• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    解卷積定量核磁共振法測(cè)定黃芪注射液中8種初生代謝成分

    2015-08-13 07:32:14陳燕燕等
    分析化學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:黃芪注射液

    陳燕燕等

    摘要 應(yīng)用質(zhì)子核磁共振技術(shù)(1HNMR)結(jié)合解卷積的峰提取方法,建立了中藥黃芪注射液中氨基酸、有機(jī)酸類和糖類等8種初生代謝成分的含量檢測(cè)方法。注射液樣品經(jīng)冷凍干燥后精密稱取10 mg,加入0.6 mL D2O(含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL)用于NMR測(cè)試。根據(jù)1HNMR指紋譜,從黃芪注射液中鑒定出20種初生和4種次生代謝成分。應(yīng)用解卷積法提取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的定量峰,然后進(jìn)行峰面積積分,并采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各個(gè)成分的含量。在給定濃度范圍內(nèi),8種成分呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2>0.9990),精密度 RSD<3.8%,重現(xiàn)性RSD<2.7%,穩(wěn)定性RSD<4.5%,回收率為91.4%~102.7%。結(jié)果表明,與常規(guī)處理方法相比,解卷積檢峰再積分的方法可降低復(fù)雜體系中質(zhì)子信號(hào)峰的重疊度,獲得更加精確的定量峰積分面積,從而進(jìn)一步提高1HNMR含量分析的準(zhǔn)確度。采用本方法對(duì)5個(gè)廠家共20批黃芪注射液樣品中的8種初生代謝成分進(jìn)行了含量測(cè)定,并運(yùn)用主成分分析法對(duì)不同廠家的樣品進(jìn)行了聚類和區(qū)分。

    關(guān)鍵詞;定量核磁共振法; 解卷積; 黃芪注射液; 初生代謝成分

    1引言

    隨著儀器的發(fā)展,質(zhì)子核磁共振(Nuclear magnetic resonance,1HNMR)技術(shù)目前已逐漸應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域,其特點(diǎn)在于可同時(shí)提供化合物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量測(cè)定的定量信息,因此分析過程無需待測(cè)物對(duì)照品,且樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、不破壞樣品 [1~5]。1HNMR常用定量方法為絕對(duì)內(nèi)標(biāo)定量法,即以含量已知的內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物制成混合溶液同時(shí)測(cè)定圖譜,通過二者峰面積的比值確定待測(cè)物的含量[6]。在對(duì)混合物中的各個(gè)成分進(jìn)行定量分析時(shí),其關(guān)鍵在于每個(gè)成分定量峰的選擇,通常選擇完全獨(dú)立、無干擾的特征質(zhì)子信號(hào)峰進(jìn)行含量測(cè)定。將1HNMR指紋圖譜技術(shù)引入中藥注射液的化學(xué)成分表征中所面臨的難題是: 1HNMR譜的化學(xué)位移值范圍通常比較窄(δ 0~12),在該區(qū)間內(nèi)質(zhì)子信號(hào)峰相互重疊嚴(yán)重,不易尋找到完全獨(dú)立的信號(hào)峰用于多成分的含量測(cè)定。

    解卷積(Global spectral deconvolution,GSD)是一種1HNMR圖譜處理方法,可通過對(duì)全譜反褶積的精確校正鑒別復(fù)雜峰形,從復(fù)雜質(zhì)子信號(hào)中分離出重疊的信號(hào)峰。1HNMR譜在有雜質(zhì)峰、信號(hào)重疊和信噪比不高的情況下,可以使用解卷積提取定量峰計(jì)算積分面積確定化合物的濃度[7]。近來,已有相關(guān)報(bào)道運(yùn)用GSD分析方法對(duì)混合物進(jìn)行定量測(cè)定[8]。

