• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于UPLC—Q—TOF—MS技術(shù)的牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的代謝組學(xué)研究

    2017-02-16 14:10顧媛媛張丹丹馮程王宇陳大忠王艷
    中國中藥雜志 2016年21期
    關(guān)鍵詞:生物標(biāo)志物代謝組學(xué)

    顧媛媛+張丹丹+馮程+王宇+陳大忠+王艷宏

    [摘要]運用代謝組學(xué)技術(shù),研究牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)大鼠與正常生理狀態(tài)大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)代謝的變化,篩選出與過敏反應(yīng)相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物,進而分析其代謝通路,探討過敏反應(yīng)的代謝機制。采用牛血清白蛋白誘導(dǎo)大鼠發(fā)生過敏反應(yīng)為模型,檢測大鼠血清中組胺和類胰蛋白酶的含量,對大鼠肺和氣管的組織形態(tài)學(xué)進行觀察,通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對過敏反應(yīng)模型組和空白對照組大鼠尿液進行代謝組學(xué)分析,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘辨別分析

    (PLS-DA)的方法,觀察2組大鼠尿液的代謝輪廓差異,篩選出差異代謝物。模型組和對照組的代謝譜圖存在明顯差異,并篩選出與過敏反應(yīng)相關(guān)的14個差異代謝物,4條主要代謝通路。該文建立了基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)進行牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的大鼠尿液代謝組學(xué)研究方法,推測牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的作用機制可能涉及異黃酮、葉酸的生物合成,色氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝等過程,為進一步探索代謝組學(xué)在藥物過敏反應(yīng)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞]牛血清白蛋白; 生物標(biāo)志物; 代謝組學(xué); 過敏反應(yīng)

    [Abstract]The metabonomic techniques were used to study the changes in endogenous metabolites between urines of rats in normal physiological conditions and bovine serum albumin induced allergic reactions, identify potential biomarkers associated with allergic reactions, and then analyze the metabolic pathways and the metabolic mechanisms of allergic reactions. The bovine serum albumin-induced allergic reactions in rats were adopted as a model to detect histamine and tryptase in rat serum and observe the issue morphology of lungs and trachea in rats. UPLC-Q-TOF-MS was applied in metabonomic analysis on urines between control group and allergic reaction model group. Principal component analysis(PCA) and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) were applied to observe the differences in metabolic profiling between urines of the two groups and select differential metabolites. There were significant differences in metabolism spectrum between the model group and the control group. Totally 14 differential metabolites and 4 major metabolic pathways were screened out. The metabonomic research method for urines of rats with bovine serum albumin-induced allergic reactions based on UPLC-Q-TOF-MS was established in this study. It was speculated that the mechanism of bovine serum albumin-induced allergic reactions may involve biosynthesis of isoflavone and folic acid and metabolism of tryptophan, nicotinic acid and nicotinamide. It lays a foundation for further exploration of the application of metabolomics in drug allergy reaction studies.

    [Key words]bovine serum albumin; biomarker; metabolomics; allergic reaction

    doi:10.4268/cjcmm20162123

    過敏反應(yīng)又稱變態(tài)反應(yīng),是指機體受同一抗原再次刺激后產(chǎn)生的一種異?;虿±硇悦庖叻磻?yīng),主要表現(xiàn)為生理功能紊亂和組織損傷。過敏反應(yīng)是臨床常見的不良反應(yīng),大多數(shù)藥物都有可能引起過敏反應(yīng),嚴(yán)重影響人類的健康,其危害不容忽視。隨著新藥涌現(xiàn)、藥物的不合理應(yīng)用等原因,藥物過敏反應(yīng)發(fā)生率一直居高不下。尤其是中藥注射劑在臨床的廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)(ADR)報道也逐年增加,尤以過敏反應(yīng)事件較多。然而過敏反應(yīng)機制并未完全明確[1-3]

