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    基于熒光素汞熒光法結(jié)合光纖傳感—微順序注射—閥上實驗室測定腸灌流液中H2S

    2015-01-20 11:00:21侯俊峰關(guān)明李新霞
    分析化學(xué) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:硫化氫

    侯俊峰+關(guān)明+李新霞

    摘 要 建立基于光纖傳感技術(shù)結(jié)合微順序注射-閥上實驗室熒光猝滅測定腸灌流液中H2S含量方法。本研究進(jìn)行單因素考察,確定以100 μL 0.1mol/L NaOH溶液為載液,熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L、體積50 μL、進(jìn)樣體積50 μL、流通池檢測流速25 μL/s,根據(jù)H2S猝滅熒光素汞521 nm處熒光,對樣品中H2S濃度進(jìn)行測定。本方法檢測H2S的濃度范圍為5.0×10 Symbolm@@ 6~8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L,檢出限為5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L。測定腸灌流液中H2S含量為3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L,RSD=3.1%(n=3)。本方法能有效在線測定樣品中H2S含量,為實時在線測定生物樣品中的H2S含量奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 光纖傳感 硫化氫 微順序注射-閥上實驗室 熒光素汞 熒光猝滅

    1 引 言

    硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體,是空氣和水源的污染物之一。近研究發(fā)現(xiàn),H2S是繼NO和CO之后又一種新型信號分子,作為一種活性神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)廣泛存在于動物體內(nèi),參與并調(diào)節(jié)動物體諸多的生理病理活動[1]。目前,H2S的測定方法大多局限于傳統(tǒng)方法,如亞甲基藍(lán)法[2]、硝酸銀比色法[3]、氣相色譜法[4]等。這些傳統(tǒng)的方法檢出限和靈敏度無法滿足生物樣品中極微量甚至痕量H2S測定要求。而熒光法的靈敏度更高,測定H2S數(shù)量級達(dá)到10 Symbolm@@ 6 mol/L。熒光素汞具有很強(qiáng)熒光,H2S中S2 Symbolm@@ 與熒光素汞結(jié)合,使熒光素汞熒光猝滅,H2S含量與熒光素汞的熒光強(qiáng)度具有良好的相關(guān)性。

    微順序注射-閥上實驗室(MicroSIA Lab-on-valve,μSIA-LOV)是第三代流動注射分析技術(shù)[5],在μSIA-LOV分析系統(tǒng)中,所有的單元操作,如樣品稀釋、試劑試樣的加入、混合以及多種連用技術(shù)的結(jié)合,使得整個實驗測定過程能夠可控、高效地進(jìn)行。該系統(tǒng)能將試劑及樣品消耗降低至微升水平,減少了試劑的使用量,適用于長時間監(jiān)測和試劑比較昂貴、樣品來源受限的分析。LOV系統(tǒng)不僅可以與光纖傳感結(jié)合,也可以靈活與電化學(xué)[6]、色譜[7]、化學(xué)發(fā)光[8]、固相萃取[9]、原子熒光[10]等方法聯(lián)用。

    本研究將光纖傳感技術(shù)與微量順序注射-閥上實驗室(μSIA-LOV)結(jié)合,以光纖作為傳導(dǎo)介質(zhì),將光纖光譜儀、微順序注射分析儀八通閥和氙燈光源連接,用計算機(jī)控制,利用該系統(tǒng)自動介觀流控特征與光纖傳感的實時監(jiān)測相連,可以實現(xiàn)樣品的在線監(jiān)測。本研究以Na2S為供體,建立光纖傳感-微量順序注射-閥上實驗室檢測腸灌流液中H2S的分析方法,為進(jìn)一步進(jìn)行動物在體腸灌流H2S或H2S供體藥物的腸吸收特性研究奠定分析基礎(chǔ)。