    黃芪注射液,益氣養(yǎng)元,扶正祛邪,養(yǎng)心通脈,健脾利濕。作為臨床常用藥物用于心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝炎等癥狀,目前共有14家國內(nèi)藥企獲批生產(chǎn)。中國藥典和衛(wèi)生部頒布標(biāo)準(zhǔn)中黃芪藥材和黃芪注射液的定量指標(biāo)成分均為黃芪甲苷[9,10],并采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在前期研究中發(fā)現(xiàn),黃芪藥材中還存在大量氨基酸、有機(jī)酸、糖類化合物等初生代謝成分[11],但由于其極性較大,是常規(guī)反相HPLC方法的檢測(cè)盲點(diǎn)。本研究進(jìn)一步運(yùn)用質(zhì)子核磁共振(1HNMR)法對(duì)黃芪注射液中的化學(xué)成分進(jìn)行表征,并應(yīng)用定量1HNMR技術(shù)和解卷積處理方法對(duì)黃芪注射液中的多種初生代謝成分進(jìn)行含量測(cè)定。本研究將解卷積法引入中藥混合體系進(jìn)行含量測(cè)定,并測(cè)定了5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液樣品,比較了不同廠家樣品中初生代謝成分的含量差異。

    2實(shí)驗(yàn)部分

    2.1儀器與試劑

    BRUKER AVANCEⅢ600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀,質(zhì)子激發(fā)頻率600.23 MHz,配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀(瑞士Bruker公司); 5 mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管(美國Norell公司); D2O(氘代度>99.8%, 美國SigmaAldrich公司); 3(三甲基甲硅烷)丙酸d4鈉鹽(TSP)氘代度>98%(美國SigmaAldrich公司); 實(shí)驗(yàn)用黃芪注射液為市售產(chǎn)品,規(guī)格為每支裝10 mL,5個(gè)廠家共20批黃芪注射液,分別為QCB(1311102)、ZB(A20120709,A20130206)、SW(131001D2,130324D1,130803D2,130525D2,131116D3,130326D1,130313D2)、DL(1301072,1307222,1309212)、XY(1304023,1310022,1304011,1310031,1310103,1305081,1310072)。

    2.21HNMR測(cè)試條件

    采用zg30脈沖序列測(cè)定樣品溶液的1HNMR圖譜。測(cè)定溫度298 K,觀測(cè)頻率600.23 MHz,譜寬12019.2 Hz, 90°脈沖寬度13 μs,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536,掃描次數(shù)16次,延遲時(shí)間15 s,接受增益128。用TSP信號(hào)定標(biāo)。

    2.3樣品的制備

    取黃芪注射液樣品于

    Symbolm@@ 80℃冰箱中迅速冷凍,再將其放入真空冷凍干燥箱中凍干后精密稱取10 mg, 加入0.6 mL D2O(含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL),轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中,加封直接用于1HNMR測(cè)試。

    2.4方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

    2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品(乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸),置于2 mL容量瓶中,用含有TSP的D2O稀釋到刻度,搖勻,倍比稀釋得到5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,各取0.6 mL置于核磁管中,測(cè)定1HNMR圖譜,記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品定量峰的積分面積,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.4.2精密度和重復(fù)性取同一份黃芪注射液供試品溶液,在上述2.2項(xiàng)下條件下連續(xù)測(cè)定6次,記錄定量峰積分面積,計(jì)算精密度(RSD值)。取同一批次黃芪注射液供試品溶液6份,上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄定量峰積分面積,計(jì)算重復(fù)性(RSD值)。

    2.4.3穩(wěn)定性取同一份黃芪注射液供試品溶液,分別在0, 2, 4, 6, 8, 12和24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄積分面積,記錄定量峰積分面積,計(jì)算RSD值。

    2.4.4加樣回收率稱取同一批次黃芪注射液供試品5 mg,共6份; 然后分別稱取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,溶解、稀釋到濃度分別為0.08960, 0.9858, 0.4674, 0.2693, 0.4579, 0.3551, 0.0870和0.0289 mg/mL,取混合標(biāo)準(zhǔn)600 μL加入6份供試品中,在上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄積分面積,計(jì)算回收率。

