海帶種質(zhì)固相保存技術(shù)

李言+王利芹+劉延嶺+趙聚萍+羅世菊+李曉捷+崔翠菊

摘要：將海帶種質(zhì)的無(wú)菌采集與配子體固相保存相結(jié)合，對(duì)種海帶的處理、游孢子的采集、配子體的分離與固相接種等關(guān)鍵步驟進(jìn)行了研究和改進(jìn)，建立了一種高效的海帶配子體固相保存方法，此方法從源頭降低了細(xì)菌的污染，減少了配子體保存過(guò)程中污染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，簡(jiǎn)化了常規(guī)固相保存的菌處理流程，提高了保種效率，有利于固相保存方法的大規(guī)模應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：海帶；配子體；固相保存；無(wú)菌采集

海帶（Saccharina japonica）屬于褐藻門(mén)（Phaeophyta）、海帶目（Laminariales）、海帶科（Laminariaceae）、海帶屬（Saccharina），為大型經(jīng)濟(jì)海藻，19世紀(jì)20年代從日本首次引進(jìn)，并逐漸適應(yīng)中國(guó)海域條件，現(xiàn)在是中國(guó)人工栽培歷史最長(zhǎng)、產(chǎn)量最高的大型經(jīng)濟(jì)海藻，在醫(yī)藥、食品、化工等方面都有廣泛的應(yīng)用[1-5]。20世紀(jì)70年代建立了海帶配子體的采集和培養(yǎng)技術(shù)，為海帶的種質(zhì)保存奠定了基礎(chǔ)[6-8]。利用傳統(tǒng)方法采集的配子體一般要分離到試管中并用棉花塞封口保存，通常每月更換一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，增加了細(xì)菌污染和種質(zhì)丟失、混雜的機(jī)會(huì)[9]；2005年山東東方海洋科技股份有限公司和煙臺(tái)大學(xué)合作開(kāi)發(fā)了海帶配子體固相保存技術(shù)[10]，但由于實(shí)驗(yàn)室原有配子體克隆保存時(shí)間的延長(zhǎng)、外界環(huán)境及海區(qū)水質(zhì)的變化[11-15]及液相培養(yǎng)開(kāi)放性操作等諸多因素的影響，至2008年底保存的海帶配子體克隆多有細(xì)菌污染，部分甚至出現(xiàn)真菌，并且污染菌的組成復(fù)雜，不是單一的一種菌[16]。采用常規(guī)的固相培養(yǎng)方法，前期處理海帶配子體所附帶細(xì)菌的流程比較復(fù)雜，同時(shí)處理污染較重的海帶雌雄配子體克隆，海帶雌雄配子體克隆往往很難達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)，接種后極易長(zhǎng)菌，導(dǎo)致固相培養(yǎng)失??；超聲波粉碎對(duì)海帶配子體的狀態(tài)也有不可逆的負(fù)作用[17，18]；這些方面都影響了常規(guī)固相保存技術(shù)的推廣應(yīng)用。為了促進(jìn)海帶配子體固相保存技術(shù)的應(yīng)用，本研究針對(duì)以上問(wèn)題，從種質(zhì)采集源頭出發(fā)，建立了一種種質(zhì)無(wú)菌采集與固相培養(yǎng)相結(jié)合的方法，有效地解決了上述問(wèn)題，為固相保存的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

在山東東方海洋科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)海區(qū)選取性狀優(yōu)良、成熟度好、孢子囊區(qū)突出明顯的種海帶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行種質(zhì)采集。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1孢子囊海帶塊的無(wú)菌處理在海帶孢子囊區(qū)剪取2 cm×3 cm左右的長(zhǎng)條，利用冷卻的煮沸海水和滅菌脫脂棉反復(fù)擦拭，去除藻體上所附著的雜藻、附泥及黏液。在無(wú)菌室外間，用高壓滅菌的冷卻海水和滅菌脫脂棉再次擦拭后，移入無(wú)菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，首先利用含有100 mg/L的阿奇霉素和100 mg/L的環(huán)丙沙星的雙抗無(wú)菌海水浸泡20 min，再利用含有1.5% 碘化鉀的無(wú)菌海水浸泡10 min，抽濾海水浸泡5 min，重復(fù)一次抽濾海水浸泡5 min。

