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    冠心益壽丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2018-01-19 11:45:12陳銘勇顧偉李順清
    云南中醫(yī)中藥雜志 2018年11期
    關(guān)鍵詞:含量測定

    陳銘勇 顧偉 李順清

    摘要:目的 建立冠心益壽丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對方中丹參、白芍、葛根進(jìn)行定性鑒別,采用HPLC法對丹參酮ⅡA、葛根素的含量進(jìn)行測定。結(jié)果 該制劑中的丹參、白芍、葛根均可用TLC法檢出,且空白無干擾;含量測定的陰性對照無干擾,且穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性等指標(biāo)均符合含量測定的要求。結(jié)論 本實驗方法操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,可作為冠心益壽丸的質(zhì)量檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

    關(guān)鍵詞:冠心益壽丸;薄層鑒別;含量測定

    中圖分類號:R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1007-2349(2018)11-0074-05

    冠心益壽丸為本院臨床應(yīng)用20余年的院內(nèi)制劑,主要由丹參、白芍、葛根等十余味藥材組成,以益氣化瘀為主,對治療冠脈介入術(shù)后再狹窄具有顯著療效[1]。為將其更好地開發(fā)應(yīng)用,前期研究已將冠心益壽丸由大蜜丸改進(jìn)為體積更小、攜帶服用更加方便的濃縮丸并對其提取工藝進(jìn)行了研究[2]。但前期研究并未建立冠心益壽丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為了有效控制其內(nèi)在質(zhì)量,本文建立了丹參、白芍、葛根的薄層色譜鑒別方法,并采用高效液相色譜法對丹參酮ⅡA、葛根素的含量進(jìn)行測定。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 高效液相色譜儀(包括四元梯度泵,自動進(jìn)樣器,二極管陣列檢測器,柱溫箱,型號:UltiMate3000,DIONEX,U.S);色譜柱C18(4.6 mm×250 mm,5μm,S/N:0J7U73,Kromat Universil);超聲儀(型號:SK3300LH,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);分析天平(型號:AB265-SMETTLER TOLEDO,Switzerland,0.00001 g)

    1.2 試藥 冠心益壽丸(小試樣品,批號:170501,170502,170601),芍藥苷對照品(美侖生物技術(shù)有限公司,供含量測定用,批號:J0516AS),丹參酮ⅡA對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,供含量測定用,批號:PRF7052541);葛根素(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,供含量測定用,批號:16032508)。甲醇、乙腈為色譜純,其余所用試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 薄層色譜鑒別

    2.1.1 白芍薄層鑒別 白芍為本品重要組成成分,芍藥苷為其特征成分,參照《中國藥典》[3]2015版一部,以芍藥苷做對照品,采用TLC鑒別白芍,方法和結(jié)果如下:取冠心益壽丸2 g,研碎,加乙醇,超聲處理5 min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇使溶解,作為冠心益壽丸的供試品溶液。取缺白芍的陰性冠心益壽丸,同法制得缺白芍的陰性樣品溶液。取白芍粉末0.5 g,加乙醇10 mL,振搖5 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇1 mL使溶解,作為對照藥材的溶液。取芍藥苷對照品,加乙醇制成每lmL含lmg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述溶液各10μL,分別點于同一硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯示相同的顏色斑點。而缺白芍的陰性樣品色譜處無此斑點。結(jié)果見圖1。

    2.1.2 丹參薄層鑒別 丹參本品主藥之一,主要含有丹參酮Ⅰ,丹參酮ⅡA,隱丹參酮等成分,其中丹參酮ⅡA為其特征成分,參照《中國藥典》[3]2015版一部,以丹參酮ⅡA做對照品,采用TLC鑒別丹參,方法和結(jié)果如下:取冠心益壽丸粉末2 g,加乙醇10 mL,超聲處理15 min,離心,取上清液作為供試品溶液。取缺丹參的陰性冠心益壽丸,同法制得缺丹參的陰性樣品溶液。取丹參對照藥材1 g,加乙醇5 mL,超聲處理15 min,離心,取上清液作為對照藥材溶液。取丹參酮ⅡA對照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述溶液,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3)為展開劑,展開,取出,晾干。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯示相同的顏色斑點。而缺丹參的陰性樣品色譜處無此斑點。結(jié)果見圖2。

    2.1.3 葛根薄層鑒別 葛根素為葛根特征性成分,參照《中國藥典》[3]2015版一部,以葛根素做對照品,采用TLC鑒別葛根,方法和結(jié)果如下:取冠心益壽丸粉末2 g,研碎,加甲醇20 mL,放置2h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。取缺葛根的陰性冠心益壽丸,同法制得缺葛根的陰性樣品溶液。取葛根粉末2 g,研碎,加甲醇20 mL,放置2h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為對照藥材的溶液。取葛根素對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述溶液,分別點于同一硅膠G薄層板上,以二氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)為展開劑,展開,取出,晾干。置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。而缺葛根的陰性樣品色譜處無此斑點。結(jié)果見圖3。

