高效液相色譜法測(cè)定升血小板膠囊中靛玉紅的含量

魏于杰，劉進(jìn)豐，宋春麗

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004)

升血小板膠囊收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科氣血津液分冊(cè)》[編號(hào)：WS-10028(ZD-0028)-2002][1]，由青黛、仙鶴草、牡丹皮、連翹和甘草共5味藥材組成，經(jīng)研粉、醇提、水蒸氣蒸餾和水煎等處理后，加入糊精制粒，裝膠囊，即得。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升血小板膠囊具有清熱解毒、涼血止血和散瘀消斑的作用，臨床上主要用于原發(fā)性、特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療[2-5]。本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定升血小板膠囊中靛玉紅含量的方法，以保證該制劑的臨床療效。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010 A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AB135-S型十萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110717—200204)；升血小板膠囊(陜西郝其軍制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025029，批號(hào)：20130625，20130702，20130709)；色譜甲醇、色譜甲酸購(gòu)自Fisher公司；三氯甲烷為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-1%甲酸溶液(V∶V=30 ∶70)；柱溫為30 ℃；流速為0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取靛玉紅對(duì)照品20.12 mg，置于250 ml圓底燒瓶中，加入三氯甲烷90 ml，水浴加熱回流10 min使之溶解，后移至100 ml容量瓶中，放冷，加三氯甲烷定容至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置于100 ml容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，即得(每1.0 ml含靛玉紅10.06 μg)。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品20粒，拆除膠囊殼，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，混勻。取5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷100 ml，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，稱質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 ml，置于100 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

根據(jù)樣品處方比例稱取除青黛之外的藥材，制成缺青黛的陰性制劑，再按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取20 μl“2.2、2.3和2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，靛玉紅與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論板數(shù)靛玉紅峰計(jì)算應(yīng)均≥3 000。

A.供試品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.陰性樣品溶液A.solution for test; B. solution for contrast; C. solution of negative sample圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC Chromatogram

2.6 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密量取0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 ml，置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容，制成一系列濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積做縱坐標(biāo)(Y)，得靛玉紅的線性回歸方程為Y=59.383X+0.221 2(r=0.999 9)。結(jié)果表明，靛玉紅質(zhì)量濃度在0.20～5.08 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

連續(xù)5次精密吸取低、中及高質(zhì)量濃度(1.44、1.80及2.16 μg/ml)的對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果低、中及高質(zhì)量濃度下的RSD分別為0.75%、0.94%及1.42%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品(批號(hào)：20130625)適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫(25 ℃)下放置0、2、4、8、12和24 h時(shí)，精密吸取20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為1.37%。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取樣品(批號(hào)：20130625)適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μl，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行操作5次。結(jié)果表明，靛玉紅的平均含量為0.321 5 mg/粒，RSD為0.82%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取含量已知的本品內(nèi)容物(0.321 5 mg/粒)9份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液(1.016 μg/ml)1.6、2.0和2.4 ml，再分別精密加入三氯甲烷98.4、98.0和97.6 ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μl進(jìn)樣測(cè)定?；厥章?(實(shí)測(cè)值-樣品含量)/加入量×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery rate test of sample addition

2.11 含量測(cè)定結(jié)果

取樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算靛玉紅的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 靛玉紅的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

目前，靛玉紅的含量測(cè)定方法包括氧化滴定法、直接比色法、薄層色譜掃描法、雙波長(zhǎng)分光光度法、高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[6-10]。原制劑標(biāo)準(zhǔn)[1]僅采用薄層色

譜掃描法對(duì)靛玉紅(青黛的有效成分)進(jìn)行含量測(cè)定。為了提高制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，更加準(zhǔn)確地控制藥品質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，本研究采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于靛玉紅的含量測(cè)定。

靛玉紅可溶于乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷和乙醚，不溶于水，微溶于乙醇[12]。由于薄層掃描法測(cè)定靛玉紅含量時(shí)選用的提取溶劑是三氯甲烷，本研究仍選用三氯甲烷做為提取溶劑。

參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，本研究對(duì)流動(dòng)相(乙腈、甲醇、水和有機(jī)酸等)的組成和比例進(jìn)行篩選優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為甲醇-1%甲酸溶液(V∶V=30 ∶70)時(shí)，色譜圖中靛玉紅的峰型對(duì)稱，與相鄰色譜峰的分離度較好，且分析時(shí)間適宜。

[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科氣血津液分冊(cè)[S].北京：國(guó)家藥品監(jiān)督管理局，2002：580.

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