U PLC同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中6種人參皂苷類成分的含量

胡紫艷　孫夏榮　史達(dá)　朱穎　蔣健

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京210000）

U PLC同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中6種人參皂苷類成分的含量

胡紫艷孫夏榮史達(dá)朱穎蔣健

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京210000）

目的：采用超高效液相色譜法（UPLC）分離測(cè)定腦安顆粒中 6種人參皂苷的含量。方法：采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，流速0.45 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫35℃。結(jié)果：6種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rd分別在8.096～ 202.4，20.008～500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2和16.048～ 401.2 μg/mL與相應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率（n=6）分別為：98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%，98.10%，RSD分別為 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%，0.76%。結(jié)論：UPLC分離效果及重復(fù)性好，且快速簡(jiǎn)便，可作為腦安顆粒的質(zhì)量控制方法。

超高效液相色譜；腦安顆粒；人參皂苷；含量測(cè)定

腦安顆粒由川芎、當(dāng)歸、紅花、人參與冰片5味藥組成。有活血化瘀、益氣通絡(luò)的功效，用于治療腦血栓形成急性期、恢復(fù)期氣虛血瘀[1]。臨床應(yīng)用證實(shí)腦安顆粒對(duì)血管性頭痛的治療效果較好，且不良反應(yīng)少[2]；對(duì)老年神經(jīng)衰弱也具有顯著療效[3-4]。目前標(biāo)準(zhǔn)采用的是薄層色譜法測(cè)定人參皂苷Re[1]，操作復(fù)雜且準(zhǔn)確度不高，而對(duì)其他人參皂苷類成分沒(méi)有規(guī)定。目前也尚未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd這6種成分含量的報(bào)道。由于腦安顆粒成分復(fù)雜，若采用普通液相色譜法測(cè)定6種人參皂苷耗時(shí)較長(zhǎng)，效率低下。超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)的發(fā)展，為復(fù)雜體系中藥的分離分析提供了良好的平臺(tái)[5]。為提高腦安顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步保證藥物療效，本研究采用UPLC技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd 6種成分的分離分析方法，此方法快捷、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為腦安顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　儀器、試劑與試藥

1.1儀器

超高效液相色譜系統(tǒng)（ACQUITY UPLC，美國(guó)Waters公司）；天平XS 205（METTLER TOLEDO）；色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

1.2試劑與試藥

乙腈為色譜純，水為超純水；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201530，含量91.7%）、人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：110754-201525，含量92.3%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201424，含量93.7%）、人參皂苷Rb2對(duì)照品（批號(hào)：110715-200802，含量94.8%）、人參皂苷Rb3對(duì)照品（批號(hào)：111686 -201002，含量 92.7%）、人參皂苷 Rd對(duì)照品（批號(hào)：111818-201001，含量94.4%），對(duì)照品均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。腦安顆粒 （批號(hào)：20140610），河南省百泉制藥有限公司生產(chǎn)。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為 Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；柱溫 35℃；樣品溫度10℃；進(jìn)樣體積1 μL；流速0.45 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm；流動(dòng)相 A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。在此條件下，6種人參皂苷分離度均大于1.5，對(duì)照品與樣品UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

表1　腦安顆粒中6種皂苷類成分測(cè)定的梯度洗脫程序

圖1　UPLC圖

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備取人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，使其濃度分別為1.012，2.501，2.014，1.030，2.006，2.058 mg/mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液 1～ 6。精密量取上述6個(gè)對(duì)照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含人參皂苷 Rg1（40.48 μg/mL）、Re（100.04 μg/mL）、Rb1（80.56 μg/mL）、Rb2（41.20 μg/mL）、Rb3（80.24 μg/mL）、Rd（82.32 μg/mL）的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取約4 g，精密稱定，加入甲醇 50 mL，超聲提取 40 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，用二氯甲烷洗滌2次，每次20 mL，棄去二氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌二次，每次 20 mL，棄去堿液層，用正丁醇飽和的水洗滌 2次，每次20 mL，再將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品溶液0.20，0.30，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。分別以各色譜峰面積（Y）對(duì)其濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2　6種人參皂苷的回歸方程

2.3.2精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液 1 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為0.52%，0.91%，0.45%，0.63%，0.52%和0.92%（n=5），表明本試驗(yàn)方法的精密度良好。