    代謝組學(xué)是一種后基因時代的全新組學(xué)技術(shù),以生物體內(nèi)低相對分子質(zhì)量物質(zhì)的動態(tài)規(guī)律變化。是從整體觀出發(fā),以機體代謝組學(xué)變化為載體,以時空動態(tài)性和全局性觀點,全面解析疾病對機體的影響[4-6]。

    本試驗應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù),以牛血清白蛋白誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生過敏反應(yīng)動物模型為研究對象,分析過敏反應(yīng)引起的機體代謝狀態(tài)和內(nèi)源性小分子代謝物的變化,通過比較這些代謝物的變化情況,尋找與過敏反應(yīng)密切相關(guān)的生物標(biāo)記物和代謝通路,進而探討過敏反應(yīng)的代謝機制,為中藥注射劑的臨床安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑 美國Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀(包括四元梯度泵,在線真空脫氣機,自動進樣器,二極管陣列檢測器,柱溫箱);美國Micromass Q-TOF microTM四極桿-飛行時間質(zhì)譜(電噴霧離子源-正、負離子掃描方法-Lockspray);色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,Waters Corp,Milford USA);KDC-160 HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);酶標(biāo)儀(賽默飛世爾中國上海儀器有限公司);超低溫冰箱(Thermo);KQ5200 E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JA 2003精密電子天平(上海良平儀器廠)。

    牛血清白蛋白BSA(美國,Sigma公司);0.9%氯化納注射液(中國浙江都邦藥業(yè)股份有限公司);大鼠血清組胺檢測試劑盒(中國上海藍基生物科技有限公司);胰蛋白(中國北京索萊寶科技有限公司);色譜級乙腈(美國Fisher公司),屈臣氏蒸餾水(中國廣州屈臣氏食品有限公司),色譜級甲酸(中國天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),亮氨酸-腦啡肽(美國Sigma公司)。

    1.2 動物分組與造模 健康SD雄性大鼠(SPF級),體重(200±20) g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供,動物使用編號SYXK(黑)2013-012。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水,且控制室內(nèi)溫度為(22±1) ℃、相對濕度40%~50%。12 h蔽光,12 h光照,自由飲水飲食,每只大鼠單獨代謝籠正常飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開始試驗。

    16只大鼠隨機分為空白對照組和模型組,大鼠腹腔注射致敏,隔日1次,連續(xù)注射3次。于首次致敏后第14天和第21天對大鼠進行尾靜脈注射激發(fā)給藥,對照組給予同樣體積的0.9%氯化鈉注射液,即刻至30 min觀察大鼠出現(xiàn)的體征表現(xiàn)。每組給藥情況為空白對照組:致敏給予生理鹽水1.0 mL/只,激發(fā)給予生理鹽水2.0 mL/只;模型組:致敏給予0.6%的BSA,1.0 mL/只,激發(fā)給予2.4%的BSA,2.0 mL/只[7-8]。

    1.3 生化指標(biāo)檢測 按大鼠Histamine ELISA檢測試劑盒說明書進行操作,檢測大鼠血清組胺含量。采用專屬性底物法檢測類胰蛋白酶。

    1.4 組織病理學(xué)檢查 于最后一次收集完尿液,將大鼠麻醉,取固定部位肺和氣管組織,置于4%多聚甲醛液中固定,常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水、透明、封片,普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

    1.5 樣本的預(yù)處理與UPLC-Q-TOF-MS分析條件[9-11] 于每次給藥第2天7:00—8:00收集每只大鼠12 h內(nèi)的尿樣,13 000 r·min-1(4 ℃)離心15 min,過0.22 μm微孔濾膜后進樣檢測。第14天和第21天給藥激發(fā)后30 min于眼靜脈叢采血,室溫放置30 min,3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    色譜條件:ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm,Waters Corp,Milford USA);流動相A為乙腈,B為0.1%甲酸水,梯度洗脫,0~8 min,2%~40% A,8~10 min,40%~98% A,10~13 min,98%~100% A;柱溫40 ℃;流速0.3 mL·min-1。

