鎘超富集植物東南景天根系分泌物的代謝組學(xué)研究

羅慶+孫麗娜+胡筱敏

摘 要 利用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）的代謝組學(xué)方法，尋找不同處理?xiàng)l件間差異顯著的鎘超富集植物東南景天根系分泌物質(zhì)，并探討它們對(duì)東南景天耐受或超富集鎘的可能作用機(jī)制。收集0和40 μmol/L鎘分別處理4和8天后的東南景天根系分泌物樣品，通過(guò)樣品凍干、甲醇溶解、甲氧胺鹽酸鹽和N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺衍生化處理、GC-MS檢測(cè)的分析過(guò)程，得到根系分泌物的表達(dá)譜。主成分分析和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖可將不同處理?xiàng)l件間東南景天的根系分泌物質(zhì)明顯區(qū)分，運(yùn)用OPLS-DA載荷圖、模型的變量重要性因子和方差分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)根系分泌物質(zhì)在4組間存在顯著性差異。它們的相對(duì)含量在不同處理?xiàng)l件間的變化趨勢(shì)明顯不同，表明東南景天可通過(guò)調(diào)節(jié)它們的分泌來(lái)耐受或超富集重金屬鎘。

關(guān)鍵詞 超富集植物; 東南景天; 根系分泌物; 代謝組學(xué); 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1 引 言

代謝組學(xué)是研究生物體受刺激或擾動(dòng)而引起的體內(nèi)代謝物動(dòng)態(tài)變化的科學(xué)^[1]，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物研發(fā)、毒理學(xué)及藥物作用機(jī)制研究等領(lǐng)域[2～8]。目前，代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）在代謝組學(xué)研究中有著非常重要的應(yīng)用，其方法成熟，靈敏度高，而且有許多數(shù)據(jù)檢索庫(kù)，有助于代謝物的定性分析。

根系分泌物是植物為了增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取或適應(yīng)外界環(huán)境的脅迫而通過(guò)根系向周?chē)h(huán)境分泌的小分子有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、糖等物質(zhì)，它可通過(guò)改變根際土壤的pH值與氧化還原電位（Eh）值、與重金屬發(fā)生螯合或絡(luò)合沉淀等化學(xué)反應(yīng)、影響土壤微生物的數(shù)量和活性等，直接或間接地影響重金屬在土壤中的結(jié)合形態(tài)及生物有效性^[9]。目前，對(duì)超富集植物根系分泌物的研究主要集中在檸檬酸和草酸等小分子有機(jī)酸、總有機(jī)物或總有機(jī)碳上[10～13]，而對(duì)超富集植物根系分泌物的組成成分分析及其在不同處理?xiàng)l件下的變化趨勢(shì)的研究較少。

本研究應(yīng)用基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法，分析鎘超富集植物東南景天在不同鎘處理?xiàng)l件下其根系分泌物的變化特征，尋找其可能的差異顯著的根系分泌物質(zhì)，通過(guò)這些物質(zhì)的變化趨勢(shì)來(lái)探索鎘超富集植物東南景天耐受或超富集鎘的可能作用機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TRACE GC Ultra-PolarisQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配AI/AS 3000自動(dòng)進(jìn)樣器及Xcalibur 1.4 工作站，美國(guó)ThermoFisher公司）; MG-2200氮?dú)獯祾邇x、FDU-1100真空冷凍干燥系統(tǒng)（Tokyo Rikakikai公司）。

甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）;吡啶（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）; N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N-Methyl-N-trimethylsilyl trifluoracetamide， MSTFA）、甲氧胺鹽酸鹽（Sigma公司）; 營(yíng)養(yǎng)液組成物質(zhì)及CdCl2（國(guó)藥集團(tuán)）; 實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。

