功能化Mn摻雜ZnS量子點用于人血清中IgG的低背景磷光檢測

朱保硯　楊成雄　嚴(yán)秀平

摘 要 通過Mn摻雜ZnS量子點表面的羧基與人IgG表面的氨基進(jìn)行酰胺縮合，制備了人IgG功能化的Mn摻雜ZnS量子點（IgG-QDs）。通過金納米粒子和羊抗人IgG之間的靜電相互作用，合成了羊抗人IgG功能化的金納米粒子。利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，建立了人血清中人IgG的室溫磷光檢測新方法。本方法的線性范圍為1～10 μg/mL，檢出限為0.45 μg/mL。由于引入了室溫磷光檢測，本方法有效避免了機體自發(fā)熒光和基質(zhì)散射光等背景信號的干擾，成功實現(xiàn)了人血清樣品中人IgG的檢測。

關(guān)鍵詞 Mn摻雜ZnS量子點； 免疫球蛋白G； 金納米粒子； 磷光

1 引 言

量子點作為一種新型熒光探針，與有機熒光染料相比，具有吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄和抗光漂白性好等優(yōu)點，在諸多領(lǐng)域得到了廣泛研究和應(yīng)用[1～11]。而傳統(tǒng)的熒光量子點用于生物傳感時，常受到基體自發(fā)熒光和基質(zhì)散射光的干擾[12]。因此，需要將量子點光信號和背景光信號區(qū)分開。目前已報道的可避免背景干擾的量子點主要有兩類，近紅外量子點[13～15]和磷光量子點[16～22]。近紅外量子點的發(fā)射波長較長，可以避開發(fā)射波長在550 nm左右的背景信號干擾。磷光量子點由于發(fā)光壽命較長，可在發(fā)光時間上避開短壽命的背景信號干擾。

Mn摻雜ZnS量子點是磷光量子點的典型代表，其光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異，在生物傳感中具有良好的應(yīng)用潛力。已有的基于Mn摻雜ZnS量子點的生物傳感方法，大多依賴分析物與量子點之間直接[22]或者間接[21]的相互作用。IgG（免疫球蛋白G，IgG）是血清主要的抗體成分，在機體免疫中起保護(hù)作用，其指標(biāo)對疾病診斷具有重要意義。IgG等生物活性蛋白與量子點并沒有明顯的相互作用，又需要保持其四級結(jié)構(gòu)來執(zhí)行生物學(xué)功能，開發(fā)基于Mn摻雜ZnS量子點的可用于人IgG等生物活性蛋白的低背景檢測方法具有重要意義。

本研究通過Mn摻雜ZnS量子點表面的羧基與人IgG表面的氨基進(jìn)行酰胺縮合， 制備了人IgG功能化的Mn摻雜ZnS量子點（IgG-QDs）； 通過金納米粒子和羊抗人IgG之間的靜電相互作用， 制備了羊抗人IgG金納米粒子。利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，構(gòu)建了人體血清中人IgG的室溫磷光檢測新方法。本方法的線性范圍為1～10 μg/mL，檢出限為0.45 μg/mL。由于引入了室溫磷光檢測，本方法可有效避免基體自發(fā)熒光和基質(zhì)散射光等背景信號的干擾。同時，由于引入了IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)， 因此本方法可用于高選擇性檢測生物體液中的人IgG。本方法低毒低背景，有望用于構(gòu)建其它檢測體系， 用于生物體液中的重要生物活性物質(zhì)的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Rigaku D/max-2500 X-射線衍射光譜儀（日本理光公司）； Tecnai G2 F20高分辨場發(fā)射透射電子電鏡（荷蘭菲利普公司）； UV-3600紫外-可見-近紅外分光光度計（日本島津公司）； FL-4500熒光光譜儀（日本日立公司）。