    質(zhì)譜條件:美國Micromass Q-TOF microTM四極桿-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng),電噴霧電離源(ESI),采用正負離子掃描檢測;脫溶劑溫度為350 ℃,錐孔流速為20 L·h-1;毛細管電壓正離子掃描為 1 300 V,負離子掃描為 1 500 V;樣品錐孔電壓60 V;提取錐孔電壓5.0 V;離子源溫度為110 ℃;碰撞能30 V;碰撞氣為氬氣;準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽溶液(556.277 1[M+H]+,554.261 5[M-H]-),掃描范圍m/z 100~1 500。

    1.6 數(shù)據(jù)處理 目前,代謝組學(xué)海量數(shù)據(jù)處理是通過現(xiàn)代化學(xué)信息學(xué)和生物統(tǒng)計學(xué)領(lǐng)域的新方法對獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進行降維和信息挖掘[12]。將空白對照組和模型組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx軟件進行色譜峰識別以及峰匹配,并采用PCA對獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進行降維處理,同時采用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對獲得的復(fù)雜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對差異性代謝物進行二級質(zhì)譜分析,解析生物標(biāo)志物及相關(guān)的代謝通路。

    2 結(jié)果

    2.1 宏觀體征 在3次致敏過程中模型組大鼠與空白對照組的一般情況無明顯差異,尾靜脈激發(fā)給藥后,模型組大鼠均出現(xiàn)了明顯的精神萎糜、活動減少、哮喘、痙攣等過敏反應(yīng)癥狀,但無動物死亡;而空白對照組大鼠無明顯的過敏反應(yīng)癥狀。

    2.2 生化指標(biāo)和病理切片 與空白對照組進行比較,模型組大鼠組胺和類胰蛋白酶含量增加,且均具有顯著性差異(P<0.01),具體見表1,2。

    細胞層完整,固有層可見膠原纖維和彈性纖維,可見血管、淋巴管以及淋巴組織。軟骨環(huán)完整。模型組氣管黏膜層和黏膜下層增厚,大部分假復(fù)層纖毛上皮細胞和固有層消失,細胞嗜堿性增強,見圖1。

    空白對照組肺組織結(jié)構(gòu)完好;模型組肺動脈血管見有擴張淤血,大部分肺泡組織不張,肺泡隔增厚,有散在的炎細胞,見圖2。

    2.3 大鼠尿液UPLC-TOF-MS代謝輪廓和整體表征 2組大鼠第2次激發(fā)給藥后12 h尿液代謝產(chǎn)物利用ESI正離子模式分別采集對照組和模型組大鼠尿液樣本數(shù)據(jù),得到尿液樣本的BPI圖。在優(yōu)化的分析條件下,正負離子掃描模式13 min的有效洗脫時間內(nèi)獲得較好的分離和響應(yīng)效果,結(jié)果見圖3,4。

    2.4 數(shù)據(jù)分析 對尾靜脈第2次激發(fā)后12 h大鼠尿液進行檢測分析,用Markerlyns XS軟件進行數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息的獲取,進行Pareto模式的PCA,采用OPLS-DA對2組尿液代謝物組進行分析,得到反應(yīng)組間變化的Scores plot,見圖5,6。在正、負離子掃描模式下,2組聚類分組明顯,代謝物表型差異顯著,表明模型組內(nèi)源性代謝物的含量發(fā)生了很大變化,說明給予牛血清白蛋白后大鼠正常生理代謝紊亂,從代謝物組變化的角度可證明牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)模型造模成功。