2.2 植物材料和培養(yǎng)方法

以浙江省衢州市古銀礦生態(tài)型超富集型東南景天為供試植物。選擇生長(zhǎng)良好、粗細(xì)基本一致的植物材料，截取含頂芽的5 cm長(zhǎng)帶葉枝條，用300 mL黑色塑料瓶培養(yǎng)。先用去離子水進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（約4天），然后轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)（營(yíng)養(yǎng)液組成參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]）。培養(yǎng)期間，每4天更換1次營(yíng)養(yǎng)液，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl將營(yíng)養(yǎng)液調(diào)至pH 5.5，同時(shí)保持24 h通氣。連續(xù)培養(yǎng)16天，待長(zhǎng)出旺盛根系后，開(kāi)始進(jìn)行Cd處理，設(shè)2個(gè)Cd水平0和40 μmol/L，每個(gè)水平重復(fù)11次。分別收集處理4和8 d后的根系分泌物。

2.3 根系分泌物的收集和測(cè)定

將東南景天從營(yíng)養(yǎng)液中取出，去離子水沖洗根系3～5次后放入盛有50 mL去離子水的玻璃管（用黑色膠布包住遮光）中，連續(xù)收集6 h根系分泌液。根系分泌物的預(yù)處理、衍生化和GC-MS分析主要參考文獻(xiàn)[15，16]的方法。將收集的根系分泌液于真空冷凍干燥機(jī)上凍干，用預(yù)冷的10 mL甲醇將其轉(zhuǎn)移至試管中，氮?dú)獯蹈?，然后加?0 μL 20 g/L甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，37 ℃反應(yīng)2 h，并伴隨振蕩，最后加入70 μL MSTFA，37 ℃反應(yīng)30 min并伴隨振蕩。反應(yīng)完成后，0.45 μm濾膜過(guò)濾至GC進(jìn)樣小瓶，待GC-MS分析。

GC分析條件：色譜柱 Thermo TR5-MS毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）;色譜柱升溫程序：初始溫度70℃，保持1 min，以1 ℃/min升至76 ℃，再以5 ℃/min升至330 ℃， 并保持10 min;進(jìn)樣口溫度：230 ℃;載氣、輔助氣：均為氦氣，純度為99.999%，載氣流速為1 mL/min（恒流）;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為0.75 min，分流比為50∶1; 進(jìn)樣量： 1 μL。

MS分析條件：EI離子源，電離電壓70 eV;離子源溫度：250 ℃;傳輸線溫度：250 ℃;質(zhì)譜掃描方式：全掃描，掃描范圍為m/z 50～600;溶劑延遲時(shí)間：3 min。

2.4 數(shù)據(jù)分析

GC-MS數(shù)據(jù)采用AMDIS自動(dòng)解卷積，并與植物代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)Fiehn和GMD比對(duì)，對(duì)相似度大于70%的化合物予以認(rèn)定，然后利用MET-IDEA對(duì)AMDIS輸出結(jié)果進(jìn)行提取和處理，接著將已鑒定的根系分泌物質(zhì)的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（不同處理間同一保留時(shí)間化合物的峰面積之比），然后導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA-P 13.0進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis， PCA） 和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal to partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），通過(guò)載荷圖、模型的變量重要性因子（Variable importance factor， VIP）和方差分析（Analysis of variance， ANOVA）尋找超富集植物東南景天在不同鎘處理?xiàng)l件下差異顯著的根系分泌物。

3 結(jié)果與分析

3.1 GC-MS分析結(jié)果

0和40 μmol/L鎘處理4天和8天后，超富集植物東南景天根系分泌物的GC-MS總離子流色譜圖（TIC）見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)分析，共鑒定出其中58種化合物，包括乳酸、草酸、琥珀酸等一系列小分子有機(jī)酸，纈氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸等一系列氨基酸，木糖、果糖、葡萄糖等糖類(lèi)，十二烷醇、核糖醇、松醇、膽固醇等醇類(lèi)，及磷酸、月桂酸、十八烯酸等小分子代謝物。

A. 0 μmol/L Cd treatment for 4 days; B.40 μmol/L Cd treatment for 4 days; C. 0 μmol/L Cd treatment for 8 days; D. 40 μmol/L Cd treatment for 8 days.

