氘代替代物結合UPLC—MS/MS同步檢測去卵巢大鼠血漿中22種內源性大麻素

向世勰+徐穎+朱晶晶+王智民+張東+陳兩綿+馮偉紅

[摘要]該文旨在建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）同步檢測去卵巢大鼠血漿中22種內源性大麻素類物質的新方法。首先血漿樣品經固相小柱（SPE柱）萃取，然后利用UPLC-MS/MS進行檢測。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，以0.1%乙酸溶液為流動相A，乙腈-異丙醇（9∶1）溶液為流動相B，進行梯度洗脫，采用正離子多反應離子監(jiān)測模式，以氘代試劑作為對照品的替代物計算回收率，同步定量22種內源性大麻素。其中，22種內源性大麻素類物質的線性相關系數均大于0.99，定量限（LOQs）為0.089 6～1.965 2 nmol·L^-1；5個氘代替代物的相對回收率為11.40%～129.9%；重復性考察結果顯示，RSD均小于8.0%。所建立的方法，可以用于去卵巢大鼠血漿樣品中PGF2α EA，AEA等多種內源性大麻素類物質的定性與定量分析，驗證了該方法的可行性及實用性。總之，該方法靈敏度高、重復性好、實用性強，可以用于大鼠血漿樣品脂質代謝組學研究。

[關鍵詞]高效液相色譜-串聯(lián)質譜； 內源性大麻素； 氘代替代物

[Abstract]A new method based on ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS） was developed for the simultaneous determination of 22 endocannabinoids（eCBs） and relevant compounds in ovariectomized rat plasma. After being extracted by solid-phase column（SPE）， the plasma samples were detected by using UPLC-MS/MS. Analysis was carried out with ACQUITY UPLC BEH C18 column. The mobile phase was 0.1% acetic acid solution（A）-acetonitrile and isopropanol（9∶1， B） for the gradient elution. In the positive ion multiple reaction monitoring（MRM） mode， deuterated reagents were taken as standard alternatives to calculate recoveries and simultaneously quantify 22 endocannabinoids. The established method provided a good linearity for the 22 eCBs， and their linearly dependent coefficients were all higher than 0.99. The limits of quantitation（LOQs） ranged from 0.089 6 to 1.965 2 nmol·L^-1. Relative recoveries of 5 deuterated surrogates ranged between 11.40% and 129.9%. The repeatability study results showed that RSD was all less than 8.0%. The established method could be used to analyze PGF2a EA， AEA and other endogenous cannabinoids in plasma samples of ovariectomized rats. In summary， this method was proved to boast a high sensitivity， repeatability and practicability， and thus could be used in rat plasma lipid metabolomics study.

[Key words]UPLS-MS/MS； endocannabinoids； deuterated surrogate

doi：10.4268/cjcmm20162122

內源性大麻素（endocannabinoids，eCBs）作為內源性脂質介質，能結合和激活大麻素受體（CB1與CB2），在各種不同的生理和病理過程中具有重要作用。與神經保護、記憶、腫瘤、肥胖、免疫功能調節(jié)和心血管系統(tǒng)疾病等多種病理、藥理作用均有關^[1]。eCBs主要是N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamine）和2-花生四烯酸甘油（2-AG）2種（化學結構見圖1），還包括長鏈飽和或不飽和脂肪酰胺、酯和醚等不同種類，如：O-花生四烯酸乙醇胺（O-arachidonoyl ethanolamine，O-AEA）^[2]，2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoyl glycerol ether，2-AGE）^[3]和N-花生四烯酸多巴胺（N-arachidonoyl dopamide，NADA）^[4]等。其中AEA和2-AG的生物活性最強，且兩者均是環(huán)加氧酶（COX-2）作用的底物，在COX-2的氧化下分別形成不同于經典前列腺素的新型前列腺素，如前列腺素甘油酯（prostaglandin glycerol esters， PG-Gs）和前列腺素乙醇胺（prostaglandin ethanolamides， PG-EAs）^[5]。PG-Gs包括PGE2-G，PGI2-G，PGD2-G，PGF2α-G和TXA2-G。而PG-EAs由PGE2-EA，PGI2-EA，PGD2-EA，PGF2α-EA和TXA2-EA等組成。