    3結(jié)果與討論

    3.11HNMR指紋譜分析

    黃芪注射液樣品的1HNMR指紋譜(圖1)質(zhì)子信號(hào)峰分布在δ 0~9.5 之間,其中δ 0.0~3.2 是氨基酸和有機(jī)酸質(zhì)子信號(hào)區(qū),δ 3.2~5.5 是糖基質(zhì)子信號(hào)區(qū),δ 5.5~9.5為黃酮類質(zhì)子信號(hào)區(qū)

    根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況,并結(jié)合二維核磁相關(guān)信息,共鑒定出24種化學(xué)成分,其中包括4種次生代謝成分: 毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮7 OβD吡喃葡萄糖、芒柄花素、2′羥基3′,4′二甲氧基異黃烷7 OβD吡喃葡萄糖; 20種初生代謝成分: 7種氨基酸(亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、甘氨酸),5種有機(jī)酸(乳酸、乙酸、琥珀酸、丙二酸、甲酸),6種糖(葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、蜜三糖、阿拉伯糖),乙醇和甜菜堿。質(zhì)子信號(hào)的詳細(xì)歸屬見表1。

    紫色代表實(shí)驗(yàn)峰形(Purple: experimental peak shape); 綠色代表解卷積處理法的峰形(green: The peak shape of GSD processing)。

    面積進(jìn)行比較,計(jì)算8種成分的含量。

    3.3方法學(xué)考察結(jié)果

    方法學(xué)考察結(jié)果見表2,普通峰提取積分定量核磁法的乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9763~0.9990,精密度RSD為1.6%~4.6%,穩(wěn)定性RSD為0.75%~8.6%,重復(fù)性RSD為0.94%~4.6%,加樣回收率的范圍為80.7%~98.1%。

    綜合比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2和表3)顯示, 解卷積定量核磁法的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性總體優(yōu)于普通峰提取積分定量核磁法,尤其對(duì)質(zhì)子信號(hào)峰重疊度較高的脯氨酸和焦谷氨酸,以及端基質(zhì)子信號(hào)峰距水峰較近的葡萄糖和蔗糖的含量測(cè)定準(zhǔn)確度改善顯著。

    3.4樣品測(cè)定

    采用解卷積1HNMR定量分析法測(cè)定5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液中8種初生代謝成分(乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸)的含量。結(jié)果參見表4。

    3.5模式識(shí)別分析

    5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品的NMR數(shù)據(jù)(每批n=3),采用主成分分析(Principal components analysis,PCA)法對(duì)60個(gè)樣品進(jìn)行無監(jiān)督的模式識(shí)別分析。PCA碎石圖顯示: 主成分PC1和PC2的累積解釋變量超過90%(圖3A); 得分圖顯示: 5個(gè)廠家黃芪注射液樣品具有明顯的聚類和分組效果(圖3B)。圖4進(jìn)一步顯示: 乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分在5個(gè)廠家樣品中含量水平差異顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 8種初生代謝成分對(duì)區(qū)分不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品也具有重要作用。

    4結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)子核磁共振指紋譜檢測(cè)并鑒定出黃芪注射液中24種成分,其中20種為初生代謝成分,根據(jù)黃芪注射液的工藝\[10\]推測(cè)其中的乙醇可能來源于藥材提取過程中使用的溶劑,而其他19種初生代謝成分均為黃芪藥材中的化學(xué)成分。分別采用普通峰提取和解卷積峰提取的定量核磁法,對(duì)乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的含量進(jìn)行分析,方法學(xué)考察結(jié)果顯示: 對(duì)于重疊度較高的質(zhì)子信號(hào)峰,以及巨大溶劑峰信號(hào)旁邊的樣品質(zhì)子信號(hào)峰,解卷積定量核磁法可有效改善其含量測(cè)試的準(zhǔn)確度。應(yīng)用該方法對(duì)5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品中8種初生成分進(jìn)行定量分析,結(jié)合PCA模式識(shí)別法成功區(qū)分了不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品。結(jié)果顯示: 正大青春寶藥業(yè)樣品中除焦谷氨酸外,其他都趨于中等水平; 大理藥業(yè)樣品中氨基酸、有機(jī)酸和糖類成分的濃度相對(duì)偏低; 上海新亞藥業(yè)樣品中蔗糖的濃度較低,其他氨基酸和有機(jī)酸成分較其他廠家高。上述研究提示: 除黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等指標(biāo)成分,氨基酸、有機(jī)酸、糖類等初生代謝成分受不同廠家藥材來源、生產(chǎn)工藝影響也較大,是區(qū)分不同廠家黃芪注射液產(chǎn)品的重要指標(biāo)。

