枯草芽孢桿菌代謝組樣品前處理方法的比較研究

王洪彬等

摘 要 本研究比較了不同淬滅劑（甲醇、60%甲醇、60%甲醇0.9% NaCl、60%甲醇0.9% （NH4）2CO3和60%甲醇0.9% NaAc）條件下胞內(nèi)物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)和代謝物的滲漏情況，發(fā)現(xiàn)60%甲醇0.9%（NH4）2CO3和60%甲醇0.9% NaAc滲漏最少；比較了珠磨法、液氮研磨法、超聲破碎3種細(xì)胞破碎方法條件下代謝物的提取效果，發(fā)現(xiàn)珠磨法提取效果最佳；比較了不同衍生時(shí)間（0.5～2.5 h）下代謝物相對(duì)豐度的變化，發(fā)現(xiàn)衍生時(shí)間達(dá)到2.0 h后，代謝物豐度不再有顯著變化。最終確定了枯草芽孢桿菌代謝組樣品最適前處理方法：預(yù)冷的60%甲醇0.9%（NH4）2CO3淬滅， 珠磨法破碎細(xì)胞， 細(xì)胞破碎物用OBis＼[三甲基硅烷＼]三氟乙酸鹽（MSTFA）衍生2 h。采用本方法從枯草芽孢桿菌中共鑒定到223種代謝物，包括大量氨基酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。本研究為枯草芽孢桿菌的代謝組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞； 代謝組學(xué)； 枯草芽孢桿菌； 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 前處理

1 引 言

微生物代謝組學(xué)旨在分析微生物體系中所有的代謝物。由于代謝物結(jié)構(gòu)的多樣性及其濃度分布范圍的寬廣性，檢測(cè)盡可能多的代謝物及其含量始終是一個(gè)巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)[1，2]。盡管代謝組分析技術(shù)近年來獲得了快速發(fā)展[3～5]，但是在代謝組樣品制備環(huán)節(jié)仍然存在諸多問題[6～11]。代謝組學(xué)分析技術(shù)主要包括核磁共振（NMR）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）技術(shù)。NMR技術(shù)具有樣品處理簡單、樣品破壞性小等優(yōu)點(diǎn)，但是相比質(zhì)譜技術(shù)靈敏度較低，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍比較窄。LCMS技術(shù)的代謝物適合范圍廣，可以與多種質(zhì)譜聯(lián)用，靈活性和普適性好，但是缺乏完備成熟的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，難以高效準(zhǔn)確地鑒定代謝物。采用GCMS技術(shù)，難揮發(fā)性樣品需要衍生化，樣品處理相對(duì)繁瑣，但是其有最完整的標(biāo)準(zhǔn)圖庫，代謝物譜圖可檢索性較強(qiáng)，定性鑒定方便，因此在代謝組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。

基于GCMS的代謝組學(xué)分析方法，其樣品前處理環(huán)節(jié)包括淬滅、破碎提取和衍生等步驟，各個(gè)步驟對(duì)分析質(zhì)量都有較大的影響。理論上， 一種代謝組樣品處理方法無法適合于所有種類的的微生物，因?yàn)椴煌N類微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同。目前， 關(guān)于微生物代謝組研究有許多報(bào)道，但所采用的樣品處理方法在細(xì)胞淬滅、破碎和衍生化等步驟存在諸多差異。如在樣品淬滅環(huán)節(jié)采用不同的溶劑，主要是60%甲醇或者在60%甲醇中添加一定比例的鹽[12～14]。液氮冷凍也是細(xì)胞淬滅的常用方法[14]，但主要用于動(dòng)植物組織樣品的處理，由于該法無法分開胞內(nèi)外物質(zhì)，因此不適于微生物代謝組的研究。細(xì)胞破碎方法，主要有珠磨法、超聲破碎法和液氮研磨法等[15，16]。在樣品衍生化環(huán)節(jié)可以采用不同的衍生試劑，其中OBis[三甲基硅烷]三氟乙酸鹽（MSTFA）作為衍生劑使用比較廣泛，文獻(xiàn)報(bào)道中其衍生時(shí)間不盡相同[17～21]。

