表面增強(qiáng)拉曼光譜法定量檢測食品中香豆素

黃梅英等

摘要 建立了食品中香豆素的表面增強(qiáng)拉曼光譜定量分析法。以粒徑約為55 nm的金納米粒子為拉曼活性基底，以pH=5.0 HClKCl溶液為溶劑，釆用便攜式拉曼儀進(jìn)行分析。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到最佳測定條件（金納米溶膠濃縮倍數(shù)為50倍，激光照射時間為5 s，金納米溶膠與溶液的混合比例為1∶1），建立了食品中游離香豆素直接檢測方法，方法在1.0～100.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，檢出限為0.91 mg/L。將建立的分析方法用于蔬果、糖果、糕點(diǎn)等實(shí)際樣品中香豆素的檢測（樣品前處理過程：稱取10 g樣品于燒杯中，加入50 mL溶劑，超聲提取0.5 h后， 定容至100 mL，搖勻后過濾，取10 mL定容至100 mL，搖勻得到樣品處理液），香豆素含量在0.61～5.52 g/kg之間；樣品的加標(biāo)回收率為75.12%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～14%。結(jié)果表明， 本方法快速準(zhǔn)確、操作簡單，可用于水果、糖果、糕點(diǎn)中香豆素的快速檢測。

關(guān)鍵詞；表面增強(qiáng)拉曼光譜；定量分析； 金納米粒子； 快速檢測； 香豆素； 食品。

1引言

香豆素（Coumarin）化學(xué)名稱為12苯并吡喃酮，在酸性條件下穩(wěn)定存在，堿性條件下易開環(huán)。香豆素是一種天然植物次生產(chǎn)品，廣泛存在于自然界的一種內(nèi)酯類化合物，具有高毒性，于1820年發(fā)現(xiàn)于黑香豆中，主要以游離狀態(tài)和苷的形式存在于植物中[1]。香豆素是一種重要的香料，被廣泛用作香料香精，也用作飲料、食品、香煙等的增香劑。常香蘭素作為調(diào)料共同用于糕點(diǎn)、糖果中，或作為天然香料添加到煙草中[2～6]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)香豆素具有致癌性，因此有些國家制定了攝取的安全劑量。歐洲理事會在1988年規(guī)定香豆素在食品中的限量為2 mg/kg，澳大利亞對酒精中香豆素的限量為10 mg/kg，歐洲食品安全局規(guī)定在食品中的添加限量在5～50 mg/kg之間[7，8]。

研究香豆素在體內(nèi)的含量達(dá)到一定量時具有生理毒性，通過長期的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有肝毒性[2]，主要是由于代謝的途徑導(dǎo)致P450（細(xì)胞色素P）及其依賴性酶的減少導(dǎo)致肝毒性。由于香豆素的潛在的不良反應(yīng)，美國于2011年禁止在食品中添加由香豆屬類植物中提取的香豆素[9]。

目前，香豆素檢測方法有酶聯(lián)免疫法[10]高效液相色譜檢測[11～13]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[14]、熒光光譜法[18～22]以及毛細(xì)管電泳法[23]等。酶聯(lián)免疫法只是診斷的輔助手段，易出現(xiàn)假陽性；色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法操作過程繁瑣、耗時長， 常用到有毒有害的有機(jī)溶劑；熒光光譜法干擾大、靈敏度較低；毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性差。因此，建立香豆素的方便快捷，選擇性高的檢測方法具有重要意義。近年來表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surfaceenhanced raman spectroscopy， SERS）作為一種新型有效的指紋光譜技術(shù)，具有方便快速、檢測成本低、分析速度快、便攜性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、毒品檢測領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力[24，25]。利用貴金屬納米粒子的SERS效應(yīng)，可以將拉曼信號的靈敏度提高104～1014個數(shù)量級。本研究建立了食品中香豆素的表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測分析方法， 與傳統(tǒng)檢測方法相比，本方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Delta Nu Inspector便攜式拉曼儀（功率為120 MW， 美國DeltaNu公司）； A TG16離心機(jī)（湘儀儀器有限公司）； FA1604分析天平（上海天平儀器廠）； 攪拌器（Midea MJ250BP02A）； B廣泛試紙（114，上海三愛思試劑有限公司）； 超聲波清洗機(jī)（SCIENTZ SB5200D， 寧波新芝生物科技股份有限公司）。 金納米粒子溶液（由廈門大學(xué)提供，其濃度約為2.94×10

Symbolm@@ 4 mol/L，金納米粒子半徑約為55 nm）； HCl（分析純，36%～38%，廣州化學(xué)試劑二廠）； KCl（分析純， 廣州化學(xué)試劑）； 香豆素（阿拉丁試劑）； 王水（自配）； H2SO430%H2O2溶液（3∶1， V/V）； 純水（怡寶純凈水）。蘋果購于附近的水果市場； 西紅柿購于附近的菜市場、燕麥、糕點(diǎn)和糖果均購于超市。