    2.5 表征過敏反應(yīng)標(biāo)志物的篩選及結(jié)構(gòu)鑒定 對空白組和模型組大鼠尿液進行OPLS-DA分析,對VIP>2的差異變量進行色譜峰提取并積分,進行非參數(shù)t檢驗,篩選P<0.05的數(shù)據(jù)變量得到有意義的生物標(biāo)志物,對其進行結(jié)構(gòu)解析,確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。采用MS/MS測定標(biāo)記物的精確信息,得到測定誤差范圍內(nèi)相應(yīng)的可能的化學(xué)物分子式;通過分子式及相對分子質(zhì)量在HMDB及KEGG等檢索數(shù)據(jù)庫進行檢索,結(jié)合MS/MS選出可能的1種或幾種化合物,最終通過色譜保留行為以及MS/MS數(shù)據(jù)來確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu),在正離子檢測模式下,初步鑒定了8個生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu),在負離子檢測模式下,初步鑒定了6個生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu),具體見表3,4,分別為mahanimbinine,15-oxo-lipoxin A4,3-methyldioxyindole, isopentenyladenine-9-N-glucoside serinyl-valine, 7, 8-dihydroneopterin, 1-methylguanosine, norcotinine, 2′-hydroxydaidzein, 4, 6-dihydroxyquinoline,N-nitrosothialdine, alanyl-hydroxyproline, pterin, nicotinamide riboside。將鑒定出的標(biāo)志物輸入MPetA數(shù)據(jù)庫中,構(gòu)建分析代謝通路,見表3,4。

    3 討論

    經(jīng)前期試驗摸索,從宏觀體征、生化指標(biāo)和肺、氣管的病理指標(biāo)判斷,過敏反應(yīng)動物模型造模成功,本研究進一步運用代謝組學(xué)方法結(jié)合UPLC-MS分析技術(shù),研究過敏反應(yīng)大鼠尿液中小分子內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律,并篩選出貢獻大的且有差異的特征性標(biāo)志物,初步判定14個生物標(biāo)記物[13],在對這些標(biāo)記物的研究發(fā)現(xiàn)15-oxo-lipoxin A4是脂氧素衍生物。脂氧素(LXS)和阿司匹林觸發(fā)脂氧素(ATL)是由花生四烯酸產(chǎn)生的促炎脂質(zhì)衍生的介質(zhì),在結(jié)構(gòu)、形式和功能上區(qū)別于許多其他促炎脂質(zhì)衍生的介質(zhì)[14]。脂氧素A4(LXA4)引發(fā)細胞反應(yīng),并通過激活特異受體ALX調(diào)節(jié)白細胞在體內(nèi)的運輸,通過花生四烯酸(AA2)衍生的類二十烷酸,包括前列腺素(PG)和白三烯(LTs),對發(fā)揮局部免疫過敏和炎癥反應(yīng)具有重要作用。在本次試驗中發(fā)現(xiàn)模型組5-氧代脂氧素A4有增加趨勢,表明大鼠體內(nèi)5-氧代脂氧素A4代謝發(fā)生紊亂,推測大鼠可能產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng),在過敏反應(yīng)發(fā)生的同時,也伴隨著炎癥的產(chǎn)生。

    7,8-dihydroneopterin是通過用γ干擾素在刺激人單核細胞衍生的巨噬細胞產(chǎn)生,曾在病毒感染和自身免疫性疾病人體體液中發(fā)現(xiàn)。該試驗?zāi)P徒M大鼠尿液中7,8-dihydroneopterin有上調(diào)趨勢,推測大鼠可能產(chǎn)生免疫應(yīng)激反應(yīng)。

    3-methyldioxyindole是乙醛脫氫酶的一個代謝物,在代謝中形成,是主要的尿代謝物。有學(xué)者認為,3-甲基吲哚的體內(nèi)氧化產(chǎn)物是色氨酸的代謝產(chǎn)物,通過在結(jié)腸中的細菌產(chǎn)生的[15]。