    2.2 含量測定 丹參、葛根均為冠心益壽丸主藥,在提取中分別采用醇提及水提的提取方法。其中丹參中丹參酮ⅡA、葛根中的葛根素含量可作為檢驗濃縮提取工藝的重要指標(biāo)。

    2.2.1 丹參酮ⅡA含量的測定

    2.2.1.1 溶液配制

    對照品溶液的制備:取丹參酮ⅡA對照品,精密稱定為0.0032 g,加甲醇定容到10 mL棕色容量瓶中,采用倍半稀釋法將對照品濃度稀釋一倍,最終制得每1 mL含丹參酮ⅡA對照品0.16 mg的溶液,作為對照品溶液,搖勻,即得。

    供試品溶液的制備:取冠心益壽丸粉末2 g,精密稱定,加甲醇10 mL,用封口膜封口后放置2h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。

    陰性供試品的制備:取缺少丹參的冠心益壽丸粉末2 g,精密稱定,加甲醇10 mL,用封口膜封口后放置2h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為陰性供試品溶液。

    2.2.1.2 色譜條件 色譜柱:C18(4.6 mm×250 mm,5μm,S/N:0J7U73,Kromat Universil);柱溫:30℃,流動相:甲醇:0.1%磷酸水=85:15;檢測波長:270nm;流速:0.9 mL/min。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。色譜圖見圖4(a)、圖4(b)和圖4(c)。

    結(jié)果表明:供試品中丹參酮ⅡA與其前后峰的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015版高效液相色譜法項下規(guī)定,陰性對照品的色譜圖在與對照品相同保留時間位置上沒有吸收峰,說明該制劑中其他藥物對丹參酮ⅡA的含量測定干擾很小,用本法測定其含量專屬性較強、靈敏度高。

    2.2.1.3 線性與范圍 將上述制得丹參酮ⅡA對照品稀釋100倍后,分別精密吸取對照品溶液2、4、8、10、12、14、16μL注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定峰面積,以峰面積值為縱坐標(biāo),以丹參酮ⅡA進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo),作線性回歸,得回歸方程:y=1.1472x-0.02836,結(jié)果表明丹參酮ⅡA在0.32~2.56 mg之間呈良好線性關(guān)系。

    2.2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取任意一批冠心益壽丸供試品溶液分別于0h、1h、2h、6h、12h、24h進(jìn)行測定。每次進(jìn)樣10μL,記錄峰面積,計算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.79%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.2.1.5 重復(fù)性試驗 取任意一批冠心益壽丸供試品,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10μL,記錄丹參酮ⅡA峰面積,計算結(jié)果顯示RSD值為0.21%,表明重復(fù)性良好。

    2.2.1.6 準(zhǔn)確度試驗 稱取份同一批號已知丹參酮ⅡA含量的研細(xì)的冠心益壽丸6份。每份約2 g,精密稱定,精密稱取丹參酮ⅡA對照品0.0032 g,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,倍半稀釋法稀釋一倍,濃度為0.1600 mg/mL,分別精密吸取1.5 mL加入6個樣品中。精密吸取10μL,按“2.2.1.2”項下的方法測定峰面積,計算丹參酮ⅡA回收率。丹參酮ⅡA的平均回收率為101.15%,RSD為3.58%,結(jié)果見表1。加樣回收率=(測得量-樣品含量)/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。

    2.2.1.7 冠心益壽丸中丹參酮ⅡA含量測定 稱取不同批次冠心益壽丸粉末,每份約2 g,精密稱定,按“2.2.1.1”項下同法制備成供試品溶液,分別精密吸取10μL注入色譜儀,記錄丹參酮ⅡA峰面積,并計算丹參酮ⅡA含量。結(jié)果見表2。

    根據(jù)七批樣品的測定結(jié)果,七批樣品丹參酮ⅡA平均含量為0.2538 mg/g。初步擬定丹參酮ⅡA應(yīng)不低于平均含量的 85%,即規(guī)定本品丹參以丹參酮ⅡA計不得少于0.22 mg/g。

    2.2.2 葛根素含量測定[4]

    2.2.2.1 溶液配制

    對照品溶液的制備:精密稱取葛根素對照品0.0040 g于25 mL的容量瓶中,加甲醇定容至刻度,最終制得每1 mL含葛根素對照品0.16 mg的溶液作為對照品溶液,搖勻,即得。

    供試品溶液的制備:取冠心益壽丸粉末2 g,精密稱定,加甲醇10 mL,放置2小時,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。

    陰性供試品的制備:取缺少葛根的冠心益壽丸粉末2 g,精密稱定,加甲醇10 mL,用封口膜封口后放置2h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為陰性供試品溶液。

