強(qiáng)制休眠和嗜水氣單胞菌暴露對兩種不同模式養(yǎng)殖的中華鱉非特異性免疫的影響

邵珠岱

摘要：以仿生態(tài)養(yǎng)殖和溫室養(yǎng)殖的中華鱉為研究對象，探討強(qiáng)制休眠和嗜水氣單胞菌暴露對2種模式養(yǎng)成的中華鱉血清非特異性免疫的影響，研究發(fā)現(xiàn)，相同條件下，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉血清T-AOC活性顯著高于溫室養(yǎng)殖中華鱉（P<0.05），溫室養(yǎng)殖中華鱉表現(xiàn)出較高的AKP、ACP活性；強(qiáng)制休眠后的仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉血清SOD、LZM活性極顯著高于溫室養(yǎng)殖中華鱉（P<0.01）；水體中致病性嗜水氣單胞菌脅迫下，兩種模式養(yǎng)殖的中華鱉血清SOD、LZM活性差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉具有較溫室養(yǎng)殖中華鱉更高的抗病能力。

關(guān)鍵詞：中華鱉； 嗜水氣單胞菌； 強(qiáng)制休眠； 非特異性免疫

中華鱉（Pelodiscus sinensis Wiegmann） 屬爬行綱、龜鱉目、鱉科，為我國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類[1]。中華鱉養(yǎng)殖模式主要有溫室養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖和生態(tài)養(yǎng)殖，但一些人工養(yǎng)殖的鱉肉質(zhì)粗糙、營養(yǎng)品質(zhì)下降[2]，且病害日趨嚴(yán)重，可能是養(yǎng)殖模式的差異為中華鱉生存生長提供了不同的環(huán)境條件，環(huán)境條件的差異直接影響中華鱉的免疫應(yīng)答[3-4]。本實驗通過極端環(huán)境條件（強(qiáng)制休眠復(fù)蘇和嗜水氣單胞菌暴露）對中華鱉血清總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）活性影響的研究，探討?zhàn)B殖模式對中華鱉抗逆性免疫應(yīng)答的影響，為中華鱉健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1材料和方法

1.1實驗動物與致病菌

仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉和溫室養(yǎng)殖中華鱉均購自水產(chǎn)市場，產(chǎn)地青島。仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉體色土黃、體質(zhì)健壯、無外傷、平均體質(zhì)量502±49 g，共計21只；溫室養(yǎng)殖中華鱉體色灰黑、體制健壯、無外傷、平均體質(zhì)量516±54 g，共計21只。

實驗用致病性嗜水氣單胞菌由山東省淡水漁業(yè)研究院疫病防控研究室提供，分離自染病鯉魚。

1.2實驗設(shè)計

1.2.1強(qiáng)制低溫休眠實驗選擇平均體質(zhì)量516±54 g的溫室養(yǎng)殖中華鱉9只和平均體質(zhì)量502±49 g仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉9只，置4 ℃保鮮冰箱中強(qiáng)制休眠48 h后，取出放置室溫（24 ℃）自然恢復(fù)其生理機(jī)能至正?；顒樱s2 h）。斷頭取血，4 ℃靜置12 h使血液凝固析出血清（不加抗凝劑），3 000 r/min離心10 min分離血清，置-20 ℃冷凍保存，測定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。

1.2.2致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫實驗選擇平均體質(zhì)量516±54 g的溫室養(yǎng)殖中華鱉12只和平均體質(zhì)量502±49 g仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉12只，參考宋理平等[5]方法，進(jìn)行致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫實驗。將溫室養(yǎng)殖和仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉1∶1放入3個PVC周轉(zhuǎn)箱（120 cm×80 cm×60 cm，水體100 L），每箱2種中華鱉各4只，在每箱水體中加入10 mL濃度108 CFU/mL的致病性嗜水氣單胞菌，每天維持水體致病菌濃度，養(yǎng)殖7 d后，斷頭取血，4 ℃靜置12 h讓血液凝固析出血清（不加抗凝劑），3 000 r/min離心10 min分離血清，置-20 ℃冷凍保存，測定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。

1.3指標(biāo)測定

血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性均為送樣至南京建成生物工程研究所，使用相應(yīng)試劑盒檢測。

1.4數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1強(qiáng)制低溫休眠恢復(fù)時兩種養(yǎng)殖模式中華鱉血清非特異性免疫的對比研究