    References

    1Holzgrabe U, Wawer I, Diehl B (Eds.). NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis. Elsevier, 2011: 135-136

    2Sharma R, Gupa P K, Mazumder A, Dubey D K, Vijayaraghavan R. J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 2009, 49(4): 1092-1096

    3GAO ZhaoMing, ZHANG YuBing, YU YongLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39(4): 601-602

    高照明, 張玉冰, 于永良. 分析化學(xué), 2011, 39(4): 601-602

    4YU Shan, GUO QiangSheng, WANG HuiLin, GAO JianPing, XU Xu. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(1): 69-74

    禹 珊, 郭強(qiáng)勝, 王會(huì)琳, 高建平, 許 旭. 分析化學(xué), 2015, 43(1): 69-74

    5Schievano E, GuardiniK, Mammi S. J. Agric. Food Chem., 2009, 57(7): 2647-2652

    6Zoppi A, Linares M, Longhi M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2005, 37(3): 627-630

    7Carlos C, Felipe S, Santiago D, Stan S, Antony N D. Tony Davies Column, 2011, 23(1): 26-30

    8Michael A, Bernstein, Stan S, CHEN Peng, Agustin B, Carlos C. Anal. Chem., 2013, 5: 5778-5786

    9National Pharmacopoeia Committee. The Pharmacopoeia of the People′s Republic of China (Part Ⅰ, 2010). China Medical Science Press, 2011, 283-284

    國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典 (一部, 2010). 中國醫(yī)藥科技出版社, 2011, 283-284

    10Chinese Pharmacopoeia Committee. Drug Standard of Ministry of Health of the People′s Republic of China. China Medical Science Press, 2007, WS3B333598

    國家衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn). 中國醫(yī)藥科技出版社, 2007, WS3B333598

    11CHEN YanYan, LI XiaoNan WANG YueFei, JIANG MiaoMiao. China Science Paper, 2014, 12(9): 1410-1413

    陳燕燕, 李曉男, 王躍飛, 姜苗苗. 中國科技論文, 2014, 12(9): 1410-1413

    AbstractTo establish the quantification method for 8 primary metabolites (amino acids, organic acids and carbohydrates) in Huangqi Injection, proton magnetic resonance (1H NMR) technique was employed based on processing approach of global spectral deconvolution (GSD). About 10 mg of each sample was precisely weighed after freezedrying, and then directly dissolved in D2O for NMR analysis. 20 primary metabolites and 4 secondary metabolites were detected and identified in the same 1H NMR spectrum. Among them, 8 primary metabolites (acetate, proline, pyoglutamate, malonate, glycine, glucose, sucrose, formate) were selected to determine the contents using an internal standard method. In the given concentration ranges, it showed a good linear correlation for 8 components (R2>0.9990) , with the RSD of precision lower than 3.8%, the RSD of repeatability lower than 2.7%, the RSD of stability lower than 4.5%, and the recovery rate between 91.40%-102.7%. The results indicated more accurately integral areas could be obtained by GSD processing compared to the ordinary method, which further improved the accuracy of content analysis. 1H NMR method based on GSD was successfully used to determine the levels of 8 primary metabolites in Huangqi Injection samples of 20 batches from 5 manufacturers. The score plots of PCA also showed the samples from different manufacturers clustered and classified well.