1.2.2海帶游孢子的放散、附著及萌發(fā)將無(wú)菌處理的海帶塊直接放入藍(lán)蓋血清瓶，加抽濾的高壓滅菌的冷卻海水進(jìn)行孢子放散。取6～8滴海帶孢子水在顯微鏡下觀察，查看海帶游孢子的活力和數(shù)量，海帶游孢子密度每視野（160倍鏡下）達(dá)5個(gè)左右時(shí)，移出海帶塊，停止放散。使用300目篩絹過(guò)濾海帶孢子液中的黏液及雜質(zhì)，將海帶孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中進(jìn)行海帶孢子體的附著、萌發(fā)。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1 200～1 500 lx，24 h光照，溫度10～12 ℃，待48 h海帶孢子體附著牢靠后，更換染色缸中的抽濾的高壓滅菌的冷卻海水，5～7 d鏡檢一次。在顯微鏡下，海帶孢子體轉(zhuǎn)化為海帶配子體雌雄可辨時(shí)，即可挑取分離海帶雌雄配子體。

1.2.3固相保存培養(yǎng)基的配制配制PESI固體培養(yǎng)基，每100 mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6～0.8 g瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，在121 ℃，0.1 MPa，30 min條件下高溫滅菌；PESI固體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至60 ℃后分別添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使PESI固體培養(yǎng)中的阿奇霉素濃度為10 mg/L、利福平濃度為10 mg/L、制霉菌素濃度為10 mg/L（即抗生素的最終濃度），混勻后用9 cm直徑的培養(yǎng)皿倒平板，冷凝備用。

1.2.4海帶配子體的分離與接種在超凈工作臺(tái)內(nèi)的顯微鏡下，從事先備好的附有海帶配子體的載玻片上挑取狀態(tài)優(yōu)良、特征明顯的配子體；利用毛細(xì)玻璃管將挑取的海帶配子體先移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個(gè)雌配子體或是一個(gè)雄配子體后，再利用毛細(xì)管重新吸入植入固體培養(yǎng)基中，完成此操作后需要鏡檢蓋玻片和毛細(xì)玻管，看是否有海帶配子體殘留，每個(gè)PESI固體培養(yǎng)板接10～15個(gè)海帶配子體，接種后利用parafilm封口膜密封。

1.2.5固相保存的培養(yǎng)將接種的PESI固體培養(yǎng)板放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h光照，光強(qiáng)1 200～1 500 lx ，10 ℃左右，保存2個(gè)月左右，可見(jiàn)培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的海帶配子體克隆系藻斑10～15 mm，肉眼可見(jiàn)，此時(shí)將其轉(zhuǎn)入暗光低溫冷藏柜中保存（光照強(qiáng)度0～100 lx，4 ℃左右），使海帶配子體細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)，進(jìn)行長(zhǎng)期保存，根據(jù)培養(yǎng)基表面干燥程度添加滅菌的PESI培養(yǎng)液（一般是一年添加一次滅菌的PESI培養(yǎng)液）。

2結(jié)果與分析

2.1海帶配子體的分離及固相保存

本實(shí)驗(yàn)中海帶配子體附著培養(yǎng)35 d左右挑取分離雌雄配子體（圖1a，圖2a、2d），利用毛細(xì)玻璃管接種到0.8%的PESI固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)90 d左右，長(zhǎng)出1.0～1.5 mm的藻斑（圖1b）。

a.附著在載玻片上的海帶雌雄配子體； b.固相保存的海帶配子體藻斑圖1海帶配子體及固相保存

2.2固相保存海帶配子體的復(fù)蘇

用滅菌牙簽從PESI固體培養(yǎng)板上挑取肉眼可見(jiàn)的海帶配子體克隆系藻斑（圖2b、2e），接種于滅菌的PESI培養(yǎng)液中，溫度8～12 ℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，24 h光照條件下培養(yǎng)50～60 d即可長(zhǎng)成簇狀的海帶配子體克隆系（圖2c、2f）。

a.固相保存接種前的海帶雌配子體；b.固相保存中的海帶雌配子體；c.復(fù)蘇培養(yǎng)60 d的海帶雌配子體；d.固相保存接種前的海帶雄配子體；e.固相保存中的海帶雄配子體； f.復(fù)蘇培養(yǎng)50 d的海帶雄配子體圖2固相保存的海帶配子體的復(fù)蘇

2.3固相保存配子體克隆系的無(wú)菌檢測(cè)

即固相保存海帶配子體克隆系是否為細(xì)菌或真菌污染的檢測(cè)：在超凈工作臺(tái)中按表1設(shè)置檢驗(yàn)，28 ℃搖菌培養(yǎng)3 d，看培養(yǎng)液是否有菌污染。

