海水中鐵載體的固相萃取預處理和高效液相色譜

章蕾+袁東星+方鍇+劉寶敏

摘 要 鐵載體是一種由海洋菌類合成并分泌、能特異性絡合海水中鐵的有機配體。本研究建立了固相萃取預處理、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定海水中鐵載體化合物的分析方法。海水樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，其中鐵載體由ENVI-18萃取柱萃取、甲醇洗脫后得到富集凈化后的試樣； 采用SB-C18反向色譜柱以0.1%（V/V）甲酸溶液和甲醇溶液梯度洗脫分離，在質(zhì)譜的多反應監(jiān)測正離子模式下檢測。3種鐵載體化合物標準物質(zhì)Pyoverdines-Fe， Ferrichrome， Ferrioxamine E的檢測線性范圍分別為0.001～3.0 μg/mL， 0.005～15.0 μg/mL， 0.001～3.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2>0.99； 儀器檢出限分別為0.08， 1.76 和1.36 ng/mL； 定量限分別0.27， 5.87和4.53 ng/mL。在海水樣品中添加鐵載體化合物混合標準溶液，3種目標物測定值的相對標準偏差<12%，方法回收率分別為Pyoverdines-Fe 12.1%～18.6%，F(xiàn)errichrome 82.0%～97.7%，F(xiàn)errioxamine E 70.0%～98.3%。

關(guān)鍵詞 鐵載體； 固相萃取； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 海水

1 引 言

不同于地表水，海洋表層的生物可利用態(tài)鐵（Fe）濃度極低，僅為nmol/L。鐵載體是一種低分子量（0.5～1.5 kDa）的有機配體[1]，對鐵有極強的螯合能力。在鐵限制條件下，鐵載體由海洋中的一些細菌和真菌合成并分泌到細胞外，與海水中的鐵特異性結(jié)合，通過細胞膜上特定鐵載體受體的識別和轉(zhuǎn)運，有效地將鐵運輸?shù)轿⑸锛毎麅?nèi)，滿足生物體對鐵的需求[1～3]。鐵載體種類繁多，根據(jù)其官能團的不同，可分為氧肟酸型、酚-兒茶酚型和少量檸檬酸型。鐵載體是海洋生物量的重要影響因子，其定性定量分析數(shù)據(jù)的獲取是相關(guān)研究的關(guān)鍵。

由于鐵載體結(jié)構(gòu)復雜多樣，在海洋環(huán)境中濃度低[4～6]，分析相對困難，一般需要采集大量水樣進行萃取和富集。傳統(tǒng)的前處理方法，如液-液萃取法、柱層析法等[6～8]，存在著操作繁瑣、重現(xiàn)性較差等缺點； 而固相萃取法用于鐵載體萃取[9，10]具有重現(xiàn)性好、溶劑用量小、操作高效快速等優(yōu)點。測定鐵載體常用分光光度法，如CAS（Chrome azurol S test）法[11]用于大多數(shù)細菌和真菌分泌的鐵載體的檢測。Csky等[12]特異性檢測了氧肟酸型鐵載體； Arnow建立了測定酚-兒茶酚型鐵載體的方法[13]。上述方法易受基底干擾[1]，回收率差，靈敏度低。Kilz等[14]嘗試使用高效液相色譜-電噴霧離子源-質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS）篩選熒光素類鐵載體，該方法分析速度快，但僅用于定性分析。

已有的分析方法未能涵蓋種類繁多的鐵載體，且回收率均不佳。據(jù)文獻[9，15]報道，天然海水中能被檢測到的鐵載體均為氧肟酸型鐵載體，而含兒茶酚官能團的鐵載體可能因親脂性相對較高，未能在水相中檢測得到。本研究旨在建立天然海水中鐵載體的分析方法，故選擇氧肟酸型鐵載體為研究對象，以固相萃取法對海水樣品進行預處理，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定。本方法操作簡便、基底干擾小，回收率優(yōu)于已報道的，并能提供目標物的結(jié)構(gòu)信息，適于海水基底中鐵載體的分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent6410 Triple Quad液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國Agilent公司），配Agilent 1290液相色譜系統(tǒng)、電噴霧離子源（ESI）； Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）； 0.22 μm聚醚砜針式過濾器、0.22 μm聚醚砜濾膜（美國Pall公司）。