2.2分析方法

2.2.1樣品制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1000 g香豆素標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中， 用HClKCl混合溶液（pH 5.0）溶解并定容至100 mL，得到1000 mg/L香豆素儲備液。取適量香豆素儲備液，用HClKCl混合溶液逐級稀釋成0.0 ， 1.0， 2.0， 5.0， 10， 20， 50， 100， 200， 300， 400和500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，密封、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品處理：將樣品除去非食用部分后磨碎，準(zhǔn)確稱取10 g樣品于燒杯中，加入50 mL HClKCl混合液，超聲浸泡0.5 h后，用HClKCl混合液定容至100 mL，搖勻后過濾，取10 mL濾液用HClKCl混合溶液定容至100 mL，搖勻后直接進(jìn)行SERS檢測。

通過公式（1）計算出樣品的香豆素含量：

ω=CmV/ms（1）

ω為質(zhì)量含量 （g/kg）， Cm為質(zhì)量濃度 （g/L）， V為溶液體積（L）， ms為樣品量（kg）。

2.2.2SERS檢測取2.0 μL一定濃縮倍數(shù)的金納米粒子于硅片光滑面上，加入量香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混合后，進(jìn)行調(diào)焦后獲得拉曼光譜，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

以HClKCl混合溶液（pH 5.0）為溶劑，不同金納米粒子的濃縮倍數(shù)下進(jìn)行檢測。金的濃縮倍數(shù)影響金納米粒子間的距離，影響物質(zhì)與金納米粒子間的相互作用，會引起拉曼響應(yīng)信號的變化。當(dāng)濃縮倍數(shù)為50倍時，香豆素的SERS響應(yīng)較好（圖3b），故濃縮倍數(shù)選擇50倍。

3.2.3激光照射時間

激光的作用是提供能量使分子獲得能量從而產(chǎn)生電子的躍遷，適當(dāng)增加激光照射時間能夠提高能量，發(fā)生躍遷的電子增加，響應(yīng)信號增強(qiáng)，但過長的照射時間會破壞分子的結(jié)構(gòu)，因此需要在適當(dāng)?shù)臅r間下進(jìn)行測定。在不同的激光照射時間進(jìn)行香豆素的SERS檢測發(fā)現(xiàn)，激光照射時間對香豆素的SERS響應(yīng)信號有較大影響，隨激光照射時間的延長，香豆素SERS信號呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)照射時間過長，高濃度香豆素的拉曼響應(yīng)信號容易溢出（圖4）。因此，激光照射時間選擇5 s。

3.2.4混合比例金納米粒子用量的增加使物質(zhì)與金納米粒子結(jié)合更充分，拉曼響應(yīng)信號有一定程度的增強(qiáng)，當(dāng)金納米粒子用量增加到一定程度時， 可能會對物質(zhì)形成比較厚的包裹層，降低物質(zhì)拉曼信號的檢測。選擇合適的比例有利于物質(zhì)的檢測。分別將待測液與金納米粒子以不同體積比混合均勻后檢測，1016 cm

Symbolm@@ 1處峰的強(qiáng)度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)體積比為1∶1時得到的峰面積最大，增強(qiáng)效果最明顯。因此，選擇待測液與金納米粒子的體積混合比例為1∶1作為最佳體積混合比，結(jié)果見圖5。

通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，選擇以為溶劑，濃縮倍數(shù)為50倍的金納米粒子為增強(qiáng)基底，激光照射時間為5 s，待測液與金納米粒子的體積比為1∶1作為香豆素檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

選擇激發(fā)光光源波長為785 nm，積分時間為5 s，平等測定3次取平均值，激光功率High，測定模式為Software，分辨率選擇Low，每測定一次扣除一次暗電流。

3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制香豆素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行SERS檢測，結(jié)果見圖6。在1.0～100 mg/L范圍內(nèi)，香豆素在1016 cm

Symbolm@@ 1處的拉曼光譜峰面積（y）與香豆素的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1354+1945x，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9987。

對1.0 mg/L香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液測定15次，以3倍信噪比計算得到檢出限為0.91 mg/L。

蘋果、燕麥、西紅柿、1號糖果和2號糖果中香豆素含量分別為0.82， 0.80， 0.61， 5.52和1.51 g/kg，糕點(diǎn)中均未檢出1號糖果中香豆素含量超出標(biāo)準(zhǔn)，其樣品香豆素含量均符合標(biāo)準(zhǔn)（European Council， 1988，≤2.0 g/kg）＼[5＼]；樣品加標(biāo)回收率為75.1%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.6%～14.0%，表明方法準(zhǔn)確度高，精密度好，結(jié)果可靠。