    KeywordsProton magnetic resonance; Deconvolution; Huangqi Injection ; Primary metabolites

    (Received 23 January 2015; accepted 7 April 2015)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81303181)

    第八屆科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽征集合作期刊邀請(qǐng)函

    一、 科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽簡(jiǎn)介(以下簡(jiǎn)稱“大賽”)

    原創(chuàng)大賽以儀器信息網(wǎng)為平臺(tái),倡導(dǎo)“鼓勵(lì)創(chuàng)新、積極分享、促進(jìn)交流”的理念,挖掘原創(chuàng)精品,促進(jìn)分析人員的技術(shù)交流,提高行業(yè)整體儀器應(yīng)用水平。

    自2008年起,大賽已成功舉辦了七屆,參與人數(shù)近3000人,累計(jì)征集作品6600余篇,展現(xiàn)次數(shù)500萬次,合作期刊、媒體及展會(huì)100余家。深受業(yè)內(nèi)用戶的歡迎和支持,樹立了良好的品牌活動(dòng)形象。

    二、本屆大賽時(shí)間:2015年7月1日~9月30日

    三、本屆大賽網(wǎng)址:http://www.instrument.com.cn/activity/2015yc/

    四、大賽征稿對(duì)象和范圍

    1、征稿對(duì)象

    儀器使用者、分析測(cè)試從業(yè)人員、行業(yè)專家、廠商工程師等。儀器信息網(wǎng)注冊(cè)用戶即可參與(快速注冊(cè)地址: http://bbs.instrument.com.cn/)。

    2、征稿范圍

    共設(shè)立色譜、質(zhì)譜、光譜及X射線、材料測(cè)試、食品檢測(cè)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及采購、綜合類九個(gè)賽區(qū)。

    五、征集作品類別:儀器維護(hù)維修、儀器使用經(jīng)驗(yàn)、圖譜解析、分析方法開發(fā)與應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)室管理方法與建設(shè)、儀器選型、采購交流等多方面。

    六、2015年度大賽亮點(diǎn)

    2015年將舉辦第八屆原創(chuàng)大賽,本屆大賽禮品總價(jià)值超過10萬元,是儀器論壇2015年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng),儀器信息網(wǎng)將利用優(yōu)勢(shì)資源進(jìn)行全方位宣傳,征集原創(chuàng)作品近千篇,吸引百萬人次關(guān)注,將對(duì)行業(yè)產(chǎn)生廣泛和深遠(yuǎn)的影響力。

    同時(shí),大賽充分吸取往屆經(jīng)驗(yàn),結(jié)合大眾評(píng)審團(tuán)打分、網(wǎng)站和微信投票及專家打分三個(gè)方面選拔獲獎(jiǎng)作品。月度參賽作品將在擁有10萬粉絲的微信公眾平臺(tái)進(jìn)行投票;每個(gè)賽區(qū)邀請(qǐng)3位以上業(yè)內(nèi)知名專家進(jìn)行年度評(píng)審,并對(duì)參賽作品進(jìn)行點(diǎn)評(píng)。

    七、期刊與本屆原創(chuàng)大賽

    儀器論壇擁有超過200萬的科學(xué)儀器行業(yè)注冊(cè)會(huì)員,原創(chuàng)大賽作為儀器論壇年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng),擁有知名度高、宣傳度廣、影響力大的特點(diǎn)。

    原創(chuàng)大賽希望與期刊合作,所有參賽作品在網(wǎng)上參賽的同時(shí),可將論文格式的文章投稿合作期刊,并享受快速審稿的"綠色通道",在1個(gè)月內(nèi)獲得錄用與否的通知。

    與本屆原創(chuàng)大賽合作的期刊,可以在大賽頁面中設(shè)置獨(dú)立期刊介紹頁面。期刊可以通過大賽,收到大量投稿,此外,可以借助大賽平臺(tái)充分展現(xiàn)期刊特點(diǎn),極大的提升期刊影響力。