枯草芽孢桿菌是一種重要的工業(yè)微生物[22]，廣泛應(yīng)用于蛋白酶和淀粉酶等酶制劑的生產(chǎn)、廢水處理、飼料和益生菌行業(yè)，同時(shí)它也是基礎(chǔ)研究領(lǐng)域重要的模式微生物，常用于研究芽孢的形成機(jī)制。因此，枯草芽孢桿菌代謝組學(xué)研究具有重要意義，但目前有關(guān)其代謝組學(xué)的研究報(bào)道較少，在Meyer等[23]對(duì)枯草芽孢桿菌的代謝組分析研究中，并沒有對(duì)前處理方法展開深入研究。哪些方法更適合于工業(yè)微生物枯草芽孢桿菌的研究并沒有相關(guān)的研究報(bào)道。本研究在淬滅、破碎提取和衍生3個(gè)重要環(huán)節(jié)對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了比較研究，確定最適合枯草芽孢桿菌的代謝組學(xué)研究的樣品前處理方法，為枯草芽孢桿菌代謝組學(xué)分析研究提供技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

JY92II DN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；Precellys 24多功能樣品均質(zhì)器（法國Bertin Technologies 公司）；MilliQ Advantage A10超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）；7890 A 型氣相色譜5975 C型四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；TU1810系列紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用有限公司）。

枯草芽孢桿菌AS1.398取自天津科技大學(xué)菌種保藏中心。色譜級(jí)十五烷酸、甲氧胺鹽酸鹽、添加有1% 三甲基氯硅烷（TMCS）的MSTFA購自Sigma公司；色譜純乙腈、甲醇和吡啶購自天津康科德科技公司； NaCl、（NH4）2CO3和NaAc為分析純，購自天津博歐特化工貿(mào)易有限公司；蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxoid公司；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 菌體培養(yǎng) 枯草芽孢桿菌 AS1.398采用LB液體培養(yǎng)基（1% NaCl，1% 蛋白胨，0.5% 酵母提取物），37℃過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（A600≈2.2）時(shí)取樣處理。

2.2.2 樣品前處理 取培養(yǎng)的菌液10 mL，快速加入30 mL于

2.2.3 GCMS分析 使用氣相色譜四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)衍生的樣品進(jìn)行GCMS分析。對(duì)于GCMS分析，初始溫度70℃，維持4 min，以3℃/min升到133℃，再以2℃/min升到200℃，再以3℃/min升到220℃，最后以5℃/min升到260℃。樣口溫度：270℃；接口溫度：280℃；離子化方式：電子轟擊（EI），溫度230℃，電子能量70 eV；四極桿溫度 150℃，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 85～500。色譜條件：Agilent HP5 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm× 0.25 μm），載氣：高純氦氣；載氣流速：l.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量： 1 μL。測(cè)定結(jié)果通過安捷倫Chemistation軟件內(nèi)置的檢索程序檢索Nist08 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果中匹配度大于900且可能性大于85%的物質(zhì)作為相對(duì)可靠的鑒定結(jié)果，通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量。

2.2.4 不同淬滅劑處理效果的比較 參考文獻(xiàn)報(bào)道的淬滅劑進(jìn)行淬滅處理，并通過檢測(cè)核酸蛋白滲出和代謝物滲出比較淬滅效果，淬滅劑分別是甲醇、60%甲醇、60%甲醇0.9% NaCl、60%甲醇0.9% （NH4）2CO3和60%甲醇0.9% NaAc[12～14， 24，25]。每種淬滅劑平行處理3個(gè)樣品。取10 mL培養(yǎng)的菌液，在4℃以6000 r/min離心10 min，棄去上清液，用0.9% NaCl溶液潤洗菌體一次。將潤洗后的菌體細(xì)胞分別重懸在2 mL

Symbolm@@ 40℃ 預(yù)冷的4種淬滅劑和陰性對(duì)照（2 mL 0.9% NaCl）中，在4℃以6000 r/min離心10 min，收集上清液。測(cè)定上清液在260和280 nm的吸光度，分別反映胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的滲出量。使用衍生后GCMS分析的方法測(cè)定上清液中的代謝物，反映胞內(nèi)代謝物滲出情況，檢測(cè)方法同2.2.3節(jié)，衍生時(shí)間選擇2.0 h。

