泰山赤靈芝中靈芝酸和靈芝酸A的測(cè)定

王文正　李騰　李霞

摘要[目的]研究泰山赤靈芝中靈芝酸的檢測(cè)方法并應(yīng)用該方法測(cè)定靈芝酸A的含量。[方法]利用反相高效液相色譜和電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)研究已知的靈芝酸化合物的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)特征，鑒定泰山赤靈芝中生物堿提取物中的靈芝酸類(lèi)化合物，并通過(guò)靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其中靈芝酸A的含量。[結(jié)果]在泰山赤靈芝樣本中檢測(cè)到靈芝酸A、A1、B、C1、R、beta、delta、epsilon、gamma、zeta，靈芝酸A的含量為115.4 μg/g。[結(jié)論]泰山赤靈芝含有較高的靈芝酸，液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)泰山赤靈芝天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析以及含量測(cè)定準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞泰山赤靈芝；靈芝酸；靈芝酸A；液質(zhì)聯(lián)用儀；含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)S567.3+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）33-0123-03

Measure of Ganoderma Lucidum Acid and Ganoderma Lucidum Acid A in Taishan Ganoderma Lucidum

WANG Wenzheng，LI Teng，LI Xia*

（Institute of Quality Standard， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan，Shandong 250100）

Abstract[Objective] The research aimed to study detection method of ganoderma lucidum acid in Taishan Ganoderma lucidum and application of the method for determining the content of ganoderma lucidum acid A.[Method]Using reversedphase high performance liquid chromatography （HPLC） and electrospray ionization mass spectrometry technology， through the study of ganoderma lucidum acid known compounds and the relative molecular mass of the structure characteristics， identification of ganoderma lucidum acid compounds of Taishan Ganoderma lucidum alkaloids in the extracts， and to determining the content of ganoderma lucidum acid A through the standard curve of the standard of ganoderma lucidum acid A.[Result]We detected ganoderma lucidum acid A， A1， B， C1， R， beta， delta， epsilon， gamma， zeta in Taishan Ganoderma lucidum samples， ganoderma lucidum acid A content of 115.4 μg/g.[Conclusion]It contents high level ganoderma lucidum acid in Taishan Ganoderma lucidum， liquid chromatograph/mass spectrometer（LC/MS） of Taishan Ganoderma lucidum natural product structure analysis and content determination is accurate and reliable.

Key wordsTaishan Ganoderma lucidum；Ganoderma lucidum acid；Ganoderma lucidum acid A；Liquid mass combination；Content determination

靈芝為《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥。赤靈芝作為中藥?kù)`芝的主流品種，具有提高機(jī)體免疫功能、改善血液循環(huán)、提高心腦供血供氧能力、提高細(xì)胞和組織生理功能以及安神、解驚、解毒等功效[1-3]。靈芝有效成分包括靈芝多糖、靈芝酸、腺苷、赤芝孢子內(nèi)酯A、赤芝孢子酸A、靈芝堿甲、靈芝堿乙、油酸、靈芝總堿、薄醇醚、靈芝纖維素等。靈芝中的很多三萜類(lèi)化合物即靈芝酸具有生理活性，如ganoderic acid A、B、C和D能夠抑制小鼠肌肉細(xì)胞組胺的釋放，ganoderic acid F有很強(qiáng)的抑制血管緊張素酶的活性，赤芝孢子酸A對(duì)CCl4和半乳糖胺及丙酸桿菌造成的小鼠轉(zhuǎn)氮酶升高均有降低作用，赤芝孢子內(nèi)酯A具有降低膽固醇作用[4-5]。因此對(duì)靈芝酸的進(jìn)一步深入研究將有利于靈芝有效成分的尋找和進(jìn)一步闡明其生理活性。

一般用于藥物化學(xué)成分的研究技術(shù)包括紅外、紫外、質(zhì)譜和核磁共振等。近年來(lái)，由于高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）技術(shù)的出現(xiàn)，LC/MS已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高鑒別特點(diǎn)相結(jié)合，組成了較完美的現(xiàn)代分析技術(shù)。在藥物的含量測(cè)定、藥物動(dòng)力學(xué)研究的代謝物分析等試驗(yàn)中成為重要的分析手段[6-10]。該試驗(yàn)借助LC/MS技術(shù)進(jìn)一步對(duì)泰山赤靈芝的有效成分進(jìn)行分析，并測(cè)定其中靈芝酸A的含量。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