進(jìn)行配子體保存以及其后所進(jìn)行的固相保存海帶配子體的復(fù)蘇過(guò)程是否會(huì)造成海帶配子體為細(xì)菌和真菌所污染，采用搖菌的方法進(jìn)行初步判定。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，檢測(cè)方法是設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照即為已分別接種污染有細(xì)菌的配子體的液體培養(yǎng)基—2216E培養(yǎng)液和已接種污染有真菌的配子體的液體培養(yǎng)基—沙堡培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照28 ℃在搖床中搖菌，培養(yǎng)液會(huì)變渾濁；陰性對(duì)照即為未添加任何污染物的細(xì)菌培養(yǎng)液---2216E培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液—沙堡培養(yǎng)液，陰性對(duì)照28 ℃在搖床中搖菌，正常操作下培養(yǎng)液是澄清的；將被檢測(cè)物分別加入細(xì)菌培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液中，和陽(yáng)性、陰性對(duì)照在相同條件下?lián)u菌，看渾濁或澄清狀況來(lái)判斷是否為細(xì)菌或真菌污染，在此實(shí)驗(yàn)中被檢測(cè)物為雌性海帶配子體♀、雄性海帶配子體♂復(fù)蘇培養(yǎng)液，如果搖菌結(jié)果渾濁表明海帶配子體有菌污染，如果搖菌結(jié)果澄清表明海帶配子體無(wú)菌污染[19-22]。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示，利用固相保存方法復(fù)蘇的配子體未污染細(xì)菌和真菌，無(wú)菌效果良好。

3討論

3.1接種前配子體處理方式

常規(guī)固相保存需要采用超聲波多次粉碎液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體，將配子體克隆粉碎為1～4個(gè)細(xì)胞，超聲波在粉碎處理時(shí)，對(duì)配子體的機(jī)械損傷很?chē)?yán)重，即使粉碎的同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行冰浴，但樣品內(nèi)部升溫也很快且高，對(duì)配子體克隆也會(huì)造成很大的損傷，短時(shí)間內(nèi)配子體克隆狀態(tài)難恢復(fù)；超聲波粉碎后形成的細(xì)胞混液中克隆段大小難控制，配子體克隆上的附菌被打落進(jìn)入懸液也很難清除，接種固相培養(yǎng)基時(shí)更易造成污染；超聲波粉碎儀刀頭清理不當(dāng)也易造成種間污染；新固相保存方法不需經(jīng)超聲波粉碎，而是通過(guò)采集種質(zhì)的載玻片進(jìn)行分離單個(gè)的雌雄配子體，當(dāng)載玻片上附著的孢子萌發(fā)為配子體，經(jīng)10 d培養(yǎng)，雌雄可辨且每個(gè)配子體長(zhǎng)到含有十個(gè)細(xì)胞左右，使用毛細(xì)玻璃管轉(zhuǎn)入固相培養(yǎng)基，對(duì)克隆零損傷，也不會(huì)帶入過(guò)多的培養(yǎng)液造成培養(yǎng)基的污染。

3.2實(shí)驗(yàn)中抗生素的選擇和添加

3.2.1孢子囊海帶塊的雙抗海水處理常規(guī)處理孢子囊海帶塊的雙抗藥物是鏈霉素和青霉素組合，但是本實(shí)驗(yàn)所采用的阿奇霉素和環(huán)丙沙星雙抗組合，是微生物實(shí)驗(yàn)室通過(guò)近5年來(lái)實(shí)驗(yàn)室人員出海收集的全國(guó)各地海區(qū)的海帶樣品，刮取其表面附菌，分離純化菌種，藥敏實(shí)驗(yàn)，最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)，生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，最終得出結(jié)論：阿奇霉素和環(huán)丙沙星對(duì)95%以上的配子體污染菌都有效（多為高敏或極高敏）；經(jīng)最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)和反復(fù)驗(yàn)證100 mg/L阿奇霉素和100 mg/L環(huán)丙沙星效果最好[23-25]。

3.2.2固相培養(yǎng)基中添加的抗生素常規(guī)的固相保存需要通過(guò)對(duì)保存的配子體克隆進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)確定固相培養(yǎng)基中添加抗生素的種類(lèi)，保存一個(gè)配子體就需要做一次藥敏，工作很繁瑣；而此種固相保存培養(yǎng)基中添加的抗生素種類(lèi)的確定是通過(guò)近5年來(lái)對(duì)每一批新采集的海帶配子體進(jìn)行跟蹤藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納統(tǒng)計(jì)總結(jié)出對(duì)98%的新采集來(lái)的海帶配子體附菌均有效的抗生素藥物是阿奇霉素和利福平[23]；同時(shí)對(duì)污染的真菌也進(jìn)行了分離純化，藥敏實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)有11種常用真菌抗生素，制霉菌素和特比萘芬效果較好[23]；為了防止周?chē)h(huán)境中的真菌尤其是夏天培養(yǎng)箱潮濕環(huán)境中的真菌污染，在培養(yǎng)基中添加制霉菌素；采用此種方法無(wú)須每個(gè)樣品都需要做藥敏，大大節(jié)省了固相前處理的一系列預(yù)備工作。