2.2.5 不同細(xì)胞破碎方法的比較 取10 mL培養(yǎng)的菌液，樣品處理方法同2.2.4節(jié)，分別采用下列3種方法破碎細(xì)胞，其中淬滅劑采用60%甲醇/0.9%NaCl，衍生時(shí)間為2 h。衍生后GCMS分析代謝物的方法同2.2.3。每種破碎方法進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)果與討論

3.1 不同淬滅劑處理效果的比較

微生物細(xì)胞內(nèi)存在許多周轉(zhuǎn)率很高的代謝物，如ATP、ADP、6磷酸葡萄糖等。為了準(zhǔn)確反映取樣時(shí)細(xì)胞真實(shí)的代謝狀態(tài)，取樣后必須立刻通過細(xì)胞淬滅終止菌體代謝。同時(shí)又要防止對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成較大破壞，以免代謝物大量滲出影響胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)。因此，適合的淬滅劑既要有較高的淬滅效率，又要滲出較少的代謝物。低溫的60%甲醇被證明可以有效淬滅細(xì)胞代謝[13]，常在其中添加鹽（如NaCl、（NH4）2CO3和NaAc等）以降低代謝物滲出。

3.2 不同細(xì)胞破碎方法的比較

理想的細(xì)胞破碎方法不僅要考慮細(xì)胞破碎率，還應(yīng)該無偏向性地將所有代謝物最大程度地釋放出來，同時(shí)保持破碎提取過程中代謝物不發(fā)生改變。為保證代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定，破碎過程中應(yīng)使酶處于持續(xù)失活狀態(tài)。圖2A顯示了3種細(xì)胞破碎方法得到的代謝物鑒定結(jié)果的比較，可以看出，珠磨法所得樣品中鑒定到的代謝物種類最多，總共202種，超聲破碎法略少，為188種，而液氮研磨法鑒定到的代謝物種類最少，僅為86種；僅在珠磨法或超聲破碎法樣品中鑒定到的代謝物數(shù)量分別為30種和16種，而兩種方法共同鑒定到的代謝物種類數(shù)量為172種，占據(jù)了各自的大多數(shù)。圖2B給出了不同破碎條件下氨基酸的檢測(cè)結(jié)果，可以看出，珠磨法和超聲破碎法相比液氮研磨法不僅鑒定到了更多的氨基酸種類，而且對(duì)于共同檢測(cè)到的氨基酸，前者檢測(cè)到的含量也比后者要高。超聲破碎過程只能在冰浴條件下進(jìn)行，無法達(dá)到更低的溫度，會(huì)影響酶的失活效果和提取過程中代謝物的穩(wěn)定性。液氮研磨法雖然具有極低的細(xì)胞破碎溫度，保證了代謝物的穩(wěn)定，但是人為操作因素較多，細(xì)胞破碎效率和樣品回收的重復(fù)性難以保證。相比而言，珠磨法不僅具有較少的人為操作影響和較高的細(xì)胞破碎效率，而且液氮提供的超低溫環(huán)境保證了破碎過程中代謝物的穩(wěn)定性。

3.3 衍生時(shí)間對(duì)代謝物分析結(jié)果的影響

MSTFA是基于GCMS的代謝組研究中廣泛采用的衍生劑，添加的1%的TMCS可以催化難以硅烷化的化合物以及一些與單獨(dú)的MSTFA無法發(fā)生衍生反應(yīng)的羥基發(fā)生反應(yīng)，從而提高衍生效率[19]。MSTFA衍生過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物及其自身通常是與溶劑前沿一起洗脫的，適用于分析小分子物質(zhì)。由于定量檢測(cè)是以衍生化為基礎(chǔ)，充分的衍生是可靠定量的前提。本研究對(duì)比了衍生化時(shí)間為0.5， 1.0， 1.5， 2.0和2.5 h時(shí)樣品的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)衍生時(shí)間達(dá)到2.0 h之后，代謝物在豐度上不再有明顯的變化。圖3顯示了不同衍生時(shí)間下部分有機(jī)酸和糖類代謝物的檢測(cè)結(jié)果，可以看出，衍生0.5 h時(shí)大多數(shù)物質(zhì)濃度較低且有多種物質(zhì)無法檢測(cè)到，而衍生2.0和2.5 h時(shí)檢測(cè)到的這些物質(zhì)的濃度最高，且二者之間沒有顯著差異。