美國(guó)Waters Alliance 2695 HPLC，ZQ電噴霧質(zhì)譜儀，索氏提取器。甲醇為色譜純，無(wú)水乙醇為分析純，水為雙蒸水，泰山赤靈芝、標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A由泰山赤靈芝開(kāi)發(fā)公司提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏備用。

1.2.2供試品溶液的制備。均勻稱取泰山赤靈芝樣品粉末（過(guò)40目篩）40.3 g，于索氏提取器中，以400 mL無(wú)水乙醇提取24 h，得提取液286 mL，以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試液。

1.3試驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件。采用Waters Symmetry shield RP18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相由甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）組成，流速0.2 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min甲醇由5%線性增至100%（體積百分?jǐn)?shù)）；20～25 min用100%甲醇洗脫。

1.3.2電噴霧（ESI）條件。離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度200 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓60 V，萃取電壓2.5 V，聚焦透鏡電壓0.5 V，椎孔氣體流速42 L/h，脫溶劑流速311 L/h。

1.3.3質(zhì)譜（MS）分析條件。檢測(cè)負(fù)離子（ES-），離子電壓1.0 V，光電倍增器電壓650 V，分析室真空度2.6e-5。

1.3.4紫外檢測(cè)。在質(zhì)譜檢測(cè)的同時(shí)，采用二極管陣列（PDA）220～350 nm紫外檢測(cè)器分析樣品，進(jìn)行紫外檢測(cè)。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線取“1.2.1”標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，靈芝酸A的濃度分別為0、7.5、15.0、30.0、75.0、150.0 μg/mL。由標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和其相應(yīng)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1不同種類(lèi)靈芝酸的測(cè)定

根據(jù)靈芝酸的基本結(jié)構(gòu)圖（圖1），得出目前主要的靈芝酸化合物中R1、R2、R3、R4不同取代基的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)以及各種靈芝酸活性成分的化學(xué)式、分子量（表1）。

泰山赤靈芝粉末處理后的供試液，用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，

得到靈芝酸的選擇離子圖（圖 2）。根據(jù)表1中已知的靈芝

酸分子量和圖2可知，由分子量553.70構(gòu)建的離子選擇圖譜可知泰山赤靈芝中含有一定量的靈芝酸R；由分子量517.70構(gòu)建的離子選擇圖譜可知泰山赤靈芝中含有一定量的靈芝酸A1；由分子量515.67構(gòu)建的離子選擇圖譜可知泰山赤靈芝中含有一定量的靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸 delta、靈芝酸gamma、靈芝酸epsilon；由分子量513.70構(gòu)建的離子選擇圖譜可知泰山赤靈芝中含有一定量的靈芝酸C1、靈芝酸zeta、靈芝酸 beta。

2.2靈芝酸A含量的測(cè)定

由標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和其相應(yīng)峰面積得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=48 233x+218 717（R2=0.998 9），說(shuō)明峰面積與靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系良好（圖3）。將樣品測(cè)定靈芝酸A的峰面積（圖4）帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品中靈芝酸A的含量為115.4 μg/g。并做加標(biāo)回收試驗(yàn)得出，加標(biāo)回收率在97.16%～102.44%。

3結(jié)論

利用反相高效液相色譜和電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)研究已知的靈芝酸化合物的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)特征，鑒定泰山赤靈芝中生物堿提取物中的靈芝酸類(lèi)化合物，并通過(guò)靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其中靈芝酸A的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998 9，峰面積與靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)

品線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率在97.16%～102.44%，樣品中

靈芝酸A的含量為115.4 μg/g。表明該方法用于泰山赤靈芝中靈芝酸A的測(cè)定準(zhǔn)確、可靠。相對(duì)于其他分析技術(shù)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種快速靈敏的分析技術(shù)，準(zhǔn)確性和回收率更高[11-12]。下一步將利用其優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步分析泰山赤靈芝的活性成分，研究并發(fā)現(xiàn)其他活性成分。

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