2.3.3溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液 （批號(hào)：151106）1 μL，分別于0，2，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為0.60%，0.71%和0.93%，0.97%，0.54%和1.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)：151106）適量，共5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，每份測(cè)定3次。結(jié)果，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd的平均含量分別為每袋0.19，0.34，0.17，0.15，0.27，0.34 mg，RSD分別為1.12%，1.03%，0.80%，0.43，0.59%和0.66%，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品（批號(hào)：151106）適量，研細(xì)，精密稱取4 g，分別精密加入人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品測(cè)定的結(jié)果

取3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批制備3份，每份測(cè)定2次，取兩份的平均值，見(jiàn)表4。

表4　樣品測(cè)定結(jié)果?。╩g/袋）

3　討論

3.1人參總皂苷純化方法的選擇

腦安顆粒為多組分組成的中成藥，成分復(fù)雜，若提取不完全雜質(zhì)較多，影響人參皂苷的測(cè)定。因此采用溶劑萃取法對(duì)人參皂苷進(jìn)行純化，除去大部分雜質(zhì)。參考文獻(xiàn)[6-8]，先用甲醇超聲提取，與原標(biāo)準(zhǔn)[1]中的索氏提取相比時(shí)間縮短、收率提高、溫度降低；用二氯甲烷去除大部分雜質(zhì)；再用水飽和正丁醇萃取樣品中人參皂苷，最后用正丁醇飽和水去除樣品中過(guò)量的雜質(zhì)。文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道采用D-101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，雖效果較好，但需對(duì)大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理、裝柱、洗柱等步驟，方法繁瑣、耗時(shí)；而溶劑萃取法相對(duì)簡(jiǎn)便、用時(shí)少，通過(guò)上述萃取方法可去除大部分雜質(zhì)。所以，本實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法對(duì)人參中的人參皂苷進(jìn)行分離純化。

3.2洗脫梯度的選擇

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中6種人參皂苷含量的方法，參照文獻(xiàn)[11-15]報(bào)道，通過(guò)探索不同的洗脫體系，不同的梯度洗脫程序，最終得到了優(yōu)化洗脫系統(tǒng)，使 6種重要的人參皂苷類成分獲得完全的分離。選用乙腈-水梯度洗脫，其中，0～ 9 min時(shí)，乙腈占18～ 22，在18～ 26 min之間，乙腈占52～ 18，可使樣品中人參皂苷 Rg1與人參皂苷Re、人參皂苷Rb2與人參皂苷Rb3的分離度最佳（R≥1.5），該色譜條件可用于6種人參皂苷的含量測(cè)定。用超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定腦安顆粒中6種人參皂苷，改進(jìn)了原標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定方法，該方法更加準(zhǔn)確、快速、可靠，同時(shí)增加了腦安顆粒的檢測(cè)項(xiàng)目，可作為腦安顆粒的質(zhì)量控制方法。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC同時(shí)測(cè)定了腦安顆粒中6種人參皂苷類成分，增加了原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)人參的檢測(cè)指標(biāo)，又改進(jìn)了原標(biāo)準(zhǔn)的方法，且該方法更加準(zhǔn)確、快速、可靠。

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Simultaneous Determination of Contents Six Kinds of Ginsenosides in Naoan Granules by UPLC

Hu Ziyan，Sun Xiarong，Shi Da，Zhu Ying，Jiang Jian（1 Nanjing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Nanjing 210000，China）

Objective：To develop a ultra performance liquid chromatography（UPLC）method for simultaneous determination of contents of six kinds of ginsenosides in Naoan granules.Methods：ACQUITY BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）was used with a mobile phase consisting of acetonitrile（A）-water（B）by gradient elution at a flow rate of 0.45 mL/min.The wavelength for detection was 203 nm while the column temperature was 35℃.Results：The contents of ginsenosides Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rb3and Rd within the range of 8.096～ 202.4，20.008～ 500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2 and 16.048～ 401.2 μg/mL showed good linear relationship to the corresponding peak areas，respectively.The average recoveries of the six kinds of ginsenosides were 98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%and 98.10%，with RSDs of 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%and 0.76%，respectively.Conclusion：The UPLC method showed good separation effect and reproducibility，which was rapid，simple，and might be used for the quality control of naoan granules.

Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）；Naoan Granules；Ginsenoside；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.12.006

胡紫艷，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：huzy0903@163.com

（2016-09-29）