甲醇（色譜純，美國Tedia公司）； 甲酸（96%，ACS純，美國Sigma公司）； 乙腈（色譜純， 美國Tedia公司）； NaCl（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）； HCl（工藝超純，昆山金城試劑有限公司）； NaOH（ACS試劑，美國Sigma公司）； 固相萃取柱：500 mg/6 mL Supelclean LC-18（美國Supelco公司），200 mg/6 mL Waters OASIS HLB（美國Waters公司），100 mg/1 mL Isolute ENV+（瑞典Biotage公司），500 mg/6 mL Supelclean ENVI-18、1 g/6 mL Supelclean ENVI-Carb（美國Supelco公司）。

本研究選擇的3種氧肟酸型鐵載體均購自美國Sigma公司：Ferrichrome（FC，無鐵絡合基，貨號F8014）、Ferrioxamine E（FO E，含鐵絡合物，貨號38266）、Pyoverdines-Fe（PVDs-Fe，含鐵絡合物，貨號P8374），其對應的結(jié)構(gòu)式示于Sigma公司的產(chǎn)品說明書。FC和FO E呈環(huán)狀，是典型且常見的氧肟酸型鐵載體化合物； PVDs-Fe呈鏈狀，因其官能團多樣，為混合型鐵載體化合物，既含氧肟酸官能團，又有兒茶酚官能團。3種鐵載體均以1∶1比例與Fe絡合。

2.2 溶液配制

鐵載體化合物標準儲備溶液： 超純水配制，濃度分別為PVDs-Fe，200 μg/mL； FC，500 μg/mL； FO E，200 μg/mL； 于

20℃下保存。使用時用超純水配制成所需濃度。低濃度： PVDs-Fe 0.01 μg/mL、FC 0.05 μg/mL、FO E 0.01 μg/mL； 中濃度： PVDs-Fe 0.10 μg/mL、FC 0.50 μg/mL、FO E 0.10 μg/mL； 高濃度： PVDs-Fe 1.00 μg/mL、FC 5.00 μg/mL、FO E 1.00 μg/mL。

含鐵載體化合物的人工海水： 取1～10 L超純水，用NaCl調(diào)節(jié)至所需鹽度，用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至所需pH值，向水樣中加入1 mL鐵載體混合標準溶液，其中各目標物含量分別為 PVDs-Fe 3.00 μg/mL、FC 15.00 μg/mL、FO E 3.00 μg/mL。

2.3 樣品預處理

天然海水樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，

20℃保存，使用前解凍，人工海水樣品可不過濾。分別用5 mL甲醇、5 mL超純水活化ENVI-18固相萃取柱，以5 mL/min的流速使水樣通過萃取柱。用5 mL超純水預淋洗萃取柱，以4 mL甲醇洗脫目標物，將收集的洗脫液氮吹至近干（小于100 μL），用含0.1%（V/V）甲酸定容至1.00 mL，渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾，待測。

2.4 色譜和質(zhì)譜分析液相色譜參數(shù)： ZORBAX SB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）； 進樣量： 10 μL； 流動相： A為0.1%（V/V）甲酸，B為甲醇； 流動相流速： 0.25 mL/min； 梯度程序： 0～3 min，5% B； 3～18 min，5%～100% B； 18～20 min，100% B； 20～20.01 min，100%～5% B； 20.01～23 min，5% B。

質(zhì)譜參數(shù)： 電噴霧離子源（ESI）； 多反應監(jiān)測（MRM）模式； 毛細管電壓： 2886 V； 鞘氣溫度： 200℃； 鞘氣流速： 6 L/min； 干燥氣溫度： 300℃； 干燥氣流速： 10 L/min； 霧化氣壓力： 240.28 kPa； 噴嘴電壓： 1500 V； 碰撞氣為高純氮氣（純度>99.999%）。以ESI+模式，在m/z 100～1400范圍內(nèi)選擇合適的區(qū)間進行全掃描，選擇準分子離子峰； 再以準分子離子峰作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇準分子離子和兩個信號強度適宜的子離子作為監(jiān)測反應的離子對。優(yōu)化后目標物的質(zhì)譜分析參數(shù)列于表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

