線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

許靜怡　陳超翔　韓錦艷　杭緯　顏曉梅

摘要 線粒體是細(xì)胞能量代謝、生物合成和細(xì)胞死亡的調(diào)控中心，其功能異常會(huì)導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究為解析線粒體的生理功能、探索線粒體相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及促進(jìn)線粒體為靶向的藥物研發(fā)提供重要理論依據(jù)。本文對線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尤其是近年的技術(shù)發(fā)展以及線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，并對其未來的發(fā)展前景和挑戰(zhàn)進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 線粒體； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 質(zhì)譜； 疾?。?評(píng)述

1 引 言

線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，其在細(xì)胞能量代謝[1]、生物合成和細(xì)胞死亡[2，3]（包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性壞死）的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。此外，線粒體還參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸和氨基酸氧化、鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等重要生理過程[4]。由于線粒體在維持生命穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，因此其功能異常與許多人類疾病相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心臟病和糖尿病等[5～7]。由于線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)異常是其功能紊亂的主要原因，而線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)正是從整體角度，分析線粒體的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)等的動(dòng)態(tài)變化，旨在闡明線粒體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)與存在方式（修飾方式）、結(jié)構(gòu)與功能、以及蛋白質(zhì)相互作用等，從而在蛋白質(zhì)水平探索線粒體生理功能和相關(guān)疾病的聯(lián)系[8，9]。通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)可系統(tǒng)研究正常和病變組織中線粒體蛋白分布與表達(dá)的差異，從而為研究線粒體相關(guān)疾病的分子機(jī)制和以線粒體為靶標(biāo)的藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)[10]。近年來，人類基因組測序的完成、串級(jí)質(zhì)譜和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展加速了線粒體蛋白組學(xué)的研究。本文對線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尤其是近年的技術(shù)發(fā)展進(jìn)行總結(jié)，分析并討論蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用。

2 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法與技術(shù)

2.1 線粒體蛋白質(zhì)的提取策略

提取大量高純度的線粒體蛋白質(zhì)是開展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要前提[11]，線粒體的純度及其結(jié)構(gòu)的完整性是保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵所在。如圖1所示，線粒體由外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)或者膜間隙蛋白質(zhì)組學(xué)可促進(jìn)線粒體蛋白質(zhì)的定位和功能研究，但同時(shí)也對提取策略的選擇性和特異性提出了更高要求[12]。

差速離心結(jié)合密度梯度離心是分離純化線粒體的經(jīng)典方法[13]。差速離心用于分離不同大小、體積和重量的細(xì)胞器[14]。通過差速離心可初步分離得到線粒體，為盡量避免其它細(xì)胞器組分的干擾，需通過密度梯度離心對得到的線粒體進(jìn)一步分離純化[15]。密度梯度離心是在離心管內(nèi)通過特定介質(zhì)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將差速離心得到的線粒體懸液置于介質(zhì)頂部，懸液通過重力或離心力場作用進(jìn)一步分層和分離。線粒體密度梯度離心常用介質(zhì)有氯化銫、蔗糖、Ficoll、Percoll及碘化介質(zhì)（如Nycodenz）等。其中蔗糖黏度大且滲透性高， 易使細(xì)胞器破裂；而Percoll和Nycodenz介質(zhì)形成的梯度十分穩(wěn)定，且不易穿透生物膜造成細(xì)胞器損傷。例如，2010年Ferreira等利用Percoll為介質(zhì)的密度梯度離心法提取小鼠的腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維線粒體進(jìn)行線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究[16]。2014年Chen等利用以Nycodenz為介質(zhì)的密度梯度離心法對卵巢癌中有阿霉素抗性與無阿霉素抗性的兩個(gè)細(xì)胞系分別提取線粒體，分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，122種蛋白質(zhì)在有阿霉素抗性的細(xì)胞系中表達(dá)量顯著變化[17]。提取線粒體的純度和完整性通常采用形態(tài)學(xué)觀察、特定抗體檢測或特定酶活性檢測等方法進(jìn)行分析。電鏡可直觀地觀察線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的完整性，采用免疫印跡法分析線粒體標(biāo)志性蛋白如外膜VDAC、膜間隙細(xì)胞色素C蛋白的豐度可進(jìn)一步證明膜結(jié)構(gòu)的完整性。此外，通過測定線粒體標(biāo)志性酶如琥珀酸脫氫酶的活性及與其它細(xì)胞器標(biāo)志酶的活性比較可檢測提取線粒體的純度。近年來，本課題組采用線粒體內(nèi)膜心磷脂特異性熒光探針（NAO）和核酸探針（SYTO 62）（與線粒體DNA結(jié)合）對線粒體進(jìn)行標(biāo)記，利用其自行研發(fā)的超高靈敏流式檢測裝置（High sensitivity flow cytometer， HSFCM）在單顆粒水平對雙熒光標(biāo)記的線粒體進(jìn)行檢測，通過散射光通道與兩個(gè)熒光通道信號(hào)的時(shí)間相關(guān)性可定量分析所提取線粒體的純度和結(jié)構(gòu)完整性并能從單細(xì)胞器水平揭示線粒體的異質(zhì)性[18]。

