王建霞+李林鋒+趙文博+王亞欣+孫紹永+趙春龍+王宏偉

中華新米蝦（Neocaridina denticulata sinensis）屬于甲殼綱，十足目，匙指蝦科，米蝦屬。中華新米蝦是一種小型淡水蝦類，具有生長迅速，生命力頑強，對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，生長周期短，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點，是一種優(yōu)良的實驗材料。

壬基酚（nonylphenol，NP）被廣泛用于非離子潤滑油添加劑、表面活性劑、洗滌劑等，因而也成為重要的環(huán)境污染物。壬基酚是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有一定的類雌激素樣作用，嚴重影響雄性生物的生殖能力。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年大約有50萬噸的NP進入水體或土壤，被水生生物所攝取并對其產(chǎn)生毒害，NP在其體內(nèi)積累，通過食物鏈對人類造成影響。

根據(jù)文獻[1]報道水體中含有壬基酚的濃度，以20.1 μg/L作為環(huán)境劑量，研究壬基酚對中華新米蝦肌肉內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）、丙二醛（MDA）的作用，通過測定SOD、GST、MDA、蛋白質(zhì)含量，研究壬基酚對水體中中華新米蝦肌肉內(nèi)的酶的毒害作用，進而研究NP對中華新米蝦的影響。

1材料和方法

中華新米蝦采于河北白洋淀，對中華新米蝦進行分組養(yǎng)殖，實驗期為30 d，養(yǎng)殖期間保持養(yǎng)殖水體溫度在23～26 ℃，pH 7.8～8.3，溶氧量>5 mg/L。實驗用自制飼料（飼料配方主要參照Wang H W et al. [2]的實驗飼料配方）。根據(jù)文獻[2]結(jié)果，設(shè)定環(huán)境中壬基酚的環(huán)境劑量為20.1 μg/L。用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽—S轉(zhuǎn)移酶（GST）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，按照試劑盒的步驟測定SOD， 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-.），O2-.可將氮藍四唑（NBT）還原為藍色的甲臜（formazan），后者在560 nm處有吸收。SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成。反應(yīng)液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。測定GST，GST催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340 nm；通過測定340 nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。測定MDA，測定方法是丙二醛在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3，5，5′-三甲基惡唑2，4-二酮（三甲川），該物質(zhì)在532 nm處有一吸收高峰，并且在660 nm處有較小光吸收。根據(jù)其532 nm的消光值可計算出溶液中丙二醛的含量。

2結(jié)果與分析

空白對照組和酒精對照組中由于不含有壬基酚，隨著時間的變化這兩組中SOD活力沒有顯著變化，環(huán)境劑量組中，SOD活力較低，說明水環(huán)境中壬基酚對中華新米蝦SOD有抑制作用；在2倍環(huán)境劑量和5倍環(huán)境劑量中SOD活力隨時間有顯著下降趨勢。而2倍環(huán)境劑量和5倍環(huán)境劑量中SOD活力明顯高于環(huán)境劑量組，說明較高濃度的壬基酚又刺激SOD活力升高來抵御脅迫（見圖1）。

壬基酚對中華新米蝦脅迫實驗中，空白組和酒精對照組，GST活力呈現(xiàn)先降低，10 h又上升的趨勢，說明無脅迫酶活力可以恢復(fù)。而在環(huán)境劑量和2倍環(huán)境劑量GST活力下降明顯，說明水環(huán)境中壬基酚對中華新米蝦GST有抑制作用，在5倍環(huán)境劑量中，GST活力總體隨時間也呈下降趨勢，說明一定劑量的壬基酚對中華新米蝦肌肉谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性有脅迫作用，與對照組相比，差異顯著。而5倍環(huán)境劑量明顯高于環(huán)境劑量組和2倍環(huán)境劑量中GST活力，說明較高濃度的壬基酚又刺激GST活力升高來抵御脅迫，而刺激GST提高的濃度略高于刺激SOD提高的壬基酚濃度 （見圖2）。

空白對照組MDA含量遠遠高于其他組（見圖3），說明不同濃度的壬基酚對中華新米蝦中的MDA都有較大影響。

3討論

楊麗麗、方展強[3]的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的壬基酚對唐魚體內(nèi)SOD的含量沒有明顯變化，但是高濃度的壬基酚使唐魚體內(nèi)的SOD含量明顯上升。我們的實驗結(jié)果表明中華新米蝦在不高于5倍環(huán)境劑量的條件下，SOD的活力是下降的，這表明壬基酚對中華新米蝦有一定的毒性作用，使其組織損傷，超氧化物歧化酶活力降低。在曹燕花，王茜對小白鼠的研究[4]有類似的發(fā)現(xiàn)，與對照組肝臟SOD的活力、MDA 含量的比較，沒有明顯差異。高劑量組與低劑量組腎臟SOD 活力、MDA 含量比較，差異顯著（P<005），隨染毒NP濃度升高，SOD活力降低，MDA 含量升高。各劑量組子宮NOS 活力比較差異顯著（P<0.05），隨染毒壬基酚濃度升高，NOS 活力下降。結(jié)論NP可導(dǎo)致雌性大鼠腎臟SOD 活力降低、MDA 含量升高，且導(dǎo)致子宮中NOS 活力降低，說明壬基酚對腎臟及子宮造成了氧化損傷作用，對肝臟無氧化損傷作用。由此也說明NP主要對生物的生殖系統(tǒng)造成傷害[5]。

