用于巨型脂質(zhì)體制備及收集的微流控芯片研究

王振宇等

磷脂酰膽堿（1，2Diacylsnglycero3phosphocholine， PC）、膽固醇（3βHydroxy5cholestene， cholesterol， Chol）購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司；乙醚、NaCl、蔗糖、葡萄糖購(gòu)自中國(guó)科龍化工公司；PDMS購(gòu)自美國(guó)Dow Corning公司。聚丙烯基板（2 mm厚）購(gòu)自中國(guó)新濤公司；玻璃片、ITO玻璃、導(dǎo)電膠布購(gòu)自中國(guó)珠海凱為公司。

3 結(jié)果與討論

3.1 巨型脂質(zhì)體制備

脂質(zhì)膜的情況和電場(chǎng)參數(shù)是影響巨型脂質(zhì)體電形成效果的重要因素。其中，脂質(zhì)膜的形成由脂質(zhì)溶液的濃度、體積、腔室的形狀及尺寸等決定；電場(chǎng)參數(shù)涉及電場(chǎng)分布、電壓、頻率、施加時(shí)間等。在兩種微電

極陣列中分別開(kāi)展多種參數(shù)（脂質(zhì)溶液濃度、電壓、頻率、施加時(shí)間，見(jiàn)表1）的脂質(zhì)體制備實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期研究結(jié)果[14]，磷脂酰膽堿（PC）和膽固醇（Chol）濃度比維持在5∶1。

將脂質(zhì)溶液輸入并充滿兩種微電極陣列所在微通道，真空干燥后，使溶劑完全蒸發(fā)形成脂質(zhì)膜；注入水溶液后，在45 ℃下施加交流電場(chǎng)（正弦信號(hào)），觀察巨型脂質(zhì)體形成情況。

在電形成過(guò)程的最初階段，巨型脂質(zhì)體形成主要受脂質(zhì)膜影響。電極附近的脂質(zhì)膜較微通道中間厚，更利于巨型脂質(zhì)體的形成。當(dāng)脂質(zhì)溶液濃度較低時(shí)（0.5 mg/mL PC和0.1 mg/mL Chol），僅電極附近的脂質(zhì)膜厚度足以膨脹形成單層巨型脂質(zhì)體，但是產(chǎn)量很低。之后，巨型脂質(zhì)體的電形成產(chǎn)量、比率和速度脂質(zhì)溶液濃度增加而遞增，但其濃度超出了一個(gè)閾值（9 mg/mL PC和1.8 mg/mL Chol）后，所形成巨型脂質(zhì)體互相疊加為不穩(wěn)定條狀結(jié)構(gòu)（圖2），巨型球形脂質(zhì)體產(chǎn)量也不再增加。當(dāng)PC和Chol濃度分別為6和1.2 mg/mL時(shí)，巨型球形脂質(zhì)體產(chǎn)率較高。

在電形成過(guò)程后期，電場(chǎng)分布、幅值、頻率、電場(chǎng)施加時(shí)間均對(duì)巨型脂質(zhì)體的形成有影響（圖3）。在電場(chǎng)較強(qiáng)區(qū)域，脂質(zhì)體能更快膨脹形成。兩種不同的微電極陣列中形成的巨型脂質(zhì)體形狀較相似，但交錯(cuò)電極陣列上的形成速率更快。此外，當(dāng)脂質(zhì)濃度逐漸增大時(shí)，在平板電極陣列中脂質(zhì)體形成于整個(gè)通道，到后期邊緣和中間的脂質(zhì)體的膨脹會(huì)逐漸受到阻礙；而交錯(cuò)電極陣列上的巨型脂質(zhì)體常形成在電極附近，中間位置的脂質(zhì)膜就幾乎不膨脹。在電場(chǎng)強(qiáng)的位置，脂質(zhì)膜的膨脹速度也快于平板電極陣列，所形成巨型脂質(zhì)體的形態(tài)也更好。這表明電場(chǎng)強(qiáng)度的增加有助于脂質(zhì)體的快速形成。隨著電場(chǎng)幅值的增加，脂質(zhì)體膨脹形成速度增加，但由此產(chǎn)生的大粒徑球形脂質(zhì)體（粒徑>50SymbolmA@ m）穩(wěn)定性減弱、容易損壞，所以最終收集到的巨型脂質(zhì)體比例在電壓增加后并沒(méi)有明顯增加。在微電極陣列中，由于較小的電極間距有助于產(chǎn)生更大的場(chǎng)強(qiáng)，很小的電壓就足以實(shí)現(xiàn)巨型脂質(zhì)體（球形，粒徑≤50SymbolmA@ m）的快速電形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較佳的電壓為0.45 V。