目前，生物樣品中內源性大麻素及其代謝產物的分析方法主要有液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV），液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FD）^[6-8]，氣相色譜-質譜法（GC-MS）^[9-10]，氣相色譜串聯(lián)質譜法（GC-MS/MS）^[11]，液相色譜-質譜法（LC-MS）^[12-13]，液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）^[14-16]等。內源性大麻素在生物樣品中含量很低，而且其化學結構特殊，缺乏必需的發(fā)色基團或熒光基團，因此不適于使用紫外或熒光檢測器進行分析。GC-MS和GC-MS/MS分析前一般要求樣品具有較好的揮發(fā)性，且前處理過程復雜，樣品回收率低，不適用于生物樣品等熱不穩(wěn)定物質的分析。目前，LC-MS和LC-MS/MS仍然是分析生物樣品中內源性大麻素及其主要代謝產物的最主要方法。因此，本文采用LC-MS/MS分析技術，采用固相小柱萃取樣品前處理方法，并首次使用氘代試劑作為對照品的替代物計算回收率，建立了一種基于UPLC-MS/MS同時定性/定量檢測去卵巢大鼠血漿中多種內源性大麻素類物質的新方法。

1 材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AB 5500三重四級桿質譜儀（美國AB SCIEX公司）；臺式高速冷凍離心機（TGL 20MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）；METTLER TOLEDO XSE 105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；QL-901型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PSAN-8氮氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術研究所）；GM-1.0A兩用型隔膜真空泵（天津津騰公司）；Visiprep 24管防交叉污染固相萃取裝置（美國Supelco公司）；Oasis HLB 1cc（10 mg）固相萃取小柱（美國Waters公司）。甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸（色譜純，美國Fisher公司）；抗氧化劑BHT/EDTA（美國Sigma公司）；甘油（美國Sigma公司）；內源性大麻素類對照品（美國Cayman公司）。試驗用水均為Milli-Q純水儀制得的雙蒸水（德國默克密理博公司）。樣品為去卵巢組、假手術組、陽性給藥組、七寶美髯方給藥組（低、中、高劑量）大鼠血漿。

2 方法

2.1 對照溶液的配制 內標1-cyclohexyl urea 3-dodecanoic acid（CUDA）溶液的配制：精密稱取一定量的CUDA于5 mL量瓶中，甲醇定容，作為內標儲備液。精密量取上述內標儲備液21 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容，制備終濃度為6 167.40 nmol·L^-1的CUDA內標溶液A，精密量取CUDA內標溶液A 160 μL于10 mL量瓶中，甲醇-乙腈（1∶1）定容，制備得到終濃度為100 nmol·L^-1的CUDA內標溶液B，-80 ℃冰箱保存，備用。

內源性大麻素氘代替代物混合液的配制：精密吸取一定量的d8-NA-Gly，d5-2-AG，d4-PGF2α EA，d4-PEA，d8-AEA原液于同一5 mL量瓶中，甲醇定容，得到各物質終濃度分別為6.49，6.26，6.23，6.59，6.19 μmol·L^-1，作為混合氘代儲備液C，-80 ℃冰箱保存，備用。精密量取1.6 mL上述混合氘代儲備液于10 mL量瓶中，甲醇定容，制備終濃度為1 000 nmol·L^-1的氘代替代物混合液D，-80 ℃冰箱保存，備用。