然而，通過上述分級(jí)分離技術(shù)獲得的線粒體蛋白不僅由于細(xì)胞器粘連導(dǎo)致純度較低，容易損失或受到污染，而且難以特異地檢測線粒體各個(gè)亞區(qū)間（基質(zhì)、膜間隙）的蛋白質(zhì)[11]。為了實(shí)現(xiàn)線粒體亞區(qū)間蛋白質(zhì)的特異提取，美國MIT大學(xué)的Ting課題組對抗壞血酸過氧化物酶（APEX）進(jìn)行基因改造，可特異地“釣到”膜間隙或基質(zhì)蛋白質(zhì)[19]。如圖2所示，基因工程改造的APEX可靶向線粒體基質(zhì)、氧化多種苯酚衍生物產(chǎn)生羥基自由基，這些自由基壽命短（<1 ms）[20]，標(biāo)記半徑?。?lt;20 nm）[21，22]，可與富電子氨基酸例如Tyr， Trp， His等共價(jià)結(jié)合，從而標(biāo)記鄰近蛋白質(zhì)[23]。通過該方法可鑒定HEK細(xì)胞線粒體基質(zhì)的495種蛋白質(zhì)，其中31種是新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)[24]。采用該方法捕獲的基質(zhì)蛋白組覆蓋率和特異性分別達(dá)到85%和94%，覆蓋率較低的原因可能是一些蛋白質(zhì)側(cè)鏈被包埋太致密而無法與羥基自由基作用。該課題組又進(jìn)一步通過APEX結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法（SILAC）[25] 提取和鑒定線粒體膜間隙蛋白組，共鑒定了127種膜間隙蛋白質(zhì)（其中9種蛋白為新發(fā)現(xiàn)的線粒體蛋白），特異性高達(dá)94%，實(shí)現(xiàn)了對線粒體膜間隙蛋白質(zhì)組的高效測定[26]。

圖2 標(biāo)記活細(xì)胞的線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組[24]

Fig.2 Labeling the mitochondrial matrix proteome in living cells[24] （Adapted from Ref.[24]， with kind permission from Science）

綜上所述，獲得線粒體總蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法是采用差速離心結(jié)合密度梯度離心提取線粒體，裂解之后進(jìn)行分離和質(zhì)譜分析，該提取策略促進(jìn)了線粒體總蛋白質(zhì)“目錄”的建立。Ting課題組創(chuàng)新性地通過APEX與基質(zhì)或膜間隙靶向序列的融合表達(dá)，特異獲取線粒體基質(zhì)或膜間隙蛋白組，省略了提取細(xì)胞器這一繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)對線粒體亞區(qū)間蛋白質(zhì)的特異性提取和鑒定，促進(jìn)了新蛋白的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的亞線粒體定位和亞區(qū)間蛋白質(zhì)功能研究，使蛋白質(zhì)組學(xué)邁入了 “細(xì)胞器亞區(qū)間”時(shí)代。

2.2 線粒體蛋白質(zhì)的分離策略

對于線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究，無論通過上述何種策略獲得線粒體蛋白質(zhì)組，都需要對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離，分離后酶解成多肽片段，再通過質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。分離線粒體蛋白質(zhì)混合物的方法主要是電泳和色譜法。