    猜你喜歡
    黃芪注射液
    黃芪注射液聯(lián)合氯沙坦治療IgA腎病合并高尿酸血癥的療效研究
    觀察黃芪注射液以及阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用于心臟病伴肺動(dòng)脈高壓治療中的可行性
    復(fù)合輔酶、黃芪注射液聯(lián)合α—干擾素治療小兒病毒性心肌炎療效觀察
    黃芪注射液聯(lián)合丹紅注射液治療骨折合并慢性心力衰竭的臨床價(jià)值分析
    黃芪注射液聯(lián)合阿托伐他汀治療急性心肌梗死的療效觀察
    黃芪注射液聯(lián)合鹽酸多奈哌齊片治療血管性癡呆的臨床研究
    探析縮宮素結(jié)合黃芪注射液用于協(xié)調(diào)性子宮收縮乏力治療的臨床療效
    黃芪注射液對(duì)白血病患兒感染因素的影響
    分析丹參注射液與黃芪注射液的臨床藥理及聯(lián)用研究
    復(fù)方丹參與黃芪注射液治療冠心病療效觀察
    国产成人a区在线观看| 两个人视频免费观看高清| 欧美bdsm另类| 99视频精品全部免费 在线| 久久久精品大字幕| 精品人妻熟女av久视频| 免费观看人在逋| 亚洲激情在线av| av在线蜜桃| 看黄色毛片网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 1024手机看黄色片| 天美传媒精品一区二区| 最新中文字幕久久久久| 熟女电影av网| 中文资源天堂在线| 99久国产av精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 香蕉av资源在线| 波多野结衣高清无吗| 免费无遮挡裸体视频| 国产色婷婷99| 亚洲精品456在线播放app | 在线观看一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产成人啪精品午夜网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 美女 人体艺术 gogo| 男女之事视频高清在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 九九在线视频观看精品| 91狼人影院| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产日本99.免费观看| 欧美黑人巨大hd| 午夜福利免费观看在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩国内少妇激情av| 免费在线观看日本一区| 亚洲av不卡在线观看| 国产真实乱freesex| 亚洲黑人精品在线| a级毛片a级免费在线| 丰满的人妻完整版| 色在线成人网| 亚洲成人久久性| 亚洲色图av天堂| 国产在线男女| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产单亲对白刺激| 久久午夜亚洲精品久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| avwww免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美区成人在线视频| 欧美乱色亚洲激情| 成人欧美大片| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 丰满的人妻完整版| 久久人人精品亚洲av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久人妻av系列| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 最近最新免费中文字幕在线| 嫩草影院精品99| 欧美精品国产亚洲| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品一区av在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲精品在线观看二区| 亚洲中文字幕日韩| 黄色一级大片看看| 成人一区二区视频在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久色成人| 97热精品久久久久久| 亚洲av熟女| 偷拍熟女少妇极品色| 有码 亚洲区| 88av欧美| 高清日韩中文字幕在线| 五月伊人婷婷丁香| av在线观看视频网站免费| 国产精品综合久久久久久久免费| .国产精品久久| 亚洲欧美日韩东京热| 在线播放无遮挡| 国产精品野战在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本三级黄在线观看| 老司机福利观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 热99re8久久精品国产| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 日本与韩国留学比较| 嫩草影视91久久| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美不卡视频在线免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 91狼人影院| 亚洲无线观看免费| 成人精品一区二区免费| 怎么达到女性高潮| 久久人妻av系列| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久国产精品影院| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产探花极品一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费观看精品视频网站| 怎么达到女性高潮| 天堂网av新在线| av在线老鸭窝| av在线老鸭窝| 男女那种视频在线观看| 国产综合懂色| av在线老鸭窝| 日本一本二区三区精品| 国产精品一区二区免费欧美| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲avbb在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 99久国产av精品| 午夜福利成人在线免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久久久久久免 | 99精品在免费线老司机午夜| 美女被艹到高潮喷水动态| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 怎么达到女性高潮| 日日夜夜操网爽| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜日韩欧美国产| 91在线观看av| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 搞女人的毛片| 久久国产乱子免费精品| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 色在线成人网| 日韩中字成人| 久久久成人免费电影| 日韩欧美三级三区| 久久人人爽人人爽人人片va | 桃红色精品国产亚洲av| 久久午夜亚洲精品久久| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 三级毛片av免费| 欧美黄色淫秽网站| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美高清性xxxxhd video| 直男gayav资源| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品一区二区免费欧美| 美女被艹到高潮喷水动态| 18+在线观看网站| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产精品合色在线| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 精品国产亚洲在线| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲真实伦在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 久久这里只有精品中国| 亚洲av美国av| 精品久久国产蜜桃| 免费大片18禁| 99久久无色码亚洲精品果冻| 最后的刺客免费高清国语| 