    4,6-dihydroxyquinoline是在單胺氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化而來,是5-羥色氨酸的代謝通路轉(zhuǎn)化而來,5-羥色氨酸是5-羥色胺的前體物質(zhì),查閱文獻[13]發(fā)現(xiàn)5-羥色胺能促進下丘腦釋放神經(jīng)遞質(zhì)的作用,故說明下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的分泌被抑制。

    pterin涉及到葉酸的生物合成通路,在此通路中pterin因主要合成葉酸而呈下調(diào)趨勢。葉酸的抗氧化應(yīng)激作用引起活性氧化基因(自由基、過氧化物等)的產(chǎn)生和抗氧化防御之間的失衡。最近有報道發(fā)現(xiàn),過敏性反應(yīng)和氧化應(yīng)激分子存在十分重要的關(guān)系。過敏性反應(yīng)時,肥大細胞激活后,刺激免疫系統(tǒng)(immune system),可以激活肥大細胞的活性氧(ROS),體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì),并通常作為氧化劑。

    綜上所述,本試驗通過對特征性生物標(biāo)志物進行分析,發(fā)現(xiàn)并鑒定了14個潛在生物標(biāo)志物,并且呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢,這些生物標(biāo)志物主要與異黃酮、葉酸的生物合成,色氨酸、煙酸和煙酰胺的代謝等通路相關(guān)。通過對所述標(biāo)志物的代謝軌跡變化,探討過敏反應(yīng)的產(chǎn)生、發(fā)展過程,進而從機體代謝通路異常來初步了解牛血清白蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的代謝機制。下一步筆者將對其他生物標(biāo)志物與過敏反應(yīng)的具體聯(lián)系進行深入研究,為避免藥物的過敏反應(yīng)提供理論支持。

    [參考文獻]

    [1]Rajan T V. The gell-coombs classification of hypersensitivity reactions a re-interpretation[J]. Trends Immunol, 2003, 24(7): 376.

    [2]Simons F E,Ardusso L R,Bilò M B,et al.World allergy organization guidelines for the assessment andmanagement of anaphylaxis[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2011, 4(2):13.

    [3]Uetreeht J.Role of animal models in the study of drug-indueed hypersensitivity reactions[J]. AAPS J, 2006, 7(4): 914.

    [4]Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. "Metabonomics": understanding the metabolic responses of living systems topathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181.

    [5]Kristin E P,Craig E L,Cynthia K L. Development of tissue-targeted metabonomics: part 1. Analytical considerations[J]. J Pharm Biomed Anal, 2008, 46(4): 737.

    [6]Fiehn O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modeling to understand metabolic networks[J]. Comp Funct Genom, 2001, 2(3): 155.

    [7]吳公平,王蓉蓉,田洪,等.過敏反應(yīng)動物模型的代謝組學(xué)研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2011, 21(23): 2847.

    [8]徐國良,張卓輝,張增珠,等.雙黃連注射劑過敏癥動物模型的研究[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2008, 13(2):154.

    [9]劉雙梅,李桂林,湯曉麗,等.甲基蓮心堿對2 型糖尿病模型大鼠作用的代謝組學(xué)研究[J].中國藥理學(xué)通報, 2012, 28 (4): 490.

    [10]袁琳,白永生,周明眉,等.2型糖尿病大鼠的尿液代謝組學(xué)改變[J].中國實驗動物學(xué)報,2011,19(2): 111.

    [11]王蓉蓉,劉曉娟,蔣秋桃,等.基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜的急性過敏反應(yīng)代謝組學(xué)研究[J].藥物分析雜志,2013, 33(7): 1127.

    [12]盧芳,楊曉丹,井月娥,等.基于代謝組學(xué)的刺五加多糖對大鼠心臟內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響[J].中藥材,2011, 21(23):2847.

    [13]張愛華,孫暉,周小航,等.基于方證代謝組學(xué)的金匾腎氣丸治療腎陽虛證的研究[C]. 成都:第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會,2013.

    [14]胡珊,毛應(yīng)啟梁,王彥青. 脂氧素在炎癥中作用的研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志, 2011, 38

    (2):109.

    [15]Dong H, Yan G L, Han Y. UPLC-Q-TOF/MS-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional Chinese medicine Chuanwu and the detoxification mechanisms of Gancao, Baishao, and Ganjiang[J]. Chin J Nat Med, 2015, 13(9): 687.