    2 實驗部分

    2.1 實驗裝置

    微量順序注射儀(美國FIAlab Instruments公司);光纖光譜儀(QE65000-FL,CCD)、連續(xù)氙燈光源(HPX-2000)、200 μm×1 m光纖兩根均為美國Ocean optics公司產(chǎn)品。PB-10型pH計(德國Sartorius公司);實驗流路所用連接管道采用PTFE管(0.75 mm,I.D.)。分別采用安裝有FIAlab for Windows和SpectraSuite 軟件的Windows XP系統(tǒng)臺式電腦對微量順序注射分析儀和光纖光譜儀進(jìn)行控制。光纖傳感-微順序注射-閥上實驗室儀器裝置:包含一個1000 μL高精密度注射泵、一個棕色濾光8通道的多位閥模塊(LOV),在該模塊上集成了一個中心控制通道、多個工作通道及一個多功能流通池等操作單元;通過軟件調(diào)節(jié)控制中心通道一端與8位閥上聯(lián)通位置,使中心通道與工作通道準(zhǔn)確連接,另一端與高精度注射泵相連而構(gòu)成流動分析系統(tǒng)。一根光纖與光譜儀相連,另一根光纖與氙燈光源相連,兩根光纖探頭插入LOV流通池接口,光路垂直組成熒光測定模式。

    2.2 試劑及溶液配制

    熒光素汞(優(yōu)級純, 美國化學(xué)服務(wù)公司);Na2S·9H2O(分析純, 天津市福晨化學(xué)試劑廠);其余試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

    準(zhǔn)確稱取0.0159 g熒光素汞,用0.1 mol/L NaOH定容到100 mL棕色容量瓶中,濃度為1.874×10 Symbolm@@ 4 mol/L,冷藏備用,使用時稀釋到所需濃度。準(zhǔn)確稱取0.240 g Na2S·9H2O,用水溶解并定容到100 mL,濃度為0.01 mol/L, 4 ℃密封保存?zhèn)溆?,使用時用水稀釋到所需濃度。

    Kreb-Ringer′s(KR)營養(yǎng)液:準(zhǔn)確稱取NaCl 7.8 g,KCl 0.35 g,CaCl2 0.37 g,NaHCO3 1.37 g,NaH2PO4 0.32 g,MgCl2 0.02 g,葡萄糖1.4 g于1000 mL容量瓶中,用水定容,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    系列濃度H2S腸灌流液的配制:將0.01 mol/L Na2S溶液用KR營養(yǎng)液稀釋10倍(1.0 mmol/L),再分別取稀釋液0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2和0.25 mL于5 mL容量瓶中,用KR營養(yǎng)液定容。

    供試品溶液:由KR營養(yǎng)液配制的Na2S溶液(5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L),健康大鼠麻醉后,將KR營養(yǎng)液由活體空腸灌流(蠕動泵流速0.2 mL/min) 30 min,接取供試品溶液于5 mL EP管中,封口4 ℃保存,待測。

    2.3 操作流程

    實驗流路如圖1所示,在注射泵的驅(qū)動下,首先由多位閥的6號口吸入適量載液(0.1 mol/L NaOH),7號口以50 μL/s的速度先后從中心通道吸入50 μL熒光素汞溶液,再以50 μL/s由5號口吸入適量樣品溶液,endprint

    再通過6號口以50 μL/s吸入100 μL載液。在注射泵的驅(qū)動下,被吸入儲液線圈中的載液推動試劑和樣品迅速混合,形成混合區(qū)帶,并充分反應(yīng),然后再反向以25 μL/s的流速將混合區(qū)帶從連接有光纖的多功能流通池(Flow cell)流出,通過光纖光譜儀讀取反應(yīng)后溶液的熒光強(qiáng)度。每次測定結(jié)束后,用水以300 μL/s流速沖洗整個流路。所有實驗操作均由FIAlab軟件自動完成,上述程序操作分6步,見表1。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 熒光素汞熒光光譜

    由通道5吸入200 μL熒光素汞(1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L),得到光譜圖(圖2),結(jié)果表明,熒光素汞最大發(fā)射波長位于521 nm。

    3.2 熒光素汞濃度的選擇及體積

    考察熒光素汞濃度(1.0×10 Symbolm@@ 4 mol/L , 1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L, 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L, 1.0×10 Symbolm@@ 6 mol/L)的影響,由于LOV為封閉的管道系統(tǒng),管徑很小,熒光素汞濃度過大, 會粘附在管道內(nèi),清洗使用試劑多、時間長,影響測定效率;熒光素汞濃度過低, 會影響測定靈敏度,故本實驗選擇熒光素汞的濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L。 溶液體積越大,混合程度越低,為了確保充分混合、反應(yīng)完全,本實驗選擇熒光素汞溶液體積為50 μL。