文獻[9]表明，經(jīng)典的C18反向色譜法分離鐵絡合物時易形成拖尾峰，目標物的出峰時間與溶劑峰接近或重合。選擇合適的流動相可抑制拖尾。實驗以3種鐵載體化合物的分離效果和信號強度為指標，評估了4種流動相： （1）甲醇-超純水、（2）甲醇-0.1%（V/V）甲酸、（3）乙腈-超純水、（4）乙腈-0.1%（V/V）甲酸。

結(jié)果表明，采用4種流動相均可實現(xiàn)對目標物的分離。在流動相中加入甲酸，鐵載體化合物的峰形及信號響應得到明顯改善，而流動相（2）的分離結(jié)果最優(yōu)。本實驗選擇流動相（2），采用梯度洗脫模式。LC-MS/MS分析中常用的甲酸含量為0.1%（V/V），本實驗未對流動相中甲酸含量做進一步研究。優(yōu)化后， PVDs-Fe，F(xiàn)C和FO E的保留時間分別為5.46，7.70和8.43 min。

3.2 固相萃取條件的優(yōu)化

天然海水樣品中鐵載體濃度低，需富集。近年來，固相萃取技術(shù)在樣品預處理領(lǐng)域運用廣泛，McCormack等[9]用Isolute ENV+固相萃取柱，對人工及實際海水中鐵載體進行萃?。?而后，該方法被沿用于海水中鐵載體的萃取[10，15～17]。但該方法的回收率不高，人工海水中的鐵載體化合物回收率為Fe-rhodotoluate，7.9%； Ferrioxamine，46%； FC，48%； 實際海水樣品中目標物的回收率更低，F(xiàn)e-rhodotoluate，4.0%； Ferrioxamine，21%； FC，37%。

本研究系統(tǒng)考察了固相萃取柱（見2.1節(jié)）、洗脫溶劑中甲醇的比例（甲醇-超純水（V/V）： 0%， 30%， 50%， 80%和100%）、洗脫溶劑用量（1.00， 2.00， 3.00， 4.00和5.00 mL）、上樣體積（1.0， 3.0， 5.0， 8.0和10.0 mL）、鹽度（0‰， 15‰， 25‰， 35‰和40‰）、pH值（6.50， 7.00， 7.50， 8.00， 8.50）等參數(shù)對萃取結(jié)果的影響，通過正交實驗優(yōu)選參數(shù)。實驗采用六因素五水平25次實驗，記為L25（56），以各目標物的回收率為評估依據(jù)，選出最優(yōu)固相萃取條件。

根據(jù)極差分析，6種因素中，對鐵載體化合物萃取回收率影響最大的是洗脫溶劑的比例。在正交實驗范圍內(nèi)，綜合3種目標物回收率情況，選擇較好的萃取條件為： Supelclean ENVI-18柱萃取，4.00 mL 100%甲醇洗脫，上樣體積1.0 L，鹽度35‰，pH 7.00。在此條件下，回收率為PVDs-Fe 34.46%， FC 96.29%， FO E 86.11%。上樣體積對PVDs-Fe回收率的影響較大，而FC和FO E的回收率在水樣少于10 L時基本不變。本研究又對pH值進行單因素考察，結(jié)果表明，在pH 7.02～8.52范圍內(nèi)，目標物回收率基本持平。全球海洋表層海水鹽度大多介于33‰～37‰之間，表層水的pH值介于7.9～8.4之間[18]，故本方法可用于海水中鐵載體化合物的直接萃取，無需調(diào)節(jié)海水樣品的鹽度及pH值。

3.3 基質(zhì)效應的影響

實驗考察了LC-MS/MS分析的基質(zhì)效應的影響。以廈門近岸海水為基底，按2.3節(jié)方法進行過濾和預處理，氮吹濃縮至干，分別用高、低2個濃度水平的鐵載體化合物混合標準溶液溶解并定容。分析此溶液和用2.2節(jié)方法配制的相同濃度的混合標準純水溶液，比較其響應，基質(zhì)效應=（海水樣品的信號響應/純水樣品的信號響應）×100%[19]。基質(zhì)效應在80%～120%之間表示效應不明顯，高于120%為正效應，反之為基質(zhì)抑制效應。結(jié)果表明，本方法的基質(zhì)效應在97.5%～124.4%范圍內(nèi)，僅低濃度FC的超出120%，表現(xiàn)出輕微正效應。后續(xù)實驗采用非基質(zhì)匹配的標準工作曲線進行定量分析。