所用試劑至少為分析純。超純水（電阻率18.2 MΩ cm）由WaterPro水純化系統(tǒng)（美國Labconco 公司）制備。檸檬酸鈉、巰基丙酸（MPA）和氯金酸（阿拉丁試劑）； 吐溫-20、ZnSO4·7H2O、Mn（Ac）2·4H2O和Na2S·9H2O（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；C6H5Na3O7·2H2O（天津富辰化學(xué)試劑研究所）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），購于上海 Medpep公司；人IgG和羊抗人IgG （Ab，北京拜耳迪生物科技有限公司）；氨基酸和人血清白蛋白（HSA）購于北京普博欣試劑公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 Mn摻雜ZnS量子點的制備

參考文獻(xiàn)[23]制備Mn摻雜ZnS量子點。在100 mL圓底三口燒瓶中加入0.5 mmol ZnSO4和0.02 mmol Mn（Ac）2，室溫磁力攪拌混合均勻。加入2 mmol MPA，待攪拌均勻后用1.5 mol/L NaOH調(diào)至pH 11，以去離子水調(diào)節(jié)體系總體積至45 mL。室溫磁力攪拌下通氬氣30 min，在隔絕空氣的條件下加入5 mL Na2S溶液（0.05 mmol/L）。反應(yīng)20 min后，將體系敞開，并在50℃的恒溫水浴中陳化2 h。以無水乙醇沉降所得量子點，離心（10000 r/min，10 min），再用無水乙醇洗滌沉淀兩次，離心收集沉淀。所得沉淀室溫真空干燥24 h，得到Mn摻雜ZnS量子點。

2.2.2 人IgG功能化Mn摻雜ZnS量子點（IgG-QDs）的制備

參考文獻(xiàn)[24～26]制備人IgG功能化Mn摻雜ZnS量子點。用10 mmol/L PBS（pH 7.4）稀釋人IgG原液，得到5.0 mg/mL人IgG溶液，備用。稱取10 mg Mn摻雜ZnS量子點，4 mg EDC和2 mg NHS，溶解在1.0 mL 10 mmol/L PBS（pH 7.4）中。所得混合液在室溫下磁力攪拌30 min，使Mn摻雜ZnS量子點表面羧基充分活化。向上述混合液中加入1.0 mL 5.0 mg/mL人IgG溶液，室溫下磁力攪拌2 h。隨后將反應(yīng)液于4℃放置過夜，讓未反應(yīng)的EDC水解而失去活性。2500 r/min離心10 min，棄去上清液。將得到的沉淀用10 mmol/L PBS（pH 7.4）洗滌兩次。隨后將得到的沉淀溶解于20 mL 10 mmol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）中，于4℃放置備用。

2.2.3 金納米粒子（AuNPs）的制備

參考文獻(xiàn)[27～30]制備AuNPs。稱取115 mg檸檬酸鈉，以10 mL去離子水溶解， 得1%的檸檬酸鈉溶液。在100 mL圓底燒瓶中加入25 mL去離子水和250 μL 1% 氯金酸溶液，磁力攪拌下加熱至沸騰。向體系中快速加入1 mL 1% 檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)2 min后，反應(yīng)液由金黃色變?yōu)榫萍t色。待反應(yīng)液保持沸騰10 min后撤去加熱源，室溫下攪拌15 min，得到所需的AuNPs溶液。

2.2.4 羊抗人IgG功能化AuNPs（Ab-AuNPs）的制備

參考文獻(xiàn)[25]制備羊抗人IgG功能化的金納米粒子。以0.1 mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)AuNPs溶液至pH 9.0，取此溶液10 mL，與300 μL 1 mg/mL 羊抗人IgG溶液混合，室溫下磁力攪拌反應(yīng)1 h。12000 r/min離心30 min，收集沉淀，溶解于10 mL 10 mmol/L硼酸鹽緩沖液中。隨后向體系中加入60 μL 1 mg/mL HSA溶液，室溫磁力攪拌40 min，使AuNPs表面的未結(jié)合位點得到封閉。將此反應(yīng)液12000 r/min離心30 min，傾出上層清液。收集紅色沉淀，溶解于5 mL 10 mmol/L硼酸鹽緩沖液中，得Ab-AuNPs溶液，于4℃放置備用。