4結(jié)論

采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法建立了食品中香豆素的定量檢測方法，方法在1.0～100.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，其線性相關(guān)系數(shù)為0.9987，檢出限為0.91 mg/L。蘋果、燕麥、西紅柿、1號糖果、2號糖果中香豆素的含量分別為0.82， 0.80， 0.61， 5.52和1.51 g/kg，兩種糕點(diǎn)樣品中未檢出，1號糖果香豆素含量超出標(biāo)準(zhǔn)（European Council， 1988， ≤2.0 g/kg），樣品回收率為75.1%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為為0.6%～14%。方法具有樣品用量少、成本低、環(huán)境友好、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，適合于食品中香豆素快速檢測。

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AbstractA method was established for the determination of coumarin in various foods by surfaceenhanced Raman spectroscopy in a hydrochloric acidpotassium chloride solution （pH=5. 0） with 55 nm Au nanoparticles as Raman substrate. Under the optimal experiment conditions such as concentrated gold sol with concentration multiple of 50， 5 s of laser irradiation time and 1∶1 mixing ratio of gold sol and solution， the method was used for the direct determination of coumarin. The method had a good linearity between the peak intensity and the courmain concentration in the range of 1.00-100.0 mg/L， and the detection limit was 0.91 mg/L. For the determination of real samples of courmain in vegetables， fruits， sweets and pastries， 10 g of sample was added in 50 mL of hydrochloric acidpotassium chloride solution in a beaker， and then ultrasonically extracted for 0. 5 h. After transferred into a 100mL flask， the sample solution was filtered and 10 mL of supernatant was taken and diluted to 100 mL for the further analysis. The concentration of courmain was determined to be 0. 61-5.52 g/kg. The relative standard deviations were 0.6%-14.0%. The spiked recoveries of these samples ranged from 75.1% to 103.2%. This method is simple， and has wide linear range and high accuracy.

KeywordsSurfaceenhanced Raman spectroscopy； Quantitative analysis； Gold nanoparticles； Rapid detection； Coumarin； Foods

（Received 11 December 2014； accepted 12 April 2015）

This work was supported by the Major Scientific Instruments and Equipment Development Projects of China （No.2011YQ03012409） and the National Natural Science Foundation of China （Nos.21277176，21275168， 21127008）

中國化學(xué)會第二屆全國質(zhì)譜分析學(xué)術(shù)報告會（第一輪通知）

為促進(jìn)我國質(zhì)譜分析及相關(guān)研究的快速發(fā)展，增進(jìn)質(zhì)譜研究與應(yīng)用領(lǐng)域科技人員的學(xué)術(shù)交流與合作，由中國化學(xué)會及國家自然科學(xué)基金委主辦，中國化學(xué)會質(zhì)譜分析專業(yè)委員會與浙江大學(xué)承辦的“中國化學(xué)會第二屆全國質(zhì)譜分析學(xué)術(shù)報告會”將于2015年10月16日～19日在浙江大學(xué)紫金港校區(qū)召開。

本次會議將邀請多位院士和質(zhì)譜專家參會并作特邀報告。會議熱誠邀請全國從事質(zhì)譜研究與應(yīng)用、及相關(guān)儀器研究與開發(fā)等領(lǐng)域的廣大學(xué)者、研究生、相關(guān)單位代表及儀器廠商參會。

一、征文內(nèi)容：

應(yīng)征的論文是未曾發(fā)表的質(zhì)譜分析研究成果，涉及如下方面： 1 環(huán)境分析； 2 生命分析； 3 食品分析； 4 石油化工； 5 醫(yī)藥衛(wèi)生； 6 公共安全； 7 天然物及煙草； 8 裂解機(jī)理、方法； 9 新材料、新能源； 10 樣品前處理方法； 11 儀器研制與新技術(shù)； 12 其它。

征集的論文將被分為大會報告、邀請報告、口頭報告和墻報四種形式交流。大會將設(shè)優(yōu)秀青年報告獎和優(yōu)秀墻報獎。

二、征文格式與要求：

1. 請在會議網(wǎng)站（http：//www.mschina.org/）下載論文模板，嚴(yán)格按論文模板編輯，在線注冊投稿。請務(wù)必提供稿件聯(lián)系人、電話、通訊地址和Email。

2. 論文提交截止日期為2015年8月15日。

三、會議聯(lián)系人

柴云峰，電話： 0571-87951285，Email： hplcms@zju.edu.cn

潘遠(yuǎn)江，電話： 0571-87951629，Email： fticrms@zju.edu.cn

通訊地址：浙江大學(xué)玉泉校區(qū)化學(xué)系735室，310027。

有關(guān)會議的詳細(xì)介紹、組織機(jī)構(gòu)、征文格式、日程安排、賓館住宿等相關(guān)信息，請登錄會議網(wǎng)址（http：//www.mschina.org/） 查詢。

中國化學(xué)會質(zhì)譜分析專業(yè)委員會

浙江大學(xué)化學(xué)系