3.4 質(zhì)譜分析

實驗以甲醇-水（50∶50，V/V）為載流，流速0.25 mL/min，不接色譜柱，單標進樣10 μL。在電噴霧電離過程中，3種目標物所形成的主導離子均為質(zhì)子化的母體，且在ESI+模式下有較強的信號響應，其中FC和FO E有[M+H]+和[M+Na]+準分子離子峰。PVDs-Fe為3種Pyoverdine的混合物，結(jié)合其分子量信息及質(zhì)譜圖可獲PVDs-Fe 的[M+2H]2+及[M+H]+準分子離子峰； 混合物中以含琥珀酸和琥珀酰胺的Pyoverdines為主要成分，含2-羥基戊二酰亞胺結(jié)構(gòu)的Pyoverdine為次要成分。將獲得的母離子進行二級質(zhì)譜掃描，可分別獲得其碎片離子信息（圖1），用于鐵載體化合物譜圖的初步解析。本研究僅對FC和FO E進行MS2分析。

如圖1b所示， 后易脫H2O生成m/z 669.9的產(chǎn)物離子，豐度較大的碎片離子m/z 516可通過8-9和23-24兩處酰胺鍵的斷裂形成，經(jīng)過進一步的斷裂（17-18位酰胺鍵）可得到m/z 344的碎片離子。FO E是Ferrioxamine族中僅有的兩個具有環(huán)形結(jié)構(gòu)（Ferrioxamine E和D2）的成員之一，其它Ferrioxamine均為鏈狀結(jié)構(gòu)[1]。鏈狀結(jié)構(gòu)的Ferrioxamines MS2譜中可觀察到因鏈末端脫-NH2或-NH3而產(chǎn)生的碎片離子峰[20，21]，而環(huán)狀結(jié)構(gòu)的Ferrioxamines MS2譜中可觀察到因脫H2O而產(chǎn)生的碎片離子，如FO E 產(chǎn)生的m/z 636。質(zhì)子化的FO E的質(zhì)譜圖文獻[21]報道過，本實驗結(jié)果與之相符，但由于所用的檢測器不同，所得FO E的各碎片離子峰豐度略有差異。本實驗對豐度較大的碎片離子進行譜圖解析，見圖1d。 FO E的分子離子峰為m/z 654。 m/z 554來源于1位NO鍵的斷裂，1-2位NC鍵的斷裂及27-28位酰胺鍵的斷裂。m/z 554經(jīng)進一步碎裂，丟失OH基團后可得碎片離子m/z 537； m/z 470.7的產(chǎn)生則源于m/z 554碎片離子中C4H4O2的丟失。建立鐵載體譜庫是質(zhì)譜技術(shù)用于定性分析的重要條件。

3.5 工作曲線、檢出限和加標回收率

配制0.001～15.00 μg/mL的系列混合標準溶液，以峰面積定量，得到3種目標物的線性方程及線性范圍。以3倍信噪比（S/N）對應的添加水平為儀器檢出限（IDL），10倍信噪比（S/N）對應的添加水平作為定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

以廈門近岸海水為基底，按2.3節(jié)方法過濾后，分別向500 mL海水中加入低、中、高3個濃度水平的鐵載體化合物混合標準溶液各1 mL。每個濃度做4份平行，以標準工作曲線法進行定量分析，考察方法的回收率及其相對標準偏差（RSD）。3種目標物的加標回收率為PVDs-Fe 12.1%～18.6%，F(xiàn)C 82.0%～97.7%，F(xiàn)O E 70.0%～98.3%。PVDs-Fe的回收率較低，但該化合物的回收率為首次報道，與同類研究的其它鐵載體回收率[9]相比屬于常規(guī)水平，而FC和FO E的回收率均高于報道值[9，10]。3種目標物回收率的RSD分別為PVDs-Fe 12.5%，F(xiàn)C 3.9%，F(xiàn)O E 8.9%。本方法對絡合態(tài)鐵載體化合物PVDs-Fe、FO E和非絡合鐵載體FC均具有良好的定性與定量分析能力。