2.2.5 測定條件的優(yōu)化

在1.5 mL 離心管中加入10 μL IgG-QDs溶液和不同量（0， 50， 100， 150， 200和250 μL）的Ab-AuNPs溶液，用含0.05% 吐溫-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）調(diào)節(jié)體積至500 μL。將離心管放入37℃的搖床中，振蕩反應(yīng)1 h后，進(jìn)行熒光光譜測定（PMT電壓950 V，激發(fā)波長300 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10.0 nm）。

2.2.6 人IgG的測定

在1.5 mL 離心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液和不同體積（0， 20， 50， 100， 150 ， 200， 250和300 μL）的25 μg/mL人IgG溶液。用含 0.05% 吐溫-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）調(diào)節(jié)體積至490 μL。將離心管放入37℃的搖床中，振蕩反應(yīng)1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的搖床中繼續(xù)振蕩反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熒光光譜測定（PMT電壓950 V，激發(fā)波長300 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10.0 nm）。

2.2.7 共存干擾實驗

在1.5 mL 離心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液、100 μL 25 μg/mL人IgG溶液和適量的共存干擾物溶液。用含0.05% 吐溫-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）調(diào)節(jié)體積至490 μL。將離心管放入37℃搖床中振蕩反應(yīng)1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的搖床中繼續(xù)振蕩反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熒光光譜測定（PMT電壓950 V，激發(fā)波長300 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10.0 nm）。

2.2.8 實際樣品的測定

6份人血清樣品取自當(dāng)?shù)蒯t(yī)院。將血清樣品用含0.05% 吐溫-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）稀釋400倍。在1.5 mL 離心管中加入150 μL Ab-AuNPs溶液，250 μL 待測樣品和適量（0， 20和40 μL） 25 μg/mL人IgG溶液。用含0.05%吐溫-20的10 mmol/L PBS溶液（pH 7.4）調(diào)節(jié)體積至490 μL。將離心管放入37℃的搖床中，振蕩反應(yīng)1 h后，加入10 μL IgG-QDs溶液，于37℃的搖床中繼續(xù)振蕩反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熒光光譜測定（PMT電壓950 V，激發(fā)波長300 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10.0 nm）。3 結(jié)果與討論

3.1 Mn摻雜ZnS量子點和AuNPs的表征

SEM結(jié)果表明Mn摻雜ZnS量子點顆粒接近球形，粒徑約3.5 nm（圖1A）。XRD譜圖中衍射峰有明顯的寬化現(xiàn)象，表明所合成的Mn摻雜ZnS量子點粒子粒徑較小。3個衍射峰分別對應(yīng)于立方型閃鋅礦結(jié)構(gòu)的（111）、（220）和（311）3個晶面的衍射，說明所制備的Mn摻雜ZnS量子點為立方形結(jié)構(gòu)。

圖1 Mn摻雜ZnS量子點的（A）SEM和（B）XRD圖

Fig.1 （A） SEM image and （B） XRD pattem of Mn doped ZnS quantum dots （QDs）

Mn摻雜ZnS量子點的室溫磷光發(fā)射（RTP）在與IgG偶聯(lián)后，峰形幾乎不變，光強略微降低（圖2A）。AuNPs的紫外光譜吸收峰在與羊抗人IgG偶聯(lián)后有所紅移，強度略微降低（圖2B）。IgG-QDs的RTP發(fā)射光譜和Ab-AuNPs的紫外吸收光譜有部分重疊，有可能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用（圖2C）。

圖2 （A）Mn摻雜ZnS量子點（…）和IgG-QDs（—）的RTP發(fā)射光譜；（B）AuNPs（…）和Ab-AuNPs（—）的紫外吸收光譜；（C）IgG-QDs的室溫磷光（RTP）發(fā)射光譜和Ab-AuNPs的紫外吸收光譜

