離子通道電流虛擬仿真實(shí)驗(yàn)在生理教學(xué)中的應(yīng)用

楊 煜, 呂文偉, 呂若谷, 安 鋼

(1. 吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 吉林 長春 130021；2. 吉林大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 吉林 長春 130021)

離子通道是細(xì)胞膜上的一類特殊跨膜蛋白質(zhì)構(gòu)成的門樣通道。這些蛋白質(zhì)的中央形成的孔道有利于離子穿過,是無機(jī)離子進(jìn)出細(xì)胞的重要物質(zhì)載體,對維持細(xì)胞內(nèi)離子濃度和配比平衡及機(jī)體代謝穩(wěn)定起重要作用。離子運(yùn)輸具有選擇性和開關(guān)性(可控制性)[1]。離子通道電流測量通常依靠昂貴的膜片鉗-離子通道測量平臺才能實(shí)現(xiàn),而我校教學(xué)實(shí)驗(yàn)室不具備進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的設(shè)備條件。為此,采用計(jì)算機(jī)仿真技術(shù)模擬實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境,研制了離子通道電流虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)備,在無膜片鉗-離子通道測量平臺設(shè)備的情況下開設(shè)了生理學(xué)測量離子單通道電流的教學(xué)實(shí)驗(yàn),建立新型實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式[2]。

1 離子通道電流虛擬仿真儀器特點(diǎn)

離子通道電流虛擬仿真實(shí)驗(yàn)儀器主要應(yīng)用于生物電生理實(shí)驗(yàn)教學(xué),可用于心臟、肝臟、神經(jīng)、肌肉等多臟器的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[3-9],對學(xué)生掌握抽象的離子通道蛋白的電生理特性及理解電生理理論起到促進(jìn)作用。通過該實(shí)驗(yàn),可以拓展對離子通道電流儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和應(yīng)用[10-12],培養(yǎng)學(xué)生在離子通道蛋白的電生理特性方面的科研能力。

生理教學(xué)的靜息電位和動作電位以及神經(jīng)調(diào)節(jié)等生理過程都是以離子通道蛋白分子的電生理特性為基礎(chǔ)的。離子通道電流虛擬仿真實(shí)驗(yàn)儀器能夠模擬膜片鉗位實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境,以較低的成本為本科生開設(shè)離子單通道電流仿真實(shí)驗(yàn)[13]。該儀器已申報國家專利(專利號:ZL 201420248873x)。

2 離子通道電流虛擬仿真儀器功能

離子通道電流仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器的功能可分為封接實(shí)驗(yàn)、全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)、膜片鉗實(shí)驗(yàn)、全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析等5部分。

(1) 封接實(shí)驗(yàn)。所謂封接就是使細(xì)胞與測量電極緊密接觸。調(diào)節(jié)測量電極，使通過細(xì)胞孵育液的電流接近0,當(dāng)測量電極通過細(xì)胞時檢測的電流就是離子通道蛋白的電流。由于細(xì)胞的測量電極很小,很難通過感官判斷封接的接觸緊密程度；而通過儀器產(chǎn)生電壓和電流,測量電極接收回路電流,就可測量封接電阻，從而監(jiān)視接觸緊密程度。封接電阻越大,則緊密接觸程度則越高。當(dāng)封接電阻值達(dá)到1 GΩ時便可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中,封接操作是實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。通過使用離子通道電流仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)備的負(fù)壓注射器,可以觀察模擬封接過程的電阻變化。學(xué)生親自動手進(jìn)行封接實(shí)驗(yàn),從而掌握電壓鉗技術(shù)、膜片鉗技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作技能[14]。

(2) 全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)。通過軟件選單選擇全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)界面,輸入最小鉗制電壓、最大鉗制電壓、鉗制電壓變化的間隔等實(shí)驗(yàn)操作的參數(shù),然后用鼠標(biāo)單擊“開始實(shí)驗(yàn)”按鈕,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。學(xué)生直接觀察到逼真的離子通道蛋白在不同的鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線(見圖1)。

圖1 全細(xì)胞離子通道電流測試曲線

(3) 全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。在全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通過軟件選單選項(xiàng)進(jìn)入全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)分析界面(見圖2)。首先選擇實(shí)驗(yàn)分析的時間段,然后用鼠標(biāo)單擊“電流電壓曲線”按鈕。針對不同鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線進(jìn)行分析和處理,從而可以得到電壓-電流分析曲線,在電壓-電流分析曲線上能直接看到細(xì)胞的某種離子通道蛋白的電壓依賴特性。

圖2 全細(xì)胞離子通道電流電壓分析曲線

(4) 膜片鉗實(shí)驗(yàn)。選擇全細(xì)胞鉗實(shí)驗(yàn)界面，輸入采樣頻率、采樣保持電壓、采樣屏數(shù)等實(shí)驗(yàn)操作參數(shù),然后用鼠標(biāo)單擊“開始”按鈕,記錄和直接觀察到單個離子通道在特定鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線(見圖3)。

圖3 單離子通道電流開放和關(guān)閉測試曲線

(5) 膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。在膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,選擇膜片鉗實(shí)驗(yàn)分析界面。輸入實(shí)驗(yàn)分析相應(yīng)的閾值參數(shù),以便計(jì)算機(jī)自動識別通道的開放和關(guān)閉。單擊開放時間統(tǒng)計(jì)按鈕,將產(chǎn)生通道開放時間統(tǒng)計(jì)曲線；單擊關(guān)閉時間統(tǒng)計(jì)按鈕,將產(chǎn)生通道關(guān)閉時間統(tǒng)計(jì)曲線。對特定鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線進(jìn)行分析和處理,可以得到單離子通道蛋白開放和關(guān)閉特性的統(tǒng)計(jì)分析曲線,從而直觀地看到細(xì)胞的某種離子通道蛋白的開關(guān)特性(見圖4)。

