靛玉紅及其衍生物的合成與研究進(jìn)展*

姬長(zhǎng)安，于 健，嚴(yán)國(guó)兵

(麗水學(xué)院化學(xué)系，浙江 麗水 323000)

腫瘤(tumor)/癌癥(惡性腫瘤)是目前威脅人類健康的最大殺手，腫瘤的治療方式有三種：放療、化療和手術(shù)，放療、化療為常用抗腫瘤療法，主要通過細(xì)胞毒性藥物來殺死癌細(xì)胞，但對(duì)人體健康細(xì)胞的傷害較大，而且腫瘤還會(huì)復(fù)發(fā)。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，只針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性靶點(diǎn)藥物治療方式引起了人們的廣泛關(guān)注，即針對(duì)腫瘤或各種疾病發(fā)生時(shí)體內(nèi)的個(gè)別蛋白激酶異常表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞變異，參與變異細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞核酸的編譯、轉(zhuǎn)錄等等，是細(xì)胞非正常再生、表達(dá)的最直接誘因，所以直接針對(duì)這些激酶進(jìn)行抑制，就可以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。不僅是癌癥，還有糖尿病、阿茲海默癥(AD)等等，都是由于特定激酶的異常表達(dá)[1]。

人體有30%的蛋白質(zhì)含有共價(jià)鍵結(jié)合的磷酸鹽結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)磷酸化被認(rèn)為是細(xì)胞精細(xì)調(diào)節(jié)代謝和調(diào)控途徑的主要翻譯后機(jī)制之一，蛋白激酶利用ATP或GTP作為磷酸鹽供體催化蛋白質(zhì)的磷酸化。蛋白激酶的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的異常磷酸化，這往往是多種人類疾病如癌癥、糖尿病、AD等的誘因。人體內(nèi)有500多種激酶，其中有兩類激酶被特別研究：細(xì)胞周期素依賴激酶(CDKs)和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)。一些CDKs(CDK1，2，4，6)能控制細(xì)胞分裂周期和凋亡，常見于癌癥患者體內(nèi)；另一些CDKs(CDK5，11)參與神經(jīng)系統(tǒng)各項(xiàng)功能，如CDK5在AD和其他神經(jīng)退行性疾病中異常表達(dá)。GSK-3參與細(xì)胞程序化死亡，異常表達(dá)于腫瘤、糖尿病、AD等等[1]，是許多此類疾病的診斷特征之一。因此，各種激酶抑制劑的研究，成為了當(dāng)下抗腫瘤醫(yī)藥的熱點(diǎn)。

靛玉紅(Indirubin，圖1)是靛藍(lán)(indigo)的同分異構(gòu)體，屬于雙吲哚生物堿類化合物，是中藥當(dāng)歸龍薈丸的主要成分之一，主要用于治療慢粒白血病。近年來研究發(fā)現(xiàn)靛玉紅及其衍生物對(duì)實(shí)體乳腺癌、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤均具有抗腫瘤活性，在炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等方面也有作用，所以，靛玉紅在抗腫瘤、抗炎、神經(jīng)藥物開發(fā)等方面有著很大的發(fā)展前景[2]。

圖1 靛玉紅(a)與靛藍(lán)(b)結(jié)構(gòu)式

通過對(duì)靛玉紅母核進(jìn)行各種取代修飾，能有效抑制CDKs、GSK-3激酶的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等。靛藍(lán)化合物是常用的蛋白激酶抑制劑，通過與ATP、GTP結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用產(chǎn)生作用，是良好的激酶抑制劑。

1 靛玉紅的合成

由于靛玉紅很早就被發(fā)現(xiàn)有藥用價(jià)值，早期靛玉紅的獲取是從馬藍(lán)、蓼藍(lán)和菘藍(lán)等含靛藍(lán)高的植物中提取，因靛玉紅在植物體內(nèi)含量低，水溶性差，提取分離的成本高，所以此方法收率低，大都采取合成法[3-10]，當(dāng)然，也有人員提出了產(chǎn)率比較好的微生物提取法[11](大腸桿菌培養(yǎng)提取靛玉紅)，為靛玉紅生產(chǎn)提供了可能的新途徑。目前比較普遍的靛玉紅合成方法是靛紅(isatins)和吲哚乙酸酯縮合反應(yīng)，酸性堿性的選擇是根據(jù)所合成靛玉紅衍生物的特性，堿法的適用范圍大些，所以大都采用堿催化法(圖2)，此方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，收率較高[12]。而合成4取代靛玉紅時(shí)，用酸法產(chǎn)率高[9]。靛玉紅衍生物的合成通常是選用不同取代的靛紅和吲哚，再用此法反應(yīng)。