3.4 樣品前處理最適方法的確定

通過對(duì)不同淬滅劑、細(xì)胞破碎方法和衍生時(shí)間條件下代謝組分析結(jié)果的比較，最終選擇預(yù)冷的60%甲醇/0.9%（NH4）2CO3溶液淬滅、珠磨法破碎細(xì)胞和MSTFA衍生2.0 h進(jìn)行枯草芽孢桿菌代謝組樣品的前處理。60%甲醇0.9% （NH4）2CO3和60%甲醇0.9%NaAc的淬滅效果比較接近，但是 （NH4）2CO3作為揮發(fā)性鹽同樣適合LCMS代謝組學(xué)分析的要求，而NaAc并不適合。代謝組學(xué)研究經(jīng)常同時(shí)采用GCMS和LCMS兩種分析方案進(jìn)行互補(bǔ)，故最終選擇前者作為淬滅劑。超聲破碎法所得樣品中鑒定到的代謝物數(shù)量與珠磨法差別不大，但是因?yàn)楹笳邿o法控制在低溫環(huán)境下進(jìn)行，所以同樣不是最佳選擇。采用優(yōu)化方法處理的樣品經(jīng)GCMS分析后共鑒定到了223種的代謝物，包含了15種氨基酸、21種糖類、76種有機(jī)酸等多類重要的代謝物質(zhì)。

4 結(jié) 論

本研究以枯草芽孢桿菌的代謝組為研究對(duì)象，比較了不同淬滅劑、細(xì)胞破碎方法和衍生時(shí)間條件下代謝組分析結(jié)果，最終確定了枯草芽孢桿菌代謝組樣品的最適前處理方法：采用預(yù)冷的60%甲醇0.9% （NH4）2CO3溶液淬滅、珠磨法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎物使用OBis＼[三甲基硅烷＼]三氟乙酸鹽（MSTFA）衍生2.0 h。采用本方法從枯草芽孢桿菌中共鑒定到223種代謝物，包括大量的氨基酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。本工作為工業(yè)微生物枯草芽孢桿菌的代謝組研究建立了重要的方法基礎(chǔ)，有助于開展更深入的代謝機(jī)制相關(guān)研究。

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Abstract An appropriate sample pretreatment method is crucial to the metabolomic analysis. Till now， many different sample pretreatment techniques for microbial metabolomics have been reported， but it is not clear which one is suitable for sample preparation for metabolomic analysis of Bacillus Subtilis. To improve the quality of metabolomic analysis of B. subtilis based on gas chromatographymass spectrometry （GCMS）， in this study， the leakage of intracellular metabolites with five different quenching solvents was compared， and it was found that 60% methanol/0.9% （NH4）2CO3 and 60% methanol/0.9% NaAC had the least leakage. The effects of different cell disruption methods including beadmilling， liquid nitrogen grounding and ultrasonication on the extraction of metabolites were compared. The beadmilling method exhibited the highest extraction efficiency. The effects of derivatization time （0.5-2.5 h） on relative abundance of metabolite distribution were also investigated and it was found that 2 and 2.5 h were adequate for derivatization. The optimal sample pretreatment method for metabolomic analysis of B. subtilis was determined as follows： 60% methanol/0.9% （NH4）2CO3 as quencher， glass bead breaker used for cell disruption and the derivatization time of 2 h. With this method， 223 metabolites in B. subtilis. were identified by GCMS， including a large number of amino acids， organic acids and carbohydrates. This study lays the foundation for the comprehensive Metabolomics analysis of Bacillus Subtilis.

Keywords Metabolomics； Bacillus Subtilis； Gas chromatographymass spectrometry； Pretreatment

（Received 26 January 2015； accepted 4 June 2015）