內源性大麻素混合對照品溶液的配制：分別精密稱取適量的PEA，SEA等7種內源性大麻素類對照品，甲醇定容，配成單標溶液，備用。分別精密量取適量上述7種單標溶液以及LEA，αLEA等15種對照品原液于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，得到22個內源性大麻素混合對照品儲備液。分別精密吸取上述內源性大麻素混合對照品儲備液3，1，0.3，0.08，0.008，0.001 mL，置于10 mL量瓶中，再分別加入適量且等量的CUDA內標溶液A，氘代替代物混合液C，甲醇定容，使各濃度梯度混合對照品溶液中CUDA內標和氘代替代物混合液的終濃度都為100 nmol·L^-1，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.2 樣品預處理 固相萃取小柱（SPE柱）的準備：分別使用乙酸乙酯1 mL，甲醇2 mL對SPE柱進行活化，然后用2 mL酸水溶液1（0.1%乙酸水-甲醇 95∶5）對其進行平衡，備用。樣品的準備：精密量取血漿樣品100 μL，分別加入抗氧化劑（0.1 g·L^-1BHT-EDTA 1∶1）5 μL，5種氘代替代物混合液C 10 μL（濃度為1 000 nmol·L^-1），混合均勻后，備用。

樣品的處理：上樣，加入1 mL酸水1稀釋，在自身重力作用下自然洗脫；加入酸水溶液2（0.1%乙酸水-甲醇 7∶3）1 mL，在自身重力作用下自然洗脫；連續(xù)抽真空20 min，棄去濾液；分別使用甲醇0.2 mL，乙腈0.5 mL，乙酸乙酯0.7 mL依次沖洗小柱，合并濾液，并加入20%甘油甲醇溶液10 μL，氮氣吹干，殘留物用100 μL CUDA內標溶液B復溶，6 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.3 液相色譜及質譜條件 色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm， Part No.186002352）；流動相：A相為0.1%乙酸水，B相為乙腈-異丙醇 9∶1，梯度洗脫，0～0.25 min，25%B，0.25～0.5 min，25%～40%B，0.5～1.5 min，40%～50%B，1.5～3 min，50%～55%B，3～3.5 min，55%～80%B，3.5～8 min，80%～85%B，8～9 min，85%～95%B，9～9.25 min，95%B，9.25～9.35 min，95%～100%B，9.35～10.35 min，100%B，10.35～10.5 min，100%～25%B，10.5～12 min，25%B，流速0.25 mL·min^-1；柱溫60 ℃；進樣量5 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描模式為正離子多反應離子監(jiān)測（MRM），檢測窗口時間范圍為0～12 min；碰撞氣（CAD）為9 psi（1 psi=6.895 kPa），霧化氣（Gas 1）為40 psi，輔助加熱氣（Gas 2）為40 psi，氣簾氣（CUR）為30 psi，離子源溫度（TEM）為500 ℃，噴霧電壓（IS）為-4 500 kV。使用Analyst 1.6軟件進行數據采集及處理。

2.4 精密度試驗 按照2.1項下方法操作，配制一定濃度的混合對照品溶液，同1 d連續(xù)進樣3次，記錄氘代替代物的峰面積，計算相對標準偏差。

2.5 回收率試驗 本試驗采用氘代替代物計算回收率。按照2.2項下方法操作，記錄樣品中氘代替代物的峰面積A，按照2.1項下方法操作，配制一定濃度的混合對照品溶液，檢測并記錄純溶劑中氘代替代物的峰面積B，通過比較相同量的氘代替代物在實際樣品與純溶劑中的峰面積之比來考察回收率，即提取回收率=A/B×100%。

3 結果

3.1 方法專屬性 分別取加標樣品溶液在上述液相色譜-質譜條件下進行檢測，22種內源性大麻素、5種氘代替代物及1種內標的提取離子色譜圖見圖2。d4-PGF2αEA作為PGF2α EA，PGE2 EA，PGD2 EA，PGF2α 1G，PGE2 1G的內標，d8-AEA作為AEA，LEA的內標，d5-2-AG作為2-AG的內標，d8-NA-GLY作為NA-Gly，Dihomo GLA EA，1-AG，2-LG的內標，d4-PEA則為22個中除以上幾種內源性大麻素的內標。