二維電泳是分離線粒體蛋白質(zhì)最廣泛最經(jīng)典的方法，它是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。二維凝膠電泳的第一相常為等電聚焦電泳（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離；第二相是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同進(jìn)行分離。1998年Rabilloud等首先利用IEF/SDSPAGE分離人胚胎組織線粒體蛋白質(zhì)并結(jié)合肽指紋圖譜鑒定了46種線粒體蛋白質(zhì)[27]。王媛等通過雙向凝膠電泳在小鼠心臟、肝臟和腎臟3種組織中發(fā)現(xiàn)了87種組織特異的差異蛋白[28]。此外，有報(bào)道采用雙向熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）分析蛋白表達(dá)量的變化，即利用不同熒光染料標(biāo)記不同處理方法的蛋白質(zhì)，再等量混合標(biāo)記不同熒光染料的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，通過熒光強(qiáng)度的變化可測定蛋白表達(dá)量的變化。如van Laar等提取小鼠腦線粒體并分成有無多巴胺醌處理的兩組，通過2DDIGE結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)18種蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生顯著變化[29]。RamírezTorres等分別提取兩組膳食中“含”與“不含”鯊烯的小鼠肝臟線粒體，利用2DDIGE分離蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)鯊烯處理的小鼠肝臟線粒體中有18種蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變[30]。然而， IEF/SDSPAGE技術(shù)難以分離強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性、相對分子質(zhì)量過大或過小的蛋白質(zhì)或者膜蛋白和一些低豐度蛋白質(zhì)等。通過藍(lán)綠溫和非變性凝膠電泳（BNPAGE）結(jié)合SDSPAGE可以彌補(bǔ)IEF/SDSPAGE的技術(shù)缺陷，可分離線粒體膜蛋白復(fù)合物等。該技術(shù)是在非變性狀態(tài)下根據(jù)相對分子質(zhì)量分離膜蛋白復(fù)合體且不改變膜蛋白復(fù)合物的生理活性和結(jié)合狀態(tài)，再通過SDSPAGE將各個(gè)復(fù)合物的亞基或蛋白質(zhì)分離出來。Ferreira等通過綜合使用2DIEF/SDSPAGE/MS/MS和2DBN/SDSPAGE/MS/MS對腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維的線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，識(shí)別325種線粒體蛋白質(zhì)[16]。Chou等綜合BN/SDSPAGE和IEF/SDSPAGE兩種分離方法對小鼠的大腦皮質(zhì)線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行分離并結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)23種與三羧酸循環(huán)（TCA）相關(guān)蛋白質(zhì)在AD模型小鼠中表達(dá)失調(diào)[31]。

色譜是將線粒體蛋白質(zhì)用蛋白酶水解后，根據(jù)不同多肽在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使其在兩相間反復(fù)多次分配，以不同速度遷移，從而分離不同肽段。多維液相色譜組合了兩種或兩種以上不同分離機(jī)制，根據(jù)樣品不同特性（如分子大小、親水性、等電點(diǎn)等）對混合多肽進(jìn)行分離。多維液相色譜具有快速、高通量、自動(dòng)化、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，且能夠檢測疏水性以及低豐度蛋白質(zhì)，但難以提供翻譯后修飾等信息[32]。

通過將凝膠電泳與色譜兩種策略以合理方式組合，可使混合物達(dá)到更好分離效果。即先將線粒體的蛋白混合物通過SDSPAGE分離并切割條帶水解成多肽，最后用一維或多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜來鑒定水解得到的肽段。例如，Techritz等從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎五種組織中提取線粒體并純化，通過IEF/SDSPAGE和LC/ESIMS及MS/MS分離鑒定，發(fā)現(xiàn)有48種蛋白質(zhì)在不同組織中存在不同表達(dá)程度[33]。