    [16]孫玄.大鼠尿液中蝶呤類化合物及氨基酸分析新方法的研究[D].南昌:南昌大學(xué),2015.

    [責(zé)任編輯 曹陽陽]

    猜你喜歡
    生物標(biāo)志物代謝組學(xué)
    水環(huán)境中木質(zhì)素光降解及其對有機物相關(guān)指示參數(shù)影響研究進展
    新疆維吾爾族和漢族大學(xué)生尿液代謝輪廓差異分析
    枯草芽孢桿菌代謝組樣品前處理方法的比較研究
    鎘超富集植物東南景天根系分泌物的代謝組學(xué)研究
    日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成年人免费黄色播放视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 99riav亚洲国产免费| 视频在线观看一区二区三区| 久久久国产成人免费| 久久久国产成人免费| 最新在线观看一区二区三区| 国产区一区二久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久影院123| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲精华国产精华精| 亚洲av熟女| 亚洲五月天丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 69精品国产乱码久久久| 99久久综合精品五月天人人| 黄色丝袜av网址大全| 免费不卡黄色视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级片'在线观看视频| 人妻久久中文字幕网| 国产精品永久免费网站| 99国产精品99久久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 国产99白浆流出| 亚洲电影在线观看av| 国产探花极品一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美最新免费一区二区三区 | 少妇丰满av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 88av欧美| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美在线一区亚洲| 国产淫片久久久久久久久 | 国产在线男女| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 别揉我奶头 嗯啊视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 激情在线观看视频在线高清| 精品福利观看| av在线蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av欧美777| 国产主播在线观看一区二区| 床上黄色一级片| 舔av片在线| 日韩欧美精品免费久久 | 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产精品999在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 岛国在线免费视频观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 少妇人妻精品综合一区二区 | 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲一区二区三区不卡视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 1024手机看黄色片| 日本免费a在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 九色国产91popny在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩欧美 国产精品| 久久伊人香网站| 51国产日韩欧美| 免费大片18禁| 日韩精品中文字幕看吧| 国产高清三级在线| 美女高潮的动态| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 全区人妻精品视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品影院久久| 国产免费av片在线观看野外av| www日本黄色视频网| www.色视频.com| 69av精品久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 日本在线视频免费播放| 亚洲av五月六月丁香网| 免费看a级黄色片| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人福利小说| 午夜免费激情av| 亚洲人与动物交配视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 看十八女毛片水多多多| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲成av人片在线播放无| 一区二区三区激情视频| 精华霜和精华液先用哪个| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲av一区综合| 在现免费观看毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 99久久99久久久精品蜜桃| 一区二区三区激情视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久国产乱子免费精品| 丝袜美腿在线中文| www.熟女人妻精品国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av中文乱码字幕在线| 90打野战视频偷拍视频| 免费看美女性在线毛片视频| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲人成网站高清观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲自拍偷在线| 波多野结衣高清作品| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日本一二三区视频观看| 日韩欧美免费精品| 岛国在线免费视频观看| 99久国产av精品| 国产 一区 欧美 日韩| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 草草在线视频免费看| 综合色av麻豆| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩大尺度精品在线看网址| 成年版毛片免费区| 丁香欧美五月| 国产精品爽爽va在线观看网站| 性色avwww在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 少妇的逼水好多| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲18禁久久av| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄色日韩在线| 欧美bdsm另类| 亚洲国产精品成人综合色| bbb黄色大片| 内地一区二区视频在线| 搞女人的毛片| 亚洲自拍偷在线| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 女人被狂操c到高潮| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 波多野结衣高清无吗| www.