    3.3 載流NaOH溶液濃度及體積

    根據(jù)文獻(xiàn) [11],熒光素汞在堿性條件下熒光較強(qiáng)增加實驗的靈敏度,本研究考察不同濃度的NaOH溶液(0.01, 0.05, 0.1, 0.2和0.5 mol/L)以及水作為載液對熒光素汞(1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L)與1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L Na2S熒光強(qiáng)度的影響(圖3),綜合考慮,本實驗選擇0.1 mol/L NaOH作為載液。NaOH溶液為整個體系提供堿性環(huán)境,沖洗管路并推動反應(yīng)后,溶液全部流過流通池,本實驗采用100 μL的0.1 mol/L NaOH作為載液,即達(dá)到上述目的。

    3.4 流通池檢測流速

    0.1 mol/L NaOH溶液中熒光素汞與1.0×10 Symbolm@@ 5mol/L Na2S反應(yīng)后,考察通過流通池流速分別為10, 15, 20, 25, 30, 35和40 μL/s時的信號強(qiáng)度。結(jié)果表明,流速過慢,會加大對供試品的稀釋效應(yīng);流速過快,信號穩(wěn)定,重現(xiàn)性降低。在流速為25 μL/s時,檢測信號最強(qiáng)且穩(wěn)定(圖4)。

    3.5 干擾物質(zhì)測定

    據(jù)文獻(xiàn)[12]報道,含巰基氨基酸可能是內(nèi)源性H2S的供體,故本實驗在最佳實驗條件下,以5%的最大允許誤差進(jìn)行干擾測定,考察了L-半胱氨酸、蒜氨酸、高半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及大蒜辣素對H2S測定造成的干擾,結(jié)果如表2所示。

    3.6 性能分析

    熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5mol/L, 0.1 mol/L NaOH溶液為載液,檢測流速為25 μL/s,檢測波長為521 nm,供試品進(jìn)樣量50 μL,測定系列濃度硫化氫腸灌流液,獲得在521 nm處的熒光強(qiáng)度,將熒光強(qiáng)度與濃度進(jìn)行線性回歸,在5.0×10 Symbolm@@ 6~8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L范圍內(nèi),線性方程為y= Symbolm@@ 262.13x+26182(圖5),相關(guān)系數(shù)r=0.997。

    4 結(jié) 論

    本實驗將微量順序注射-閥上實驗室(μSIA-LOV)系統(tǒng)與光纖傳感技術(shù)結(jié)合,建立了熒光素汞二元體系熒光猝滅法測定生物樣品中H2S含量的方法。H2S作為一種信號分子,本身是內(nèi)源性物質(zhì),參與和調(diào)節(jié)動物體多種生理及病理活動,目前對H2S的測定方法大多采用需取樣分析,需要經(jīng)過多步樣品前處理。本實驗則是在LOV模塊上以熒光測定模式進(jìn)行樣品測定,簡化了操作步驟,每一步操作采用程序化控制,提高了實驗可重復(fù)性和規(guī)范性;整個系統(tǒng)微升級的進(jìn)樣量大大降低了試劑和樣品的消耗,顯著提高分析速度。本方法與光纖傳感相連可實現(xiàn)生物體內(nèi)H2S的在線監(jiān)測。

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    Fluorescein Mercury Combined with Optical Sensing Micro

    Sequential Injection Lab-on-Valve for Determination of

    H2S in Intestinal Perfusate

    HOU Jun-Feng1, GUAN-Ming1, LI Xin-Xia*2

    1(Laboratory on Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering,

    Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China)

    2(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

    Abstract A fluorescence quenching method was established for the determination of H2S in intestinal perfusate by optical fiber sensing technology combined with micro sequential injection lab-on-valve (μSIA-lov). In the experiment, 100 μL of 0.1 mol/L NaOH was used as the carrier, and 50 μL of 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L fluorescein mercury and 50 μL of sample were selected for the determination. The detection flow rate at the flowcell was 25 μL/s. According to H2S quenching fluorescence at 521 nm, the concentration of H2S in the sample was determined. The detected concentration range of H2S was 5.0×10 Symbolm@@ 6-8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L, and the detection limit was 5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L. Detection result of H2S in intestinal perfusion was 3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L with 3.1% RSD (n=3). This method can be used for the determination of H2S effectively in the samples, which lay the foundation for real-time online measurement of H2S in biological samples.

    Keywords Fiber sensing; Hydrogen sulfide; Micro sequential injection lab-on-valve; Fluorescein mercury; Fluorescence quenching

    (Received 29 May 2014; accepted 5 September 2014)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.8126048)endprint

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