3.2 標準曲線與定量限 按上述色譜質譜條件測定所配制的系列對照溶液，標準曲線以待測物濃度為橫坐標，待測物與內標峰面積的比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸運算，求得直線回歸方程，線性方程、相關系數及線性范圍見表1。以大于10倍信噪比（S/N）得出22種內源性大麻素類的定量限。

3.3 精密度和回收率 配制一定質量濃度的混合對照品溶液，同1 d連續(xù)進樣3次，記錄氘代替代物峰面積，計算3次不同測定值的相對標準偏差，結果顯示，日內精密度的RSD低于8.0%。通過比較相同量的氘代替代物在實際樣品與純溶劑中的峰面積之比來考察回收率，結果顯示，除d8-NA-Gly與d4-PEA回收率較低外，其他氘代替代物回收率都在80%以上，結果見表2。

3.4 方法的應用 用上述方法定性定量分析了去卵巢組、假手術組、陽性給藥組、七寶美髯方給藥組（低、中、高劑量組）大鼠血漿中的內源性大麻素類代謝產物。各組中22種內源性大麻素類的含量結果見圖3。在對內源性大麻素類物質定量分析的基礎上，采用SIMCA-P 12.0軟件，對所測樣品數據進行主成分分析（PCA）與偏最小二乘判別（PLS-DA）分析，見圖4。試驗結果表明，共定性檢測到PGF2a EA，PGF2a 1G，αLEA，DHEA，AEA，LEA，2-AG，dihomo GLA EA，1-AG，2-LG，1-LG，PEA，DEA，OEA，NO-Gly，1-OG，SEA等17種內源性大麻素類物質，其中對PGF2a EA，AEA，LEA，1-AG，2-LG，1-LG，OEA，1-OG，SEA等8種物質進行了定量分析。其中1-OG，2-LG，1-LG含量相對較高；且去卵巢組內源性大麻素明顯高于其他組。PCA分析與PLS-DA判別分析中可知，去卵巢組與假手術組明顯聚為2類，經七寶美髯方給藥治療后，各組中內源性大麻素的成分有不同變化，且給藥劑量越高，越接近陽性給藥組與假手術組，這些結果表明七寶美髯方具有雌激素樣作用，能改善脂質代謝，降低血漿中內源性大麻素的含量。

4 討論

4.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 目前血漿樣品的前處理方法有蛋白質沉淀法和固相萃取法，蛋白質沉淀法又叫液液萃取法，其優(yōu)點是操作簡單、快速，缺點是在使用有機溶劑沉淀血漿中蛋白質的同時，部分待測物會包裹其中，與蛋白發(fā)生共沉淀，造成待測物的損失。固相萃取法具有回收率高、除雜效果好等優(yōu)點，不足的是操作相對復雜，而且成本較高。試驗比較了利用乙腈、甲醇等作為萃取劑的蛋白質沉淀法和固相萃取法，結果表明固相萃取法對極性較大的內源性大麻素類物質（如DHEA，AEA，LEA）有較高的萃取率，而經乙腈和甲醇處理后的樣品中，這3種物質損失較為嚴重。綜合考慮，選擇固相萃取進行樣品前處理的方法。

4.2 應用氘代替代物 進行內源性物質的檢測與分析時，如何準確的計算回收率是一個必須解決的問題。如果采用常規(guī)的對照品法進行回收率計算，樣品中自身存在的內源性目標分析物會干擾回收率的結果，無法計算得到真實的樣品回收率。尤其是當樣品中分析物濃度比較低的時候，干擾更大，其回收率計算值往往會高于100%。本試驗采用氘代對照品替代實際對照品，進行回收率的考察，有效解決了上述干擾問題。氘代對照品的優(yōu)勢在于它們在樣品中不存在，不受樣品中本底的干擾，其化學結構、化學性質以及質譜裂解方式均與實際對照品相似，可以用來代替對照品計算回收率。同時還可以有效地消除基質的干擾，降低基質效應的影響，簡化試驗過程。另外，本試驗氘代替代物回收率試驗與樣品測定試驗同步進行，所有樣品信息只需采集1次，在完成樣品測定的同時，也采集到回收率數據，大大提高了試驗效率，也降低了試驗

成本，為內源性物質代謝組學的方法學研究提供了一個新的思路。

[參考文獻]

[1]Zhou G H， Jin S N， Wen J F. The endocannabinoid system in regulation of cardiovascular function [J].Chin Pharmacol Bull， 2011， 27（7）：903.