表1數(shù)據(jù)顯示，兩種養(yǎng)殖模式下的中華鱉從低溫休眠狀態(tài)恢復(fù)直正?；顒訒r的血清非特異性免疫能力具有顯著差異，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉血清T-AOC活性顯著高于溫室養(yǎng)殖中華鱉（P<005），且SOD、LZM活性極顯著高于溫室養(yǎng)殖中華鱉（P<0.01）；溫室養(yǎng)殖的中華鱉血清AKP活性極顯著高于仿生態(tài)養(yǎng)殖（P<0.01），ACP活性顯著高于仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉（P<0.05）。

2.2嗜水氣單胞菌暴露脅迫對中華鱉致病性的影響

如表2所示，水體致病性嗜水氣單胞菌脅迫條件下部分仿生態(tài)中華鱉背腹部和四肢有少量潰瘍病灶，而溫室養(yǎng)殖中華鱉背腹部和四肢潰瘍灶較多并有一只死亡。

2.3致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫對中華鱉血清非特異性免疫的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，水體中致病性嗜水氣單胞菌脅迫下仿生態(tài)中華鱉血清T-AOC活性極顯著高于溫室養(yǎng)殖中華鱉（P<0.01）；兩種養(yǎng)殖方式對中華鱉血清SOD、LZM活性無顯著影響（P>0.05）；溫室養(yǎng)殖中華鱉表現(xiàn)出較高的AKP、ACP活性，其中AKP活性極顯著高于仿生態(tài)養(yǎng)殖組（P<0.01）， ACP活性顯著高于仿生態(tài)養(yǎng)殖組（P<0.05）。

3討論

機(jī)體非特異性免疫體系發(fā)揮作用的最直觀體現(xiàn)就是抗病能力。嗜水氣單胞菌是中華鱉的主要致病菌，在已報道的25種中華鱉疾病中有15種是由嗜水氣單胞菌引起的，如紅脖子病、腮腺炎病、紅底板病、白底板病、腐皮病、癤瘡病、穿孔病、爛甲病等[6]。本實驗中在應(yīng)對7 d的致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫時，2種養(yǎng)殖中華鱉表現(xiàn)出了不同的抗病能力，仿生態(tài)中華鱉背腹部和四肢有少量潰瘍病灶，而溫室養(yǎng)殖中華鱉背腹部和四肢潰瘍灶較多并有一只死亡。從形體上看溫室養(yǎng)殖中華鱉背甲較仿生態(tài)養(yǎng)殖鱉更凸起，已有畸形的跡象。實驗中溫室養(yǎng)殖中華鱉血清AKP、ACP活性較高，可能就是由于溫室養(yǎng)殖過程中長期的環(huán)境脅迫導(dǎo)致骨骼、肝臟、脾臟等已產(chǎn)生病理變化導(dǎo)致。

LZM是吞噬細(xì)胞對所吞噬的病原菌能否殺滅的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]，主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解，在受到外來抗原性物質(zhì)刺激后LZM的活性通常會上升[8]。飼料中添加適量的半胱氨[9]、多糖[10-11]、益生菌[12]等均能提高中華鱉的LZM活性，增強(qiáng)其機(jī)體防御能力。SOD是對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起到至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基（O2-·），保護(hù)細(xì)胞免受損傷，從而提高機(jī)體的抗氧化功能和防病抗病能力。半胱氨[9]、乳酸菌[12]、綠原酸[13]等免疫增強(qiáng)劑可通過提高抗氧化酶活性來抑制脂質(zhì)過氧化作用，從而增強(qiáng)中華鱉機(jī)體的抗氧化能力。本實驗中，中華鱉低溫休眠恢復(fù)時身體的各項機(jī)能相對較弱，仿生態(tài)養(yǎng)殖的中華鱉表現(xiàn)出極顯著提高的LZM、SOD活性，可有效抵御細(xì)菌、活性氧和過氧化物等的侵襲，在機(jī)體非特異性免疫體系的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。

T-AOC的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，T-AOC體系各成份之間相互協(xié)同、代償、依賴，主要通過三條途徑形成機(jī)體的防御體系：（1）消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過氧化；（2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（3）除去起催化作用的金屬離子。T-AOC更加綜合反映了機(jī)體非酶抗氧化系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)共同的抗氧化作用。本實驗中，中華鱉在強(qiáng)制低溫休眠恢復(fù)期的免疫應(yīng)答中，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉T-AOC活性顯著高于溫室養(yǎng)殖；在致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫時的免疫應(yīng)答中，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉T-AOC體系的保護(hù)作用更加顯著。因此，仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉具有較溫室養(yǎng)殖中華鱉更高的抗氧化能力，可有效降低養(yǎng)殖過程中病害的危害。

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（收稿日期：2016-10-27）