毛片女人毛片| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久草成人影院| 午夜久久久久精精品| 国产探花在线观看一区二区| 中文字幕av在线有码专区| 在线观看舔阴道视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久 | 日韩大尺度精品在线看网址| 波多野结衣巨乳人妻| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美区成人在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 午夜影院日韩av| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲18禁久久av| 亚洲最大成人av| 欧美黑人巨大hd| 国产欧美日韩一区二区精品| xxxwww97欧美| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲av成人精品一区久久| 免费av观看视频| 婷婷亚洲欧美| 我的老师免费观看完整版| 无遮挡黄片免费观看| www日本黄色视频网| 精品乱码久久久久久99久播| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品日产1卡2卡| 伦理电影大哥的女人| 日本 av在线| www.999成人在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 老鸭窝网址在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 色综合欧美亚洲国产小说| 老女人水多毛片| 看黄色毛片网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| av在线蜜桃| 美女免费视频网站| 黄片小视频在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久99久视频精品免费| 日本三级黄在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 直男gayav资源| 中文字幕高清在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 两个人的视频大全免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产精品,欧美在线| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 高清在线国产一区| 国产黄片美女视频| 精品一区二区免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩欧美 国产精品| 90打野战视频偷拍视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲午夜理论影院| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费观看人在逋| 久久久久国内视频| 床上黄色一级片| 亚洲18禁久久av| 欧美zozozo另类| 日韩 亚洲 欧美在线| 直男gayav资源| 国产伦一二天堂av在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产一区二区在线观看日韩| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产高清视频在线观看网站| 亚洲av熟女| 国内精品久久久久久久电影| 真实男女啪啪啪动态图| 国产毛片a区久久久久| 午夜福利高清视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 最近在线观看免费完整版| 国产成人啪精品午夜网站| 在线播放无遮挡| 免费在线观看影片大全网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 我要看日韩黄色一级片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 人人妻人人看人人澡| 久久精品91蜜桃| avwww免费| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 成人国产一区最新在线观看| 宅男免费午夜| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 美女 人体艺术 gogo| 天堂网av新在线| 在线观看免费视频日本深夜| 精品久久久久久久久亚洲 | 色综合站精品国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品99久久久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 宅男免费午夜| 最近最新免费中文字幕在线| 如何舔出高潮| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久久九九精品二区国产| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜福利在线观看吧| 如何舔出高潮| 国产伦在线观看视频一区| 97碰自拍视频| 亚洲av成人av| 久久九九热精品免费| av黄色大香蕉| 国产精品1区2区在线观看.| 精品久久久久久久久亚洲 | 18禁在线播放成人免费| 午夜激情福利司机影院| 99精品在免费线老司机午夜| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| a级毛片a级免费在线| 亚洲最大成人手机在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 少妇高潮的动态图| www日本黄色视频网| 天美传媒精品一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品野战在线观看| 亚洲成人久久性| 天堂动漫精品| 一本一本综合久久| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲美女视频黄频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本五十路高清| 嫩草影院精品99| 在线看三级毛片| 欧美日本视频| 亚洲精品在线观看二区| 少妇的逼好多水| 久久久国产成人免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 三级国产精品欧美在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 久久九九热精品免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久中文看片网| 免费观看的影片在线观看| 国产综合懂色| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 一本一本综合久久| 中文字幕久久专区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产一区二区在线av高清观看| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99热6这里只有精品| 中文资源天堂在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 日韩欧美免费精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品女同一区二区软件 | 一级黄片播放器| 久久久久免费精品人妻一区二区| 无遮挡黄片免费观看| а√天堂www在线а√下载| 老司机午夜福利在线观看视频| 国内精品一区二区在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲美女搞黄在线观看 | a在线观看视频网站| 99热这里只有是精品50| av在线蜜桃| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色视频www国产| 成人国产综合亚洲| 国产欧美日韩一区二区三| 日本一二三区视频观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲 国产 在线| 