2.3 線粒體蛋白質(zhì)的鑒定

質(zhì)譜是鑒定蛋白質(zhì)的首選方法，其可以準(zhǔn)確測量肽段和蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等信息。目前，根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽分子離子化的方式不同可分為電噴霧離子化質(zhì)譜（ESIMS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDIMS）。MALDI產(chǎn)生的離子可以用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）檢測，即基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOFMS）。MALDITOFMS可以檢測肽段的分子量，獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），通過與相應(yīng)的線粒體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對來鑒定蛋白質(zhì)[34]。此外，通過串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS）可對質(zhì)譜分析的肽段進(jìn)行碎裂再用質(zhì)譜分析，從而得到肽段序列信息。質(zhì)譜技術(shù)還可與雙向凝膠電泳、二維液相色譜等蛋白質(zhì)或肽段分離技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)“在線”式分離鑒定蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高和自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。如Taylor等通過蔗糖密度梯度法提取人心臟線粒體，利用SDSPAGE結(jié)合質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析，識(shí)別615種線粒體蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要參與生物合成，離子轉(zhuǎn)運(yùn)及脂代謝[35]。Lamb等通過LCMS/MS發(fā)現(xiàn)40種以上線粒體蛋白質(zhì)在癌干細(xì)胞中表達(dá)量無限上調(diào)[36]。Mootha等通過串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)LCMS/MS鑒定來自小鼠腦、心臟、腎、肝臟的399種線粒體蛋白質(zhì)[37]。但這些檢測到的大部分是高豐度蛋白質(zhì)，隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)靈敏度等的提高，也促進(jìn)了低豐度蛋白質(zhì)的檢測。如Pagliarini等提取小鼠的14種組織結(jié)合MS/MS技術(shù)鑒定了3881種線粒體蛋白質(zhì)[38]。因?yàn)?DDIGE在樣品處理上費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組定量，而通過同位素標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記（ICAT或iTRAQ）或label free方法，質(zhì)譜也可定量分析線粒體蛋白組的改變。例如，Bugger等通過label free方法和LCMS/MS發(fā)現(xiàn)心衰過程中脂肪酸氧化酶表達(dá)量減少，而丙酮酸脫氫酶亞基和兩種TCA循環(huán)關(guān)鍵酶表達(dá)量均上調(diào)，實(shí)現(xiàn)對線粒體蛋白組的定量分析[39]。為了探索氧含量對神經(jīng)元線粒體功能的影響，Villeneuve等分別提取5%和21%氧含量培養(yǎng)SHSY5Y（神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）的線粒體，利用同位素標(biāo)記結(jié)合IEFPAGE及LCMS/MS分離鑒定蛋白質(zhì)，鑒定出714種線粒體蛋白質(zhì)，且5%氧含量培養(yǎng)的細(xì)胞的線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞基等顯著高于21%氧含量培養(yǎng)的細(xì)胞，前者所產(chǎn)生的活性氧水平也低于后者，說明SHSY5Y更適合在5%氧含量條件下培養(yǎng)[40]。線粒體蛋白質(zhì)的合成與降解過程之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要因素，因此Kim等通過重水標(biāo)記策略結(jié)合SDSPAGE， LCMS， MS/MS分離鑒定來自鼠心臟和肝臟485種“轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 肝線粒體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換速率快于心臟組織，這些信息可以促進(jìn)線粒體蛋白翻譯及穩(wěn)態(tài)維持的機(jī)理研究[41]。

顯微鏡技術(shù)是與質(zhì)譜互補(bǔ)的蛋白質(zhì)鑒定方法，其主要作用是對線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行定位分析，即通過熒光標(biāo)記抗體或者轉(zhuǎn)染熒光蛋白（如GFP）等進(jìn)行觀察，已成功運(yùn)用于酵母菌的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究[42，43]。2013年Techritz等[33]從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎5種組織中提取線粒體，質(zhì)譜鑒定后再結(jié)合顯微鏡觀察GFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)，識(shí)別了6種新的線粒體蛋白質(zhì)。該技術(shù)的缺陷在于高質(zhì)量抗體的數(shù)量和種類有限，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)周期較長且引入外源蛋白質(zhì)，只能對少量幾種蛋白進(jìn)行觀察，無法實(shí)現(xiàn)高通量分析[44]。

總之，質(zhì)譜和顯微鏡技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，既可進(jìn)行高通量分析，也可選擇性地觀察目標(biāo)蛋白，促進(jìn)未知線粒體蛋白的發(fā)現(xiàn)，完善線粒體蛋白組的“目錄”，也使線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在相關(guān)疾病的研究中得以應(yīng)用。

3 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用

隨著線粒體蛋白質(zhì)組提取、分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，目前已建立了較為完善的線粒體蛋白質(zhì)“目錄”。已檢測到1000多種人類線粒體蛋白質(zhì)[8]，并發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)的豐度變化非常大，最豐富的內(nèi)膜和外膜蛋白分別是ANT1和VDAC[45]。以下對線粒體蛋白質(zhì)組的蛋白數(shù)目、豐度、定位、翻譯后修飾、組織分布、生化途徑歸屬及其應(yīng)用進(jìn)行介紹。

在線粒體蛋白質(zhì)的定位方面，一部分蛋白質(zhì)只存在于線粒體中，而另一部分線粒體蛋白質(zhì)可以“雙重”定位，即同一基因編碼的蛋白質(zhì)除了定位于線粒體，還出現(xiàn)在胞質(zhì)或其它細(xì)胞器中[46]。如在凋亡信號(hào)刺激下，tBID被凋亡蛋白酶8切割后轉(zhuǎn)位到線粒體外膜上[47]；線粒體膜間隙細(xì)胞色素C借助凋亡蛋白Bax等形成的孔道轉(zhuǎn)位到胞漿[48]。