色视频.com| 黄色视频,在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲无线观看免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲内射少妇av| 精品福利观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 免费看日本二区| 精品久久久久久久久久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲精品在线观看二区| 国产av一区在线观看免费| 特大巨黑吊av在线直播| 三级毛片av免费| www.www免费av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品久久视频播放| 观看美女的网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av一区综合| 18禁在线播放成人免费| 我的老师免费观看完整版| 少妇被粗大猛烈的视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文资源天堂在线| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜久久久久精精品| 日日夜夜操网爽| 国产伦在线观看视频一区| 18+在线观看网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 97热精品久久久久久| 日韩欧美精品免费久久 | 精品午夜福利在线看| 午夜福利免费观看在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 色综合站精品国产| 久久久久久大精品| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲三级黄色毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 好男人电影高清在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产一区二区在线av高清观看| 久久九九热精品免费| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 成年人黄色毛片网站| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 美女大奶头视频| 久久久久久国产a免费观看| 1024手机看黄色片| 人人妻人人看人人澡| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜福利欧美成人| 69人妻影院| 夜夜夜夜夜久久久久| netflix在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久午夜电影| 成人av在线播放网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人永久免费在线观看视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 婷婷六月久久综合丁香| 丝袜美腿在线中文| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产精品综合久久久久久久免费| 长腿黑丝高跟| 午夜激情欧美在线| 亚洲五月天丁香| 直男gayav资源| 婷婷精品国产亚洲av| 精品国产三级普通话版| 久久久久九九精品影院| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲五月婷婷丁香| 男插女下体视频免费在线播放| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品91蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| a在线观看视频网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美最新免费一区二区三区 | 婷婷六月久久综合丁香| 十八禁人妻一区二区| 99久久成人亚洲精品观看| 小说图片视频综合网站| 免费电影在线观看免费观看| 一级作爱视频免费观看| 看片在线看免费视频| 久久久久久九九精品二区国产| 天堂动漫精品| 久99久视频精品免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲专区国产一区二区| 丰满的人妻完整版| 国产精华一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 国产野战对白在线观看| 日本免费a在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美日韩国产亚洲二区| 在线观看一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美在线黄色| 国产黄色小视频在线观看| 久久久国产成人精品二区| 搞女人的毛片| 国产不卡一卡二| 夜夜爽天天搞| 色综合欧美亚洲国产小说| 可以在线观看毛片的网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 麻豆成人av在线观看| 伦理电影大哥的女人| 亚洲中文字幕日韩| 97碰自拍视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲美女黄片视频| 黄色女人牲交| 亚洲自拍偷在线| 十八禁网站免费在线| 国产一区二区激情短视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产高清有码在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 色综合站精品国产| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 可以在线观看的亚洲视频| 日日夜夜操网爽| 久久热精品热| 观看美女的网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产精品一及| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产美女午夜福利| 国内精品一区二区在线观看| www日本黄色视频网| 69av精品久久久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲成人久久性| 一进一出好大好爽视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一a级毛片在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲专区中文字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久国产精品影院| 日韩欧美精品免费久久 | 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男插女下体视频免费在线播放| 国内精品久久久久精免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚州av有码| 一级作爱视频免费观看| 内射极品少妇av片p| www.色视频.com| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日韩欧美在线二视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美bdsm另类| 亚洲成av人片免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人国产综合亚洲| 丰满人妻一区二区三区视频av| 简卡轻食公司| 日韩国内少妇激情av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99riav亚洲国产免费| 丁香六月欧美| 五月伊人婷婷丁香| 国产真实乱freesex| 国产精品99久久久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费搜索国产男女视频| 国产探花在线观看一区二区| 一a级毛片在线观看| 观看美女的网站| 欧美中文日本在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 国产大屁股一区二区在线视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美区成人在线视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 乱人视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲成人免费电影在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 日韩欧美精品v在线| 亚洲,欧美精品.| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一区二区三区四区激情视频 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 90打野战视频偷拍视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲色图av天堂| 天堂√8在线中文| 久久草成人影院| 中文亚洲av片在线观看爽| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品永久免费网站| 日韩精品青青久久久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 美女被艹到高潮喷水动态| 2021天堂中文幕一二区在线观| 69av精品久久久久久| 亚洲三级黄色毛片| av欧美777| 欧美在线一区亚洲| 日韩欧美国产在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲美女视频黄频| 午夜激情欧美在线| av天堂中文字幕网| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 哪里可以看免费的av片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 免费搜索国产男女视频| 看片在线看免费视频| 一a级毛片在线观看| 简卡轻食公司| 麻豆成人av在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产午夜精品论理片| 97超视频在线观看视频| 日本黄色片子视频| 亚洲电影在线观看av| 国产黄色小视频在线观看| 久久久精品大字幕| 午夜福利欧美成人| 可以在线观看的亚洲视频| 一个人看的www免费观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久伊人香网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲,欧美精品.