隨著頻率增加，脂質(zhì)體膨脹和封閉也更快。當(dāng)頻率達(dá)到1000 Hz時(shí)，收集到的巨型脂質(zhì)體較多，而頻率繼續(xù)增高時(shí)收集量沒(méi)有明顯的增加；電場(chǎng)施加時(shí)間影響巨型脂質(zhì)體的膨脹和封閉，在時(shí)間遠(yuǎn)小于60 min時(shí)，巨型脂質(zhì)體還較少形成，很多巨型脂質(zhì)體還在膨脹過(guò)程中；當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min后，多數(shù)巨型脂質(zhì)體基本形成；進(jìn)一步增加電場(chǎng)施加時(shí)間，產(chǎn)量沒(méi)有明顯的變化。因此，就本研究所采用的芯片制備裝置，適宜的脂質(zhì)濃度、電場(chǎng)分布、電壓、頻率、電場(chǎng)施加時(shí)間等參數(shù)分別為：磷脂酰膽堿和膽固醇濃度為6.0和1.2 mg/mL，交錯(cuò)電極、0.45 V，1000 Hz、60 min。此時(shí)，穩(wěn)定的巨型球形脂質(zhì)體的產(chǎn)率可以達(dá)到約60%。采用目前常用的ITO玻璃電極+PDMS墊片搭建的電形成腔室進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在相同腔室體積、脂質(zhì)用量、已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)參數(shù)[15]，巨型球形脂質(zhì)體的產(chǎn)率僅為32%。

3.2 巨型脂質(zhì)體收集

制備完成后，向制備腔室中緩慢注入等滲的葡萄糖、NaCl的水溶液（504SymbolmA@ L），可在一定程度上避免巨型脂質(zhì)體粒徑大、易形變、整體強(qiáng)度較差，在操作時(shí)容易破裂等問(wèn)題。利用液流運(yùn)動(dòng)輕柔地將制備腔室里的巨型脂質(zhì)體等物質(zhì)輸送到收集腔室。

經(jīng)重力沉降和微孔濾膜過(guò)濾作用，符合要求的巨型脂質(zhì)體留在收集腔室上層（圖4），尺寸較小的物質(zhì)則通過(guò)濾膜進(jìn)入腔室下層，經(jīng)微通道流入廢液腔室。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，在收集腔室中可以收集得到90%以上的巨型脂質(zhì)體（粒徑在10～50）交錯(cuò)微電極陣列制備的巨型脂質(zhì)體收集效果優(yōu)于平板微電極陣列，這也證明交錯(cuò)微電極陣列可以得到更多，更穩(wěn)定的巨型脂質(zhì)體。但仍有少部分尺寸較小的物質(zhì)由于本身質(zhì)量太輕，在浮力作用下仍然停留在收集腔室上層。針對(duì)這部分物質(zhì)，今后可在腔室下層增加輕柔抽吸作用加以去除。