在線粒體蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方面，主要采用3種方式：乙?；⒘姿峄土u基化。SIRT3是依賴NAD+的線粒體去乙酰化酶，為了解其作用底物，Rardin等利用Label free定量方法檢測到小鼠肝臟組織中483種乙?；€粒體蛋白質(zhì)，2187個(gè)賴氨酸乙?；稽c(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)136種蛋白質(zhì)中283個(gè)乙?；稽c(diǎn)在SIRT3基因敲除小鼠模型中顯著上調(diào)，說明SITR3可對多種蛋白質(zhì)以及同一種蛋白質(zhì)上的多個(gè)位點(diǎn)去乙?；＿M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， 這些乙酰化線粒體蛋白質(zhì)主要參與脂肪酸氧化、TCA循環(huán)等，表明SITR3是一種廣譜的線粒體蛋白質(zhì)去乙?；竅49]。Grimsrud等通過對不同生理狀態(tài)小鼠肝臟磷酸化線粒體蛋白組進(jìn)行多參數(shù)分析，結(jié)合iTRAQ定量標(biāo)記策略及LCMS/MS技術(shù)分離鑒定磷酸化多肽，共識(shí)別295種磷酸化線粒體蛋白質(zhì)，包括811個(gè)磷酸化位點(diǎn)，且這些線粒體蛋白質(zhì)的磷酸化在肥胖癥及T2D相關(guān)的酮體合成中起重要調(diào)節(jié)作用[50]。Deng等提取T2D模型小鼠的肝臟線粒體，通過LCMS/MS技術(shù)分離鑒定出355種羥基化線粒體蛋白質(zhì)，且羥基化程度在T2D病變過程中顯著提高，這種高程度的羥基化與ROS過量產(chǎn)生和氧化應(yīng)激相關(guān)，可加速凋亡速率，這些蛋白質(zhì)組學(xué)研究也促進(jìn)了T2D發(fā)病機(jī)理探索和藥物研發(fā)[51]?？傊?，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與方法的發(fā)展促進(jìn)動(dòng)態(tài)可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。

在線粒體蛋白質(zhì)的組織分布方面，由于不同組織對線粒體的功能需求不同，如肝臟主要需要生物合成功能，而心臟主要需要能量代謝功能，因而線粒體蛋白質(zhì)在不同組織中分布不同。如Johson等分別提取小鼠的腦、肝臟、心臟和腎臟線粒體，通過LCMS鑒定識(shí)別1162種高信任度線粒體蛋白質(zhì)，然而任意兩種組織間有1149種蛋白質(zhì)顯著不同，4種組織中僅有13種蛋白質(zhì)相同，說明線粒體蛋白質(zhì)組的組織分布差異巨大[52]。Lotz等分別提取人心肌、小鼠心肌、小鼠肝臟組織及果蠅線粒體，利用SDSPAGE、LCMS/MS和光譜分析分別識(shí)別1398， 1620， 1733和1015種線粒體蛋白質(zhì)，4種體系中僅有419種蛋白質(zhì)高度保守，且這些蛋白質(zhì)表達(dá)量動(dòng)態(tài)范圍大（跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)），高豐度蛋白主要與氧化磷酸化、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)[53]。且研究發(fā)現(xiàn)，呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ和Ⅴ在所有組織中高豐度分布，然而復(fù)合物IV在不同組織中分布不同[54]?？傊?，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究揭示了線粒體蛋白質(zhì)在不同組織或種屬間分布差異大，不同組織的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以促進(jìn)相關(guān)疾病的研究和治療。

在線粒體蛋白質(zhì)的生化途徑歸屬方面，以人的正常心臟組織為例（如圖3所示）[35]，在所識(shí)別的498種線粒體蛋白質(zhì)中，與氧化磷酸化功能相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)目最多，占17%，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的占12%，生物合成相關(guān)的占11%，與核苷酸代謝功能相關(guān)的數(shù)目最少，占1%，說明線粒體在能量代謝、生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的調(diào)控作用。

圖3 人心臟組織線粒體蛋白質(zhì)功能與分布[35]

Fig.3 Distribution and function of human heart mitochondrial proteins[35]

