有重要作用，NSCs具有分化為功能性神經(jīng)元和重建受損神經(jīng)傳導(dǎo)通路的潛能。但神經(jīng)損傷后受損部位纖維瘢痕組織增生，形成物理屏障阻礙了損傷部位兩端神經(jīng)的重新連接[13]。生物材料為結(jié)構(gòu)性損傷中神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)具有積極影響[14]。此外，損傷后局部炎性微環(huán)境促進(jìn)NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，而不是分化為神經(jīng)元[15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠形成膠質(zhì)瘢痕，進(jìn)一步阻礙了損傷部位兩端的功能重建[16]。因此，促進(jìn)NSCs增殖并向神經(jīng)元分化對(duì)神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)具有積極意義。有研究[4]顯示：低濃度紫杉醇能夠阻止軸突回縮球的形成，刺激神經(jīng)突延伸，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，但其對(duì)NSCs的影響仍不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建含有不同濃度紫杉醇脂質(zhì)體PLGA的靜電紡絲膜，將NSCs在其表面培養(yǎng)，并對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了探討。

靜電紡絲技術(shù)制備的材料表面呈網(wǎng)格狀，SEM結(jié)果顯示靜電紡絲膜表面PLGA纖維相互交錯(cuò)，有研究[17]顯示：這一粗糙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞在靜電紡絲膜表面黏附生長(zhǎng)。與口服或靜脈給藥方式比較，通過(guò)生物工程技術(shù)制備載有紫杉醇的靜電紡絲膜能夠更好地對(duì)藥物濃度加以控制，使藥物以較低劑量直接作用于損傷部位，避免了全身用藥帶來(lái)的不良反應(yīng)。本研究利用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)從胎鼠腦組織中提取出的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞中均有NSCs所特有的Nestin蛋白表達(dá)，說(shuō)明所提取的用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞基本均為NSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組NSCs增殖活性均提高。隨著藥物濃度的增加，5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs增殖活性明顯高于1 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組，說(shuō)明在較低濃度范圍內(nèi)，紫杉醇脂質(zhì)體對(duì)NSCs的增殖具有促進(jìn)作用；10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組中NSCs增殖活性低于5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組，有研究[18]推測(cè)：這可能是由于較高濃度紫杉醇對(duì)細(xì)胞分裂具有抑制作用。

本研究結(jié)果顯示：在5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中，代表神經(jīng)元生長(zhǎng)情況的Tuj-1 mRNA表達(dá)水平最高，這說(shuō)明5 μg·L-1紫杉醇能夠促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元；而10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組NSCs中Tuj-1 mRNA表達(dá)水平較5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組有所減少，這可能是由于較高濃度紫杉醇抑制了NSCs增殖。GFAP代表星形膠質(zhì)細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)。隨著藥物濃度的增加，GFAP mRNA表達(dá)水平逐漸減少，10 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體組NSCs中GFAP mRNA表達(dá)水平最低，并且明顯低于1和5 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體PLGA靜電紡絲膜組。這可能是因?yàn)?0 μg·L-1紫杉醇脂質(zhì)體不僅抑制了NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，還抑制了NSCs的增殖，使得能夠分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的NSCs數(shù)量進(jìn)一步減少。上述結(jié)果說(shuō)明：中等濃度紫杉醇對(duì)于NSCs增殖具有明顯促進(jìn)作用，并且能夠誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化，抑制NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

神經(jīng)元再生是脊髓損傷中神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)，新生神經(jīng)元可以進(jìn)一步分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或感覺(jué)神經(jīng)元，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，在一定程度上恢復(fù)原有的神經(jīng)功能[19]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一種常見(jiàn)的支持細(xì)胞，在正常組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞包裹在神經(jīng)元周圍，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[20]。但在損傷后，損傷區(qū)域的炎性微環(huán)境刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)形成屏障，阻礙神經(jīng)元重建神經(jīng)信號(hào)通路，對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生不利影響[21]。因此，促進(jìn)神經(jīng)元形成并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本研究利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了載有紫杉醇脂質(zhì)體的PLGA靜電紡絲膜，將從動(dòng)物體內(nèi)提取的NSCs培養(yǎng)在含有不同濃度藥物的靜電紡絲膜上，并對(duì)其增殖分化情況進(jìn)行了檢測(cè)。本研究結(jié)果表明:5 μg·L-1紫杉醇能夠促進(jìn)NSCs增殖，并誘導(dǎo)NSCs向有利于神經(jīng)功能恢復(fù)的方向進(jìn)行分化，應(yīng)用中等濃度紫杉醇治療脊髓損傷具有一定可行性，搭載中等濃度紫杉醇脂質(zhì)體的PLGA靜電紡絲膜在治療脊髓損傷中具有潛在的應(yīng)用前景。