3.6 實際海水樣品分析

運用本方法測定廈門鼓浪嶼附近海水中鐵載體化合物含量。取樣量分別為1， 5和10 L，均未檢出鐵載體或類鐵載體化合物，這與近岸海水中鐵的濃度較高有關(guān)。本課題組對鄰近鼓浪嶼的九龍江河口海域的監(jiān)測結(jié)果[22]表明，該海域溶解態(tài)鐵含量為15.7～48.8 μg/L，此量級與可檢出鐵載體海域如新西蘭東南部沿海地區(qū)的溶解態(tài)鐵含量0.22～0.45 nmol/L [6]相比，屬較高水平，不足以構(gòu)成鐵脅迫，無法刺激生物分泌鐵載體。

4 結(jié) 論

建立了適用于海水基底中鐵載體及其鐵絡合物分離鑒定的固相萃取預處理、LC-MS/MS測定法。方法的基底分離效果好、富集倍數(shù)高，回收率良好，定量分析準確； 利用質(zhì)譜技術(shù)還能對目標物的結(jié)構(gòu)進行定性分析。本方法適合于高營養(yǎng)鹽低葉綠素等鐵限制條件的海區(qū)中海水樣品的測定。

References

1 Winkelmann G. CRC Handbook of Microbial Iron Chelates. CRC： Florida， 1991： 15-64

2 Perry R D，Bobrov A G， Fetherston J D. Metallomics， 2015 （doi：10.1039/C4MT00332B）

3 Chu B C， Garcia-Herrero A， Johanson T H， Krewulak K D， Lau C K， Peacock R S， Slavinskaya Z， Vogel H J. Biometals， 2010， 23（4）： 601-611

4 Rue E L， Bruland K W. Mar. Chem.， 1995， 50（1）： 117-138

5 Gledhill M， Buck K N. Front. Microbiol.， 2012， 3： 1-17

6 Velasquez I， Nunn B L， Ibisanmi E， Goodlett D R， Hunter K A， Sander S G. Mar. Chem.， 2011， 127（1）： 97-107

7 Armstrong J E， Van Baalen C. J. Gen. Microbiol.， 1979， 111（2）： 253-262

8 Jalal M A， Mocharla R， Barnes C L， Hossain M B， Powell D R， Eng-Wilmot D L， Grayson S L， Benson B A， van der Helm D. J. Bacteriol.， 1984， 158（2）： 683-694

9 McCormack P， Worsfold P J， Gledhill M. Anal. Chem.， 2003， 75（11）： 2647-2652

10 Mawji E， Gledhill M， Milton J A， Tarran G A. Environ. Sci. Technol.， 2008， 42（23）： 8675-8680

11 Schwyn B， Neilands J B. Anal. Biochem.， 1987， 160（1）： 47-56

12 Csáky T Z， Hassel O， Rosenberg T， Turunen E， Tuhkanen A. Acta Chem. Scand.， 1948， 2： 450-454

13 Arnow L E. J. Biochem.， 1937， 118（2）： 531-537

14 Kilz S， Lenz C， Fuchs R， Budzikiewicz H. J. Mass Spectrom.， 1999， 34（4）： 281-290

15 Mawji E， Gledhill M， Milton J A， Zubkov M V， Thompson A， Wolff G A， Achterberg E P. Mar. Chem.， 2011， 124（1）： 90-99

16 Gledhill M， McCormack P， Ussher S， Achterberg E P， Mantoura R F C， Worsfold P J. Mar. Chem.， 2004， 88（1）： 75-83

17 Moberg M， Nilsson E M， Holmstrm S J， Lundstrm U S， Pettersson J， Markides K E. Anal. Chem.， 2004， 76（9）： 2618-2622

18 CHEN Min. Chemical Oceanography. Beijing： Ocean Press， 2009： 22-73

陳 敏. 化學海洋學， 北京： 海洋出版社， 2009： 22-73

19 Matuszewski B K， Constanzer M L， Chavez-Eng C M. Anal. Chem.， 2003， 75（13）： 3019-3030

20 Groenewold G S， Van Stipdonk M J， Gresham G L， Chien W， Bulleigh K， Howard A. J. Mass Spectrom.， 2004， 39： 752-761

21 Mawji E， Gledhill M， Worsfold P J， Achterberg E P. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2008， 22（14）： 2195-2202

22 PENG Yuan-Zhen， HUANG Yong-Ming， YUAN Dong-Xing， LI Yan， GONG Zhen-Bin. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（16）： 877-882