部分已鑒定的根系分泌物質(zhì)： 1. 丙三醇（Glycerol-3TMS）; 2. 蘇糖酸（Threonic acid-4TMS）; 3. 核糖醇（Ribitol-5TMS）; 4. 十四烷酸（Tetradecanoic acid-1TMS）; 5. 十六烯酸（9-Hexadecenoic acid-1TMS）; 6. 十六烷酸（Hexadecanoic acid-1TMS）; 7. 十八烯酸（Oleic acid-1TMS）; 8. 十八烷酸（Octadecanoic acid-1TMS）; 9. 二十二烷（n-Docosane）; 10. ?單十六醛丙三醇（1-Monohexadecanoylglycerol-2TMS）; ?11. 海藻糖（Trehalose-8TMS）; ?12. 膽固醇（Cholesterol-1TMS）。

取同一樣品連續(xù)進(jìn)樣7次，計(jì)算各色譜峰相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于10%。

3.2 不同鎘處理?xiàng)l件下東南景天根系分泌物的模式識(shí)別分析

將已鑒定的58種根系分泌物質(zhì)通過(guò)無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），進(jìn)行不同鎘處理4天和8天間東南景天根系分泌物的模式識(shí)別，結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)對(duì)已鑒定的58種根系分泌物質(zhì)的PCA分析發(fā)現(xiàn)（圖2A），同一鎘處理濃度下，不同鎘處理時(shí)間東南景天根系分泌物樣品能顯著區(qū)分;而相同鎘處理時(shí)間，不同鎘處理濃度，東南景天根系分泌物樣品也能區(qū)分，除了0與40 μmol/L鎘處理8天后的樣品有部分重疊。

通過(guò)進(jìn)一步的OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)（圖2B），相同處理?xiàng)l件下東南景天根系分泌物樣品能明顯的聚集在一起，而不同處理?xiàng)l件間東南景天根系分泌物樣品能顯著區(qū)分。

PCA和OPLS-DA的分析結(jié)果表明，東南景天根系分泌物的組成或含量在不同處理?xiàng)l件間明顯不同。這一結(jié)果符合先前研究，土壤結(jié)構(gòu)、植物種類(lèi)、植物生長(zhǎng)時(shí)期、營(yíng)養(yǎng)水平和環(huán)境壓力等因素能影響植物根系分泌物的組成成分和含量^[17，18]。

為了進(jìn)一步找到對(duì)上述區(qū)分做出主要貢獻(xiàn)的差異根系分泌物質(zhì)，即可能導(dǎo)致鎘超富集植物東南景天能耐受或超富集鎘的優(yōu)勢(shì)根系分泌物質(zhì)，本研究通過(guò)OPLS-DA分析的載荷圖（圖3，圖中每一個(gè)X點(diǎn)代表一個(gè)根系分泌物質(zhì)變量，離原點(diǎn)距離較遠(yuǎn)的點(diǎn)可能為差異顯著根系分泌物質(zhì)）、VIP值（VIP>1的物質(zhì)可能為差異顯著的根系分泌物質(zhì)）和ANOVA，最終確定其中12種根系分泌物質(zhì)的含量在不同鎘處理?xiàng)l件間存在顯著性差異（p<0.05）（表1）。

3.3 鎘超富集植物東南景天耐受或超富集鎘的作用機(jī)制分析

表1給出了差異顯著的東南景天根系分泌物質(zhì)在不同處理?xiàng)l件下的相對(duì)含量，這些相對(duì)含量的變化可能是東南景天響應(yīng)鎘脅迫或植物生長(zhǎng)時(shí)期的結(jié)果，可能與東南景天耐受或超富集鎘的作用機(jī)制有關(guān)。

癸酸和月桂酸在加鎘處理4天時(shí)的分泌量較無(wú)鎘處理有顯著增加，8天時(shí)的分泌量較無(wú)鎘處理有明顯減少，表明在鎘處理初期，東南景天可能通過(guò)根系分泌更多的癸酸和月桂酸來(lái)活化鎘，以促進(jìn)的鎘的吸收;隨著處理時(shí)間的增加，東南景天可能通過(guò)減少癸酸和月桂酸的分泌，進(jìn)而減少鎘的活化來(lái)耐受鎘。