圖4 單離子通道電流開放時間統(tǒng)計(jì)曲線

3 實(shí)驗(yàn)操作

(1) 進(jìn)行電極制備,用電極拉制器拉制幾兆歐的電極,沖灌電極液。取蛙卵細(xì)胞并放入帶有孵育液的平皿中待用。

(2) 將準(zhǔn)備好的電極小心裝入電極支架固定。在顯微鏡下找到平皿中的細(xì)胞,將電極對準(zhǔn)細(xì)胞,在顯微鏡下繼續(xù)小心放下電極,使電極與細(xì)胞接觸。

(3) 小心、緩慢地抽吸連有電極的注射器,給細(xì)胞加負(fù)壓,實(shí)現(xiàn)封接過程。

(4) 在封接過程中,由于注射器帶動封接電位器滑動引起電阻的變化,通過封接電阻檢測電路檢測電阻的變化。

(5) 將檢測電阻的變化通過A/D轉(zhuǎn)換電路經(jīng)過數(shù)字轉(zhuǎn)化后輸入中央控制器。

(6) 中央控制器通過微機(jī)通信接口電路將檢測電阻的值輸入微機(jī),然后在軟件系統(tǒng)控制下在微機(jī)屏幕上顯示。一邊加負(fù)壓,一邊觀察,在微機(jī)的軟件界面監(jiān)控封接過程。如果封接電阻值達(dá)到1 GΩ,則表示封接成功。

(7) 封接成功后,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)記錄過程。微機(jī)顯示仿真實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)并且通過分析軟件來完成仿真實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。

4 結(jié)語

通過對離子通道電流虛擬仿真實(shí)驗(yàn)儀器的實(shí)驗(yàn)操作過程,學(xué)生能夠觀察到離子通道蛋白分子的電流記錄曲線,較容易掌握離子通道的選擇性。通過分析處理得到電壓-電流分析曲線和通道關(guān)閉時間的統(tǒng)計(jì)曲線,較易理解離子通道的開放性,從而啟發(fā)學(xué)生對離子通道蛋白的開-關(guān)特性和電壓依賴特性的理解。結(jié)合仿真實(shí)驗(yàn)曲線分析腦部缺血、缺氧和再灌注損傷情況下的生理改變,能夠更好地理解鈉通道、鈣通道細(xì)胞內(nèi)外的跨膜離子濃度變化導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞急性滲透性腫脹的原因,為臨床治療急性缺血性腦卒中的藥物選擇提供理論依據(jù)。結(jié)合介紹有關(guān)離子通道的最前沿科研論文并組織課堂討論[14-16],可以促進(jìn)學(xué)生對生理學(xué)理論知識的應(yīng)用,極大地提升了實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果。

References)

[1] 李俊敏,劉朝暉,尚忠林.細(xì)胞膜上的離子通道[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,29(5):519-522.

[2] 陳萍,周會超,周虛.構(gòu)建虛擬仿真實(shí)驗(yàn)平臺,探索創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2011,28(3):277-280.

[3] 黃先菊,郭蓮軍.大鼠皮層及海馬腦片體外培養(yǎng)影響因素的研究[J].中國老年學(xué)雜志,2008,28(8):760-762.

[4] 李妙齡,曾曉榮.膜片鉗技術(shù)在心血管及藥理學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中國心血管病雜志,2007,5(9):698-700.

[5] 馬琳琳,傅松濱，Bretag A H.CLC氯離子通道結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].國際遺傳學(xué)雜志,2008,31(1):36-40,52.

[6] 沈文浩,熊恩慶,宋波學(xué),等.成年豚鼠膀胱ICCs細(xì)胞起搏電流的鑒定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,30(7):567-569.

[7] 蔡倫,韋理萍.炎癥在慢性癲癇發(fā)作中的作用[J].腦與神經(jīng)病雜志,2017,25(4),259-261.

[8] 于耀清,陳軍.電壓門控性鉀鈣鈉離子通道的結(jié)構(gòu)及分類[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2005,4(5):515-520.

[9] 丁寧,李根林,王景昭.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在視網(wǎng)膜神經(jīng)元電壓門控離子通道研究中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)(眼科學(xué)分冊),2002,26(4):236-239.

[10] 王玨.肌電圖在司法鑒定中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代電生理學(xué)雜志,2008,15(3):165-166,172.

[11] 王文偉,祁小燕,張雪梅.一種有效記錄成骨細(xì)胞L型鈣通道電流的穿孔全細(xì)胞膜片鉗方法[J].中國病理生理雜志,2015,31(6):1150-1152.

[12] 范茁,吳振強(qiáng).大鼠心室肌細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究生實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2015,34(2):206-208,217.

[13] 閆巖,劉學(xué)宗,鈕偉真.細(xì)胞離子通道電流實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一種分析方法[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,22(3):257-258.

[14] 婁雪林,周專,康華光.單通道和全細(xì)胞記錄技術(shù)[J].中國醫(yī)療器械雜志,2000,24(4):221-226.

[15] 劉宇,孟然.離子通道與腦缺血-再灌注損傷關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國腦血管雜志,2009,6(10):553-557.

[16] 吳金華,馬慧萍,孟萍.腦缺血和再灌注損傷與防治機(jī)制的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2014,32(6):401-404,447.