观看美女的网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 哪里可以看免费的av片| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品亚洲美女久久久| 一a级毛片在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品一区二区三区av网在线观看| 1000部很黄的大片| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产单亲对白刺激| 波野结衣二区三区在线| 波多野结衣高清作品| 国内精品久久久久久久电影| 日本熟妇午夜| 亚洲综合色惰| 国产真实乱freesex| 欧美日韩国产亚洲二区| av欧美777| 男人和女人高潮做爰伦理| 中文字幕av在线有码专区| 一级a爱片免费观看的视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产成人a区在线观看| 嫩草影视91久久| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品电影一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 精品久久久久久久久久久久久| 国产高潮美女av| 国产黄色小视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩欧美免费精品| 国产av一区在线观看免费| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久人妻av系列| 日本五十路高清| 色精品久久人妻99蜜桃| av专区在线播放| 国产不卡一卡二| 1024手机看黄色片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 哪里可以看免费的av片| 国产单亲对白刺激| 一区二区三区激情视频| 乱人视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 夜夜爽天天搞| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 丰满的人妻完整版| 三级毛片av免费| 婷婷精品国产亚洲av| 久久精品综合一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 免费在线观看影片大全网站| 51午夜福利影视在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜福利高清视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产不卡一卡二| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久久久久久黄片| 在线免费观看不下载黄p国产 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美zozozo另类| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品国产三级普通话版| 午夜激情福利司机影院| 久久香蕉精品热| 欧美日韩乱码在线| 看免费av毛片| 久久精品国产自在天天线| 可以在线观看的亚洲视频| 波野结衣二区三区在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 99热这里只有是精品50| 婷婷色综合大香蕉| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美区成人在线视频| 一个人免费在线观看电影| 国产探花在线观看一区二区| 久久亚洲精品不卡| 国内精品久久久久久久电影| 一级作爱视频免费观看| 少妇高潮的动态图| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产综合懂色| av国产免费在线观看| 国产成人av教育| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品野战在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美精品免费久久 | 嫩草影院精品99| 天堂网av新在线| 亚洲美女视频黄频| 性欧美人与动物交配| 精品一区二区三区人妻视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 变态另类丝袜制服| 国产综合懂色| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久99热6这里只有精品| 日韩欧美 国产精品| 国产成人影院久久av| 国产毛片a区久久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日日夜夜操网爽| 亚洲,欧美精品.| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品人妻1区二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 小说图片视频综合网站| av视频在线观看入口| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 波多野结衣高清作品| 精品久久久久久久久久久久久| av国产免费在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成人久久性| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一夜夜www| 搡老熟女国产l中国老女人| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 99久久精品热视频| 校园春色视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产一区二区三区视频了| 在线观看午夜福利视频| 精品福利观看| 日本a在线网址| 久久久久久久久久成人| 我要看日韩黄色一级片| 成人精品一区二区免费| 有码 亚洲区| 国产探花在线观看一区二区| 深夜精品福利| 九色国产91popny在线| 国产欧美日韩一区二区三| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美在线黄色| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 好男人电影高清在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 免费在线观看影片大全网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品国产亚洲在线| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国模一区二区三区四区视频| 一个人看的www免费观看视频| 色播亚洲综合网| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美精品啪啪一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲欧美激情综合另类| av天堂在线播放| 久久99热6这里只有精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 女人被狂操c到高潮| 久久国产乱子免费精品| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲av一区综合| 日韩国内少妇激情av| 欧美激情在线99| h日本视频在线播放| 欧美黑人巨大hd| 国产老妇女一区| 久久九九热精品免费| av在线蜜桃| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜福利18| 色综合欧美亚洲国产小说| av欧美777| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av成人av| 看黄色毛片网站| 欧美激情在线99| 黄色日韩在线| 青草久久国产| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产野战对白在线观看| 91麻豆av在线| 国产主播在线观看一区二区| 国产av一区在线观看免费| 亚洲av美国av| 成人欧美大片|