Fig.2 （A） Room temperature phosphorescence （RTP） emission spectra of Mn-doped ZnS QDs and IgG-QDs； （B） Absorption spectra of AuNPs and Ab-AuNPs； （C） RTP emission spectrum of IgG-QDs and absorption spectrum of Ab-AuNPs

3.2 Ab-AuNPs和IgG-QDs比例優(yōu)化

考察了Ab-AuNPs和IgG-QDs比例對IgG-QDs磷光淬滅的影響（圖3），當(dāng)IgG-QDs和Ab-AuNPs的比例為1∶15時，淬滅效果最好。為保持抗體活性，體系pH=7.4，溫度為37℃。

圖3 Ab-AuNPs和IgG-QDs比例對IgG-QDs磷光強度的影響

Fig.3 Effect of the ratio of Ab-AuNPs to IgG-QDs on RTP intensity of IgG-QDs

3.3 傳感機理

體系RTP的強度與待測樣品中人IgG濃度之間的定量關(guān)系可由Forster偶極-偶極相互作用模型解釋（圖4）。當(dāng)IgG-QDs表面的人IgG與Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG特異性結(jié)合后，IgG-QDs與Ab-AuNPs之間的距離被拉近，從而發(fā)生FRET效應(yīng)，引起IgG-QDs RTP淬滅。而當(dāng)IgG-QDs表面的人IgG不與Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG特異性結(jié)合時，IgG-QDs與Ab-AuNPs之間的距離較遠(yuǎn)，從而不發(fā)生FRET作用，不會引起IgG-QDs RTP淬滅。

當(dāng)待測樣品與Ab-AuNPs溶液混合時，一些Ab-AuNPs表面的羊抗人IgG會與樣品中的人IgG結(jié)合。體系中加入IgG-QDs后，已經(jīng)結(jié)合了人IgG的Ab-AuNPs無法再結(jié)合IgG-QDs。待測樣品中人IgG的量決定了被占據(jù)的Ab-AuNPs的量，進(jìn)而決定了能與Ab-AuNPs結(jié)合的IgG-QDs的量， 由此可確定未與Ab-AuNPs結(jié)合的IgG-QDs的量。體系RTP強度與待測樣品中人IgG濃度之間存在定量關(guān)系。因此，通過監(jiān)測體系的RTP強度，就可得出人體血清中的人IgG濃度。

3.4 分析特征量

IgG-QDs用于檢測IgG的線性范圍為1.0～10 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9943，檢出限為0.45 μg/mL（見圖5）。人IgG濃度為5.0 μg/mL時，11次重復(fù)測定的精密度為1.5%。

圖5 IgG-QDs的磷光強度隨IgG濃度的變化（A）和線性關(guān)系圖（B）

Fig.5 （A） RTP spectra of AuNPs-quenched IgG-QDs in the presence of various concentrations of IgG； （B） corresponding calibration curve

3.5 共存干擾

考察了金屬離子、陰離子、葡萄糖、氨基酸和蛋白質(zhì)等對體系RTP強度的影響（表1）。結(jié)果表明，由于人IgG與羊抗人IgG之間的特異性結(jié)合，本方法表現(xiàn)出對人IgG高的選擇性。

3.6 血清樣品中人IgG的測定

將本方法用于檢測實際人血清樣品中人IgG，加標(biāo)回收率在98%～113%之間（表2）。此外，由于采用磷光模式檢測可以消除血清樣品背景干擾，而熒光模式下血清樣品背景干擾比較明顯（圖6）。

2.1[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][]

4 結(jié) 論

制備了IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金納米粒子，利用IgG-QDs和羊抗人IgG功能化的金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，構(gòu)建了人體血清中人IgG的室溫磷光檢測新方法。本方法可有效避免基體自發(fā)熒光和基質(zhì)散射光等背景信號的干擾，可用于高選擇性檢測生物體液中的人IgG。

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