| 国产单亲对白刺激| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产av在哪里看| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕av在线有码专区| 精品一区二区免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看av片永久免费下载| 97热精品久久久久久| 免费av观看视频| 美女黄网站色视频| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜福利高清视频| 国产成人影院久久av| 91狼人影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲欧美日韩高清专用| 一区二区三区高清视频在线| 热99re8久久精品国产| 日韩成人在线观看一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品一区二区免费观看| 成人欧美大片| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费av不卡在线播放| 日本一二三区视频观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱 | av在线蜜桃| 午夜激情欧美在线| 丁香欧美五月| 精品久久久久久久久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 波多野结衣巨乳人妻| 一级毛片久久久久久久久女| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 美女高潮的动态| 草草在线视频免费看| 久久久精品大字幕| 我要看日韩黄色一级片| 欧美不卡视频在线免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久99热6这里只有精品| 国产高清激情床上av| 国产色婷婷99| a级毛片a级免费在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频| ponron亚洲| 国产单亲对白刺激| 亚洲av.av天堂| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 搡老妇女老女人老熟妇| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲成人久久爱视频| 一级a爱片免费观看的视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 韩国av一区二区三区四区| 欧美黑人巨大hd| 我的老师免费观看完整版| 最新在线观看一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人av教育| av欧美777| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品女同一区二区软件 | 免费av不卡在线播放| 一区二区三区四区激情视频 | 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品99久久久久久久久| 一本久久中文字幕| 91字幕亚洲| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 少妇的逼好多水| 亚洲最大成人中文| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品一区av在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| a级毛片免费高清观看在线播放| 伦理电影大哥的女人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 美女免费视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 又紧又爽又黄一区二区| x7x7x7水蜜桃| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品三级大全| 午夜日韩欧美国产| 夜夜爽天天搞| 好男人电影高清在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 一二三四社区在线视频社区8| 色5月婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 男女下面进入的视频免费午夜| av专区在线播放| av视频在线观看入口| 悠悠久久av| 校园春色视频在线观看| 天堂√8在线中文| 又黄又爽又免费观看的视频| 好男人在线观看高清免费视频| www日本黄色视频网| 精品国内亚洲2022精品成人| а√天堂www在线а√下载| av天堂中文字幕网| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久中文看片网| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产老妇女一区| 成人av在线播放网站| 精品国产三级普通话版| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 丝袜美腿在线中文| 91字幕亚洲| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美日韩综合久久久久久 | 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲av成人精品一区久久| 男女之事视频高清在线观看| 不卡一级毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲不卡免费看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最新在线观看一区二区三区| www.999成人在线观看| 搞女人的毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 少妇的逼水好多| 十八禁人妻一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 91久久精品电影网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 激情在线观看视频在线高清| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费电影在线观看免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产色片| 久久这里只有精品中国| 亚洲无线观看免费| 99在线视频只有这里精品首页| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲七黄色美女视频| 成人国产一区最新在线观看| av黄色大香蕉| 日本a在线网址| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一本精品99久久精品77| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本 av在线| 18+在线观看网站| 男人的好看免费观看在线视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| a级一级毛片免费在线观看| 十八禁人妻一区二区| eeuss影院久久| 在线播放无遮挡| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品av视频在线免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 可以在线观看的亚洲视频| 黄片小视频在线播放|