線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對線粒體相關(guān)疾病的研究起到了積極的推動(dòng)作用。例如，線粒體氧化磷酸化受阻，將導(dǎo)致呼吸鏈疾?。≧CD），患病率約0.02%，臨床特征包含骨骼肌病變、心肌癥、癲癇、中風(fēng)、失明和內(nèi)分泌紊亂等，通過線粒體蛋白組學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)92種蛋白質(zhì)突變與RCD相關(guān)[55]。在退行性疾病方面，通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物I功能失調(diào)與帕金森疾?。≒D）相關(guān)，其參與蛋白折疊和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了PD發(fā)病機(jī)制的研究[56]。在癌癥方面，Kim等在人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS線粒體蛋白組研究中發(fā)現(xiàn)4種高表達(dá)的線粒體蛋白質(zhì)[57]；Chen等利用2DDIGE結(jié)合MALDITOFMS對不同的乳腺癌細(xì)胞系的線粒體蛋白組進(jìn)行研究[58]，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞線粒體生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。在心血管疾病方面，通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究可闡明壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心衰[39]、缺血性心衰、以及慢性缺氧疾病的發(fā)病機(jī)制[59， 60]。在肝病方面，Eccleston等發(fā)現(xiàn)高脂肪膳食導(dǎo)致線粒體蛋白組改變，其與脂肪變性、NO合成及代謝有關(guān)[61]。在衰老方面，Alves等通過電泳和質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對有無運(yùn)動(dòng)的骨骼肌線粒體蛋白組研究，說明運(yùn)動(dòng)是改善衰老和維持線粒體功能的重要調(diào)節(jié)因素[62]。

在藥物研發(fā)方面，由于癌細(xì)胞抗藥性的產(chǎn)生使癌癥治療效果大大降低。Chen等通過SILAC和LCMS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)122種線粒體蛋白質(zhì)在對阿霉素抗性的卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)量顯著改變，分析表明線粒體是改善抗藥性的重要靶點(diǎn)[17]。Chappell等通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抗藥性細(xì)胞系中線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變與凋亡規(guī)避、腫瘤侵染和轉(zhuǎn)移等生理活動(dòng)相關(guān)[63]。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)也可用于藥物副作用的研究，Lee等通過iTRAQ定量并結(jié)合2DLC分離、MALDITOF/TOF MS/MS鑒定線粒體蛋白質(zhì)，說明曲格列酮會(huì)損傷線粒體功能[64]。綜上所述，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了線粒體相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制的系統(tǒng)研究和藥物研發(fā)。

4 結(jié)論與展望

隨著線粒體蛋白質(zhì)組提取、分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，目前既能對整個(gè)線粒體蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，也可針對膜間隙或基質(zhì)亞區(qū)間蛋白質(zhì)組分析，進(jìn)一步完善線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的“目錄”。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為我們提供了大量線粒體基因和蛋白信息，通過結(jié)合臨床特征，有利于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的基因和蛋白，為我們系統(tǒng)研究線粒體與人類疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)需要在以下幾個(gè)方向進(jìn)一步發(fā)展：第一，進(jìn)一步完善線粒體蛋白組目錄。一些蛋白質(zhì)可能由于豐度太低無法使用傳統(tǒng)方法檢測，一些蛋白質(zhì)由于側(cè)鏈包埋于封閉結(jié)構(gòu)中而無法對其進(jìn)行生物素化檢測。因此需要改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法，提高線粒體蛋白質(zhì)提取方法的覆蓋率和特異性，鑒定、識(shí)別之前難以檢測的蛋白質(zhì)；第二，除鑒定線粒體蛋白質(zhì)的氨基酸序列，還需完善蛋白質(zhì)翻譯后修飾和線粒體亞區(qū)間定位等信息，因?yàn)檫@些信息與蛋白質(zhì)自身功能緊密相關(guān)；第三，通過RNA干擾、蛋白蛋白相互作用、理論計(jì)算結(jié)合數(shù)據(jù)庫等方法研究蛋白質(zhì)在線粒體能量代謝、生物合成、細(xì)胞死亡中所起的作用（功能預(yù)測）；最后，借助生物及化學(xué)的新技術(shù)、新方法和數(shù)據(jù)庫資源等將線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白質(zhì)序列突變等信息與線粒體的生理功能和相關(guān)疾病的臨床特征及特定表型關(guān)聯(lián)起來，這不僅對于線粒體相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理的研究和藥物研發(fā)意義重大，而且也正是發(fā)展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的目的所在?？偠灾?，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)對線粒體全部蛋白質(zhì)的“破譯”將會(huì)為人類疾病研究和線粒體生物學(xué)開辟一個(gè)嶄新時(shí)代。

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