圖2 碳酸鈉催化靛玉紅合成反應(yīng)

近幾年，有人報(bào)道了一個(gè)合成靛玉紅的新方法[12]。Wang等總結(jié)了近十幾年來靛玉紅的5種合成方法，并提出使用KBH4一步還原歐聯(lián)法制備靛玉紅(圖3)。經(jīng)條件篩選，乙醇作溶劑效果最好，KBH4也可以用NaBH4代替，活性相似，且對(duì)于此反應(yīng)，閉口反應(yīng)時(shí)無產(chǎn)物或產(chǎn)率極低，所以要敞口在氧氣的條件下反應(yīng)。此法產(chǎn)率可以達(dá)到90%，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，比傳統(tǒng)合成方法更具有潛力。

圖3 KBH4催化一步法合成靛玉紅

圖4 KBH4催化反應(yīng)機(jī)理

由于靛玉紅水溶性差，導(dǎo)致細(xì)胞吸收不良，活性降低，且不易提純與制劑，所以人們的關(guān)注點(diǎn)逐漸從靛玉紅轉(zhuǎn)移到靛玉紅-3’-肟(肟醚)化合物上面來。最開始靛玉紅親水性的改進(jìn)時(shí)在苯環(huán)引入羥基、酸基等親水基團(tuán)，但是這些基團(tuán)活性提升小，拓展空間有限。在靛玉紅3’位引入肟基(=N-OH)或醚肟(=N-O-R)(圖5)，含有了靛紅肟骨架，不僅改善了親水性，還增加了其生物活性，能表現(xiàn)出更多藥理活性，在醚肟R基基礎(chǔ)上引入其他活性基團(tuán)(烯烴類、環(huán)氧化物、胺環(huán)類等等)，使其表現(xiàn)出更多的生物活性，力求更多的臨床價(jià)值。

圖5 靛玉紅肟的合成

2 靛玉紅的生物活性與構(gòu)效關(guān)系

由于靛玉紅的抗腫瘤活性是近十幾年才研究發(fā)現(xiàn)的，所以迄今為止靛玉紅的生物活性研究報(bào)道并不多，由于其在生物體內(nèi)較好的配位能力以及較好的拓展性，人們的研究主要集中在其對(duì)CDKs、GSK-3等的選擇性抑制及其作為先導(dǎo)化合物的各種取代改性上，常見的CDKs抑制劑是作CDK2和CDK5抑制劑，因?yàn)镃DK5和GSK-3同樣都是是作為AD患者的診斷特征之一。

較早的研究如Polychronopoulos等[1]利用分子模型研究了各種靛玉紅結(jié)構(gòu)在ATP口袋中的選擇性結(jié)合情況，此模型的提出方便了日后人們對(duì)靛玉紅的選擇性抑制研究。對(duì)靛玉紅進(jìn)行取代修飾時(shí)，在5、5′、3′位等引入取代基往往對(duì)活性有較大影響，是研究靛玉紅構(gòu)效關(guān)系的首選。Wu等[13]利用大腸桿菌研究了靛玉紅衍生物對(duì)GSK-3激酶的抑制活性，對(duì)靛玉紅母核取代修飾，并得到了一種抑制效果較好的化合物(圖 6)，可見在5、5′位引入酯基等比較顯著的提高了靛玉紅的抑制活性。