GST作為動物體內(nèi)一種重要的解毒酶，能敏感地感覺到環(huán)境中壬基酚的變化。丁秀榮，李正炎對牙鲆的研究[6]表明，低濃度的NP對GST活性的誘導(dǎo)率為127.5%，高濃度的誘導(dǎo)率為373%。本實驗也有類似的結(jié)果，當中華新米蝦處于環(huán)境劑量時，GST的活力呈規(guī)律性下降趨勢，當試驗用蝦處于2倍環(huán)境劑量或5倍環(huán)境劑量時，GST活力開始下降。由于NP是一種對生殖系統(tǒng)有毒害作用的物質(zhì)，所以適當?shù)臐舛鹊腘P會激發(fā)生物產(chǎn)生較多的GST來抵抗環(huán)境的變化，但是如果環(huán)境中NP濃度過高超過了生物的耐受能力，那么生物體內(nèi)的GST將降低，通過NP對生物體內(nèi)GST的活力影響，可以檢測環(huán)境中NP污染物的量。

對于MDA的檢驗，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)不規(guī)律狀態(tài)，似乎對后續(xù)實驗沒有任何指導(dǎo)意義，但是參閱了孫建光，王文勇，劉舒婷對金魚的研究[7]發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)上述規(guī)律是正常的，NP對組織中含有的MDA隨著劑量的不同而不同，在一定范圍內(nèi)有著劑量-效應(yīng)關(guān)系。劑量超出一定范圍后，這種關(guān)系不再明顯。在時間-效應(yīng)關(guān)系上低劑量組時間效應(yīng)較弱，高劑量組時間積累效應(yīng)較強，中劑量組時間積累效應(yīng)最強。

壬基酚（NP）對于中華新米蝦有很強的毒害作用，能使其肌肉內(nèi)SOD活力明顯下降，并且隨著時間的延長，這種積累會加深。中華新米蝦在環(huán)境劑量組和2倍環(huán)境劑量組中GST活力下降明顯，5倍環(huán)境劑量的實驗用蝦GST活力沒有明顯變化。從時間角度分析，NP使實驗用蝦肌肉內(nèi)GST活力下降。NP對于MDA的影響較大，無論是環(huán)境劑量還是2倍環(huán)境劑量都使實驗用蝦肌肉內(nèi)MDA含量急劇減少。

由于NP是一種對生殖系統(tǒng)有毒害作用的物質(zhì)[8]，所以適當濃度的NP會激發(fā)生物產(chǎn)生較多的GST來抵抗環(huán)境的變化，但是如果環(huán)境中NP濃度過高超過了生物的耐受能力，那么生物體內(nèi)的GST將降低，通過NP對生物體內(nèi)GST的活力影響，可以反映環(huán)境中NP污染物的毒性。

參考文獻：

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[2] Wang HW， Zhao WB， Zhang J， Cai DB， Yin R， Zhang LL， Lu SS， Yang FK. Effects of Nonylphenol on the Enzyme Activity of ERND in Gastropods （Cipangopaludina chinensis） [J]. Advanced Materials Research Vols. 2015，1073-1076，253-255

[3] 楊麗麗，方展強.雌二醇、壬基酚、多氯聯(lián)苯、鎘和鋅暴露對唐魚體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響[J].中國實驗動物學報，2012，20（1）：38-45

[4] 曹燕花，王茜，李清釗，等.壬基酚對雌性大鼠肝、腎及子宮的氧化損傷作用[J].環(huán)境與健康雜志，2010，03（27）：233-234

[5] 李玉白， 曾琦斐，劉劭鋼.壬基酚毒性作用的研究[J].醫(yī)學理論與實踐，2006，19（4）：375-376.

[6] 丁秀榮，李正炎，王波，等.壬基酚對牙鲆肝臟EROD和GST酶活性的影響[J].中國海洋大學學報，2007，37（sup.）：101-104

[7] 孫建光，王文勇，劉舒婷.壬基酚對金魚丙二醛含量變化率的影響[J].科技信息，2009，33（1）：50-52

[8] Kolanjiappan， K.， Manoharan， S.， Kayalvizhi， M.， 2002. Measurement of erythrocyte lipids， lipid peroxidation， antioxidants and osmotic fragility in cervical cancer patients[J]. Clinica Chimica Acta 326，143-149

（收稿日期：2016-12-05）