[2]Porter A C， Sauer J M， Knierman M D， et al. Characterization of a novel endocannabinoid， virodhamine， with antagonist activity at the CB1 receptor [J]. Pharmacol Exp Ther， 2002， 301： 1020.

[3]Hanus L， Abu-Lafi S， Fride E， et al. 2-arachidonyl glyceryl ether， an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98： 3662.

[4]Bisogno T， Melck D， Bobrov M， et al.N-acyl-dopamines： novel synthetic CB（1） cannabinoid-receptor ligands and inhibitors of anandamide inactivation with cannabimimetic activity in vitroandin vivo[J]. Biochem， 2000， 315： 817.

[5]Kozak K R， Prusakiewicz J L， Marnett L J. Oxidative metabolism of endocannabinoids by COX-2 [J]. Curr Pharmaceut Design， 2004， 10： 659.

[6]Arai Y， Fukushima T， Shirao M， et al. Sensitive determination of anandamide in rat brain utilizing a coupled-column HPLC with fluorimetric detection[J].Biomed Chromatogr， 2000， 14：118.

[7]Pisani A， Fezza F， Galati S， et al. High endogenous cannabinoid levels in the cerebrospinal fluid of untreated Parkinson′s disease patients [J]. Ann Neurol， 2005， 57： 777.

[8]Schmidt A， Brune K， Hinz B. Determination of the endocannabinoid anandamide in human plasma by high performance liquid chromatography [J]. Biomed Chromatogr， 2006， 20： 336.

[9]Di Marzo V， Breivogel C S， Tao Q， et al. Levels， metabolism， and pharmacological activity of anandamide in CB（1） cannabinoid receptor knockout mice： evidence for non-CB（1），non-CB（2） receptor-mediated actions of anandamide in mouse brain [J]. Neurochem， 2000， 75： 2434.

[10]Obata T， Sakurai Y， Kase Y， et al. Simultaneous determination of endocannabinoids （arachidonylethanolamide and 2-arachidonylglycerol） and isoprostane （8-epiprostaglandin F2alpha） by gas chromatography-mass spectrometry-selected ion monitoring for medical samples [J]. J Chromatogr B， 2003， 792： 131.

[11]Zoerner A A， Gutzki F M， Suchy M T， et al. Targeted stable-isotope dilution GC-MS/MS analysis of the endocannabinoid anandamide and other fatty acid ethanol amides in human plasma [J]. J Chromatogr B， 2009， 877：2909.

[12]Annuzzi G， Piscitelli F， Di Marino L， et al. Differential alterations of the concentrations of endocannabinoids and related lipids in the subcutaneous adipose tissue of obese diabetic patients [J]. Lipids Health Dis， 2010， 9： 43.

[13]Di Marzo V， Verrijken A， Hakkarainen A， et al. Role of insulin as a negative regulator of plasma endocannabinoid levels in obese and nonobese subjects [J]. Eur J Endocrinol， 2009， 161： 715.

[14]Salomé Gachet M， Gertsch Jürg. Quantitative analysis of arachidonic acid， endocannabinoids，N-acylethanolamines and steroids in biological samples by LC-MS/MS： fit to purpose [J]. J Chromatogr B， 2016， 1012： 215.

[15]Qi Ming， Morena Maria， Vecchiarelli Haley A， et al. A robust capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for quantitation of neuromodulatory endocannabinoids [J].Rapid Commun Mass Spectrom， 2015， 29：1889.

[16]Amoako A A， Marczylo T H， Lam P M， et al. Quantitative analysis of anandamide and related acylethanolamides in human seminal plasma by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. J Chromatogr B， 2010， 878： 3231.

[責任編輯 曹陽陽]