3.3接種工具和接種方式

常規(guī)固相操作中，配子體的接種是在超凈工作臺(tái)中，用10 mL的一次性無(wú)菌注射器取2 mL粉碎的配子體細(xì)胞懸液，逐點(diǎn)注射入一個(gè)平板內(nèi)，帶有菌的培養(yǎng)液也被轉(zhuǎn)入固相培養(yǎng)基中，不但易造成污染，并且一個(gè)平板內(nèi)只保存了一個(gè)克隆系，保存的量有限；新固相保存操作中配子體的接種是在超凈工作臺(tái)中的顯微鏡下，從附有海帶配子體的載玻片上挑取性狀優(yōu)良、特征明顯的海帶配子體克隆，使用內(nèi)徑約為200 μm的毛細(xì)玻璃管針吸出符合要求的配子體，先轉(zhuǎn)移到滅菌的蓋玻片上，鏡檢保證是符合要求的那個(gè)配子體，并且只有一個(gè)配子體后，再重新使用毛細(xì)玻璃管吸入并植入固相培養(yǎng)基的表層，此操作完成后再鏡檢一下蓋玻片和毛細(xì)玻璃管針，看是否有配子體克隆殘留，沒(méi)有殘留則完成海帶配子體的接種；不會(huì)帶入過(guò)多的培養(yǎng)液造成培養(yǎng)基的污染，一個(gè)平板可以保存多個(gè)配子體，每一個(gè)配子體長(zhǎng)成將成為一個(gè)克隆系，也就是一個(gè)平板能保存多個(gè)克隆系，更大地節(jié)省了空間。

3.4PESI固體培養(yǎng)基中瓊脂的濃度

本方法中接種工具和接種方式是使用內(nèi)徑約為200 μm的毛細(xì)玻璃管針，固相培養(yǎng)基硬的話很易折斷針頭，不利于配子體克隆的接種及挑?。煌瑫r(shí)含有十幾個(gè)細(xì)胞的配子體在固相培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)對(duì)濕潤(rùn)環(huán)境要求更嚴(yán)格，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定06%～0.8% 瓊脂濃度使固相培養(yǎng)基更軟彈，固相培養(yǎng)基水分保持較好，更有利于接種配子體的成活。此配方中節(jié)省了瓊脂粉的使用量，降低了成本。

4結(jié)論

本研究將海帶配子體的無(wú)菌采集和固相保存結(jié)合起來(lái)，即對(duì)種海帶進(jìn)行擦洗，并立即進(jìn)行無(wú)菌采克隆，待海帶游孢子附著萌發(fā)轉(zhuǎn)為海帶配子體，當(dāng)海帶配子體大小適中，密度均勻，雌雄可辨時(shí)，分離單個(gè)配子體并進(jìn)行固相保存。具有如下優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省空間，利用現(xiàn)有方法試管保存新分離的配子體克隆，占用光照培養(yǎng)箱較大面積，而固相保存，可大大節(jié)省空間面積，并且沒(méi)有試管液體保存出現(xiàn)的皮筋老化，試管液體倒、灑等問(wèn)題。比液相保存更省時(shí)省力，保存可長(zhǎng)達(dá)三年，不用添加培養(yǎng)基或更換培養(yǎng)基，而液相培養(yǎng)一般一個(gè)月更換一次培養(yǎng)液，并且操作比較開(kāi)放，種質(zhì)污染、混雜機(jī)會(huì)增加，同時(shí)傾倒培養(yǎng)液的過(guò)程也是散播污染菌的過(guò)程，也會(huì)造成不同種污染菌之間的交叉污染。將海帶配子體的無(wú)菌采集和固相保存結(jié)合起來(lái)，通過(guò)無(wú)菌采集海帶配子體，在源頭就抑制細(xì)菌的污染，降低了海帶配子體污染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，也大大簡(jiǎn)化了海帶配子體固相保存前期的無(wú)菌處理流程，降低固相培養(yǎng)前期處理海帶配子體所附帶細(xì)菌的難度?，F(xiàn)有方法液相保存有可能會(huì)造成種質(zhì)本身的老化，固相保存可使克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)，減緩海帶配子體克隆的新陳代謝，延長(zhǎng)保存時(shí)間，便于固相保存方法的推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2016-12-28）