苯甲酸在加鎘處理4天和8天時(shí)的分泌量較無(wú)鎘處理都有明顯增加，但鎘處理8天的分泌量較4天時(shí)有顯著減少，表明鎘處理能促進(jìn)東南景天根系分泌出更多的苯甲酸，苯甲酸可能有助于東南景天對(duì)鎘的超富集。

壬酸在加鎘處理和無(wú)鎘處理中均有分泌，但在4天時(shí)鎘能促進(jìn)東南景天根系壬酸的分泌，8天時(shí)卻抑制了其分泌，可能是由于壬酸能夠活化重金屬鎘。在鎘處理初期，東南景天為了吸收更多的鎘而增加壬酸的分泌，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，東南景天通過(guò)減少壬酸的分泌來(lái)減少土壤中的有效性鎘，以保護(hù)東南景天不受鎘的毒害。

果糖、赤蘚糖醇、羥基乙酸、甘露醇和海藻糖的分泌量在加鎘處理后均較無(wú)鎘處理減少，可能是東南景天通過(guò)減少這些物質(zhì)的分泌來(lái)響應(yīng)鎘脅迫。

核糖醇和甘油在加鎘處理和無(wú)鎘處理4天時(shí)均有分泌，加鎘處理的分泌量明顯小于無(wú)鎘處理，但加鎘處理和無(wú)鎘處理8天時(shí)均未分泌核糖醇和甘油，可能是東南景天通過(guò)減少這兩種物質(zhì)的分泌來(lái)響應(yīng)鎘脅迫和植物生長(zhǎng)時(shí)期。

磷酸在鎘處理和對(duì)照中均有分泌，在相同處理時(shí)間不同鎘處理濃度下分泌量變化差異不明顯，但在相同鎘處理濃度不同處理時(shí)間下分泌量變化差異較明顯，表明磷酸的分泌與植物生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)，與鎘處理?xiàng)l件影響不大。

本研究利用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法研究了鎘超富集植物東南景天在鎘脅迫下根系分泌物代謝譜變化。多元統(tǒng)計(jì)分析表明，不同處理?xiàng)l件間根系分泌物樣品獲得了很好的區(qū)分，并找出了12種在各處理間差異顯著的根系分泌物質(zhì)：癸酸、苯甲酸、月桂酸、壬酸、果糖、赤蘚糖醇、羥基乙酸、甘露醇、海藻糖、核糖醇、磷酸和甘油，這些差異顯著的根系分泌物質(zhì)的變化趨勢(shì)反映了超富集植物東南景天通過(guò)改變根系分泌物質(zhì)的組成或含量來(lái)耐受或超富集重金屬鎘的可能的作用機(jī)制。

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Metabonomics Study on Root Exudates of Cd

Hyperaccumulator Sedum Alfredii

LUO Qing1，2， SUN Li-Na*2， HU Xiao-Min1

1（School of Resources and Civil Engineering， Northeast University， Shenyang 110004， China）

2（Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation of Ministry of Educatione，

Shenyang University， Shenyang 110044， China）

Abstract A metabonomics method based on gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was developed for detecting the significant differences of root exudates of the Cd hyperaccumulator Sedum alfredii under different treatments and study the effect mechanism of S. alfredii tolerating or accumulating the heavy metal Cd. The root exudates were collected after treatment for 4 and 8 days with 0 and 40 μmol/L Cd. The collected solution was lyophilized and dissolved with methanol， and after derivatization with methoxyamine hydrochloride and N-methyl-N-trifluoroacetamide， the samples were analyzed by GC-MS. Principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least-squares discrimination analysis （OPLS-DA） were carried out for pattern recognition and a clear separation among the different treatments was achieved. Twelve compounds which caused the separation among the different treatments were found and identified. With the change of treatments， the relative amount of these 12 compounds revealed different trends， which indicated that the Cd hyperaccumulator S. alfredii could adjust the secretion of root exudates to tolerate or accumulate the heavy metal Cd.

Keywords Hyperaccumulator; Sedum alfredii; Root exudates; Metabonomics; Gas chromatography-mass spectrometry

（Received 4 May 2014; accepted 7 July 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21037002， 41071304， 21107075）