4 結(jié) 論

本研究采用了微流控芯片收集方法， 獲得了更好的巨型脂質(zhì)體制備效果， 并盡量多地收集所需的穩(wěn)定巨型球形脂質(zhì)體。通過(guò)構(gòu)建兩種不同微電極陣列結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了多種脂質(zhì)濃度、電壓、頻率、電場(chǎng)施加時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，交錯(cuò)電極對(duì)電場(chǎng)的聚焦作用有利于局部高電場(chǎng)區(qū)脂質(zhì)體的膨脹形成，因此更適合巨型脂質(zhì)體的制備。不同脂質(zhì)濃度和電場(chǎng)參數(shù)對(duì)巨型脂質(zhì)體的電形成有明顯的影響，多參數(shù)探索表明，在微電極陣列芯片中選擇磷脂酰膽堿和膽固醇濃度為6.0 mg/mL和1.2 mg/mL，電場(chǎng)參數(shù)為電壓0.45 V、頻率1000 Hz、加載時(shí)間60 min可以得到很好的制備效果。此時(shí)，穩(wěn)定的巨型球形脂質(zhì)體的產(chǎn)率可以達(dá)到60%，明顯優(yōu)于常規(guī)制備方法。

在制備研究基礎(chǔ)上開(kāi)展了收集芯片模塊的研究，通過(guò)不同組分在收集腔室和廢液腔室間的分選操作，可以在收集腔室中大量獲得巨型脂質(zhì)體（粒徑在10～50SymbolmA@ m范圍內(nèi)，大多為球形、較穩(wěn)定），為巨型脂質(zhì)體的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

References

1 Jesorka A， Orwar O. Ann. Rev. Anal. Chem.， 2008， 1： 801-832

2 Vorselen D， Roos W H， van Loon J J W A， Wuite G J L. Biophys. J.， 2013， 104 （2）： 620A-620A

3 DeNardis N I， Ruzic I， PecarIlic J， El Shawish S， Ziherl P. Bioelectrochem.， 2012， 88： 48-56

4 Guo B H， Cheng Y， Li N Y， Li X F， Jin M Z， Li T， Li J. J. Drug Target， 2013， 21 （3）： 257-264

5 Portet T， Mauroy C， Demery V， Houles T， Escoffre J M， Dean D S， Rols M P. J. Membr. Biol.， 2012， 245 （9）： 555-564

6 Mikelj M， Praper T， Demic R， Hodnik V， Turk T， Anderluh G. Anal. Biochem.， 2013， 435 （2）： 174-180

7 Shimanouchi T， Umakoshi H， Kuboib R. J. Colloid Interface Sci.， 2013， 394： 269-276

8 Natsume Y， Toyota T. Chem. Lett.， 2013， 42 （3）： 295-297

9 Kang Y J， Wostein H S， Majd S. Biophys. J.， 2014， 106 （2）： 632a

10 Tsumoto K， Nomura S M， Nakatani Y， Yoshikawa K. Langmuir， 2001， 17 （23）： 7225-7228

11 Hu P C C， Li S， Malmstadt N. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2011， 3 （5）：1434-1440

12 Patil Y P， Jadhav S. Chem. Phys. Lipids， 2014， 177： 8-18

13 Mikelj M， Praper T， Demic R， Hodnik V， Turk T， Anderluh G. Anal. Biochem.， 2013， 435 （2）： 174-180

14 Wang Z Y， Hu N， Yeh L H， Zheng X L， Yang J， Joo S W， Qian S Z. Colloids Surf B Biointerfaces， 2013， 110： 81-87

15 Kuribayashi K， Tresset G， Coquet P， Fujita H， Takeuchi S. Meas. Sci. Technol.， 2006， 17： 3121-3126

y of Education， Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing，

Bioengineering College， Chongqing University， Chongqing 400030， China）

3（Department of Electronic Engineering， Chongqing City Management College， Chongqing 400055， China）

Abstract A microfluidic chip with the preparation module and collection module was fabricated， in which microfluidic technology and microelectrode array were used for the preparation of giant vesicles. First， lipid solution was loaded into the microelectrode array through microchannels to form lipid film， then an electric field was subsequently loaded on the microelectrode array and the giant vesicles with a controlled diameter were formed efficiently. The ratio of the formed stable giant spherical vesicles could reach up to 60%. Giant vesicles and other materials were flushed into the upper layer of the collection chamber by microchannel. 90% of the stable giant spherical vesicles with 10-50 μm diameter could be sorted in the upper layer of the collection chamber by using micropore filter and gravity depositing. This microfluidic chip could overcome some defects existing in the current preparation method such as low efficiency， wide distribution of diameters， as well as difficult for screening and collection.