圖6 靛玉紅母核5、5′位修飾

圖7 靛玉紅母核的生物結(jié)合關(guān)系

Jautelat等[14]研究靛玉紅結(jié)構(gòu)對(duì)CDK2的抑制活性，找尋其構(gòu)效關(guān)系，他們利用計(jì)算機(jī)建模，根據(jù)X射線觀察出的靛玉紅與CDK2結(jié)合后的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)只有5、3′、4′、5′位容易取代(圖7)，而在1、6、7、6′、7′位取代則會(huì)導(dǎo)致失活，確定了5位指向極性三磷酸鹽通道、3′位指向核糖口、5′位指向核糖口末端的含水環(huán)境，通過修飾這幾個(gè)位置不僅改變靛玉紅極性來增強(qiáng)親水性，還能增加與ATP的親和力。他們?cè)?位引入磺?；突酋０坊?′為引入肟醚結(jié)構(gòu)，改變化合物結(jié)晶性和水溶性，活性顯著增加。

Moon等[3]研究新的靛玉紅衍生物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抗增殖活性，在5位引入F、Cl、OCF3等等，均有較好的抑制效果，在5位引入酰胺基(圖8)，R基含有叔丁基結(jié)構(gòu)時(shí)比含烷基結(jié)構(gòu)活性高，R基位苯環(huán)化合物取代時(shí)，大都無活性。他們還對(duì)多種癌細(xì)胞菌株(A 549、SNU-638、Col2、HT 1080、HL-60和MCF-7)進(jìn)行抑制觀察，發(fā)現(xiàn)靛玉紅有會(huì)選擇性抑制性。

圖8 靛玉紅引入肟基、酰胺基

Beauchard等[4]研究新的5取代靛玉紅衍生物對(duì)CDK1、CDK5、GSK-3等的抑制活性，抑制效果顯著，還在N1位引入甲基進(jìn)行對(duì)照研究，但效果較差，可能是因?yàn)樵黾恿宋蛔?。Ferandin等[15]研究了3’-取代-7-鹵代靛玉紅，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)屬性，發(fā)現(xiàn)7位鹵素取代對(duì)CDKs和GSK-3幾乎沒有效果，他們推測(cè)是因?yàn)?位取代阻礙了靛玉紅與受體結(jié)合，也應(yīng)了上文Jautelat等的報(bào)道。Beauchard等[6]研究對(duì)比了5、7雙取代和6取代靛玉紅的選擇性抑制關(guān)系，發(fā)現(xiàn)6位取代靛玉紅對(duì)GSK-3有較高選擇性，5位取代對(duì)CK1有較高選擇性。

Magiatis等[16]研究了靛玉紅衍生物在神經(jīng)退行性疾病方面的藥物活性，通過檢測(cè)小鼠大腦內(nèi)紋狀體單胺類物質(zhì)的消耗，來觀測(cè)其效果，除了研究5位、6位的溴取代-3′-肟外，發(fā)現(xiàn)在5位引入氨基能增強(qiáng)CDK5抑制活性，還在此基礎(chǔ)上合成了新的5-氨基-6-溴靛玉紅，得出靛玉紅可能對(duì)海人酸(KA)所致的伸進(jìn)系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，因?yàn)檫@些神經(jīng)毒素(KA、MPTP等)都與CDK5相關(guān)。

Choi等[17]為了更進(jìn)一步增強(qiáng)靛玉紅抗癌活性，在5、5’位用羥基、硝基和氟類等基團(tuán)拓展，受到之前研究的強(qiáng)效抑制劑5-硝基-5′-溴靛玉紅-3′-肟啟發(fā)，合成了5-硝基-5′-羥基和5-硝基-5′-氟等靛玉紅-3′-肟衍生物，作為CDK1和CDK5抑制劑有較好的抗癌效果，5-硝基-5′-羥基靛玉紅-3′-肟(圖9)對(duì)CDK的選擇性和抗腫瘤活性是同參與測(cè)試激酶的500倍。構(gòu)效關(guān)系表明，5′位為羥基和鹵素時(shí)，抑制活性優(yōu)于甲基、甲氧基等供電子基團(tuán)。

圖9 靛玉紅肟5、5′號(hào)位修飾

Cheng等[8]在5位引入羧酰胺，制備了一系列新的靛玉紅、靛玉紅肟、靛玉紅肟醚等衍生物(圖10)，能與水質(zhì)子化，使其有更好的水溶性，增強(qiáng)了其抗增殖活性。

圖10 水溶性靛玉紅骨架(R為各種-N類)