    2.2.2.2 色譜條件 色譜柱:C18(4.6 mm×250 mm 5μm,S/N:0J7U73,Kromat Universil);柱溫:30℃,流動相:甲醇:水=25:75;檢測波長:270nm;流速:0.9 mL/min。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。色譜圖見圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)。

    結(jié)果表明:供試品中葛根素與其前后峰的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015版高效液相色譜法項下規(guī)定。陰性對照品有輕微干擾,但由于峰形和峰面積與對照品完全不同,故可以認(rèn)為其他藥物對葛根素的含量測定沒有干擾,用本法測定葛根素的含量專屬性較強、靈敏度較高。

    2.2.2.3 線性與范圍 分別精密吸取葛根素對照品溶液4、8、10、12、14、16、22、24 μL注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo),以葛根素進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo),作線性回歸,得回歸方程:y=4.2318x-2.692,結(jié)果表明葛根素在0.64~3.84 mg之間呈良好線性關(guān)系。

    2.2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取一批冠心益壽丸供試品溶液分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)行測定,每次進(jìn)樣10 μL,記錄葛根素峰面積,計算RSD值。RSD值為0.71%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.2.2.5 重復(fù)性試驗 取同一批冠心益壽丸粉末,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10 μL,記錄葛根素峰面積,計算RSD值。結(jié)果顯示RSD為0.92%,表明重復(fù)性良好。

    2.2.2.6 準(zhǔn)確度試驗 稱取同一批號已知葛根素含量的研細(xì)的冠心益壽丸6份,每份約2 g,精密稱定,精密稱取葛根素對照品0.0020 g,置于25 mL容量瓶中,濃度為0.0800 mg/mL,分別精密吸取3 mL加入6個樣品中。精密吸取10 μL,按“2.4.3.1”項下的方法測定峰面積,計算葛根素回收率。葛根素的平均回收率為99.45%,RSD為1.51%,結(jié)果見表3。加樣回收率=(測得量-樣品含量)/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。

    2.2.2.7 冠心益壽丸中葛根素的含量測定 稱取不同批次冠心益壽丸粉末,每份約2 g,精密稱定,按“2.2.2.2”項下同法制備成供試品溶液,分別精密吸取10 μL注入色譜儀,記錄葛根素峰面積,并計算葛根素含量。結(jié)果見表4。

    根據(jù)七批樣品的測定結(jié)果,七批樣品葛根素平均含量為2.4304 mg/g。初步擬定葛根素應(yīng)不低于平均含量的85%,即規(guī)定本品丹參以葛根素計不得少于2.07 mg/g。

    3 小結(jié)與討論

    在白芍的定性鑒別過程中,通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)宋喜臣[5]采用“取樣品2.0 g,加乙醇25 mL,加熱回流3h,加乙醇溶解”的方法制得供試品溶液。通過反復(fù)實驗后發(fā)現(xiàn)乙醇超聲亦能取得類似的提取率,且超聲提取在具有實驗周期短、操作簡便的方法,故而最終確定采用乙醇超聲的方法對供試品進(jìn)行提取。

    在丹參的定性鑒別過程中,查閱文獻(xiàn)得知張淑瑜[6]采用乙醚超聲提取,羅紅麗[7]采用乙醚振搖放置提取。但經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)乙醇超聲提取同樣具有良好的效果,故供試品采用超聲提取法制備。在展開系統(tǒng)的選擇中,通過對比《中國藥典》和王潤梅等[8]的展開系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)王潤梅的展開系統(tǒng)更適用于冠心益壽丸。

    在定量測定中,分別選取水提和醇提部分的代表性藥物丹參及葛根進(jìn)行含量測定。經(jīng)過實驗證明,二者的含量測定方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、專屬性強,適用于冠心益壽丸的質(zhì)量控制。

    參考文獻(xiàn):

    [1]曹東,來圣吉,來圣麗,等.冠心益壽丸治療冠心病318 例療效總結(jié)[J].云南中醫(yī)中藥雜志,1995,16(6):32-33.

    [2]陳銘勇,顧偉,車京梅,等.冠心益壽丸(濃縮丸)的提取工藝研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2016,37(10):75-77.

    [3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

    [4]李鐵強,肖楠.高效液相色譜法測定消渴平膠囊中葛根素含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,29(11):1495-1496.

    [5]宋喜臣.保肝丸制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].吉林大學(xué),2014.

    [6]張淑瑜.復(fù)方漢防己顆粒中丹參酮ⅡA的成分鑒別和含量測定[J].藥學(xué)實踐雜志,2013,(3):228-230.

    [7]羅紅麗.丹參藥材質(zhì)量評價研究[D].成都中醫(yī)藥大學(xué),2015.

    [8]王潤梅,岳志勁.丹參中丹參酮的提取及其薄層色譜定性分析[J].山西大同大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,(1):32-40.

    (收稿日期:2018-08-09)

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