Saito等[10]研究甲氧基靛玉紅衍生物在誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性，得出5′-甲氧基靛玉紅對(duì)誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡有著高特異性，可能開發(fā)為治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤藥物。Myrianthopoulos等[18]提出一種新的反結(jié)合模式，即采用倒置結(jié)合的方式與受體結(jié)合，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)逵窦t7位為溴取代、5′位為羧酸類基團(tuán)時(shí)，靛玉紅對(duì)DRYK(雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶，參與AD、唐氏綜合癥等神經(jīng)性病理)激酶表現(xiàn)出有效的選擇性抑制。Jung等[19]研究了靛玉紅衍生物作為體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)劑的活性，他們發(fā)現(xiàn)5-硝基-5′-羥基-靛玉紅-3′-肟有高效的轉(zhuǎn)分化活性，優(yōu)于其他分子，且無潛在致癌和免疫原性iPSC轉(zhuǎn)錄的表達(dá)，可作為細(xì)胞編程的分子工具。Yan等[20]發(fā)現(xiàn)了靛玉紅-3′-肟衍生物對(duì)CDK9有較好的抑制活性，其中效果最好的是5-甲氧基-5′,6′-二氟靛玉紅-3′-肟醚(圖11)。Jung等[21]研究了靛玉紅衍生物作為一種新的DRAK2抑制劑的活性，是5-酰胺基靛玉紅-3′-肟骨架，在酰胺基變換(圖8)。

圖11 引入鹵素和肟醚結(jié)構(gòu)

Cheng等[22]在研究靛玉紅衍生物作為胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)的抑制劑時(shí)，進(jìn)一步研究了靛玉紅親水性與取代位的關(guān)系，研究了5′位的基團(tuán)耐受性，發(fā)現(xiàn)5′位取代基不能像3′位可以容忍較大基團(tuán)和剛性基團(tuán)而不影響活性，5′位有限的修飾空間會(huì)導(dǎo)致化合物整體細(xì)胞毒性和水溶性降低，他們研究合成了有效的、水溶性好的IGF-1R抑制劑(圖12)。

圖12 含靛玉紅母核的水溶鹽

Ichimaru等[23]合成了一種靛玉紅新結(jié)構(gòu)(圖13)，發(fā)現(xiàn)其具有長(zhǎng)效抗癌活性和環(huán)氧水解酶自殺抑制活性，此結(jié)構(gòu)中，環(huán)氧結(jié)構(gòu)的引入可與蛋白質(zhì)共價(jià)連接，表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性可與順鉑相媲美(以HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn))。他們發(fā)現(xiàn)溴取代除6′位的芳環(huán)位都能提高抗癌活性，5位溴取代的活性最好，5位溴取代活性好于氟、氯、碘，5位甲氧基取代時(shí)活性也優(yōu)于其他位。

圖13 肟醚結(jié)構(gòu)引入溴

Kosuge等[24]也研究了靛玉紅結(jié)構(gòu)對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療作用，是研究靛玉紅衍生物對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用。

3 結(jié) 語(yǔ)

靛玉紅以其出色的抗腫瘤生物活性和可拓展性，使其成為近幾年抗腫瘤靶向藥物極具研究?jī)r(jià)值的藥物前體，其本身具有良好的生物結(jié)合性，是一種更好的、新的激酶抑制劑，適當(dāng)、準(zhǔn)確的對(duì)其加取代修飾，可使靛玉紅發(fā)揮更好的生物活性，還可以通過特殊的基團(tuán)或C位修飾，讓其表現(xiàn)出獨(dú)特的特異性細(xì)胞毒性和靶標(biāo)選擇性，可對(duì)多種激酶的選擇性抑制，具有很大的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α５畮啄甑难芯恐皇谴蟾磐茢喑銎渌幚砘钚砸约捌渥鳛槎喾N抗癌、神經(jīng)疾病藥物的可能性，對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的探究也沒有十分準(zhǔn)確的解答，因?yàn)楹铣傻睦щy，靛玉紅的修飾多停留在3′位、5位等，取代的基團(tuán)也相對(duì)較簡(jiǎn)單，對(duì)其生物方面活性的研究也有待深入。因此，進(jìn)一步探究靛玉紅衍生物的準(zhǔn)確構(gòu)效關(guān)系，提高其生物活性與選擇性，將成為日后靛玉紅衍生物研究發(fā)展的重點(diǎn)。