• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    解卷積定量核磁共振法測(cè)定黃芪注射液中8種初生代謝成分

    2015-08-13 07:32:14陳燕燕等
    分析化學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:黃芪注射液

    陳燕燕等

    摘要 應(yīng)用質(zhì)子核磁共振技術(shù)(1HNMR)結(jié)合解卷積的峰提取方法,建立了中藥黃芪注射液中氨基酸、有機(jī)酸類和糖類等8種初生代謝成分的含量檢測(cè)方法。注射液樣品經(jīng)冷凍干燥后精密稱取10 mg,加入0.6 mL D2O(含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL)用于NMR測(cè)試。根據(jù)1HNMR指紋譜,從黃芪注射液中鑒定出20種初生和4種次生代謝成分。應(yīng)用解卷積法提取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的定量峰,然后進(jìn)行峰面積積分,并采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各個(gè)成分的含量。在給定濃度范圍內(nèi),8種成分呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2>0.9990),精密度 RSD<3.8%,重現(xiàn)性RSD<2.7%,穩(wěn)定性RSD<4.5%,回收率為91.4%~102.7%。結(jié)果表明,與常規(guī)處理方法相比,解卷積檢峰再積分的方法可降低復(fù)雜體系中質(zhì)子信號(hào)峰的重疊度,獲得更加精確的定量峰積分面積,從而進(jìn)一步提高1HNMR含量分析的準(zhǔn)確度。采用本方法對(duì)5個(gè)廠家共20批黃芪注射液樣品中的8種初生代謝成分進(jìn)行了含量測(cè)定,并運(yùn)用主成分分析法對(duì)不同廠家的樣品進(jìn)行了聚類和區(qū)分。

    關(guān)鍵詞;定量核磁共振法; 解卷積; 黃芪注射液; 初生代謝成分

    1引言

    隨著儀器的發(fā)展,質(zhì)子核磁共振(Nuclear magnetic resonance,1HNMR)技術(shù)目前已逐漸應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域,其特點(diǎn)在于可同時(shí)提供化合物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量測(cè)定的定量信息,因此分析過程無需待測(cè)物對(duì)照品,且樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、不破壞樣品 [1~5]。1HNMR常用定量方法為絕對(duì)內(nèi)標(biāo)定量法,即以含量已知的內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物制成混合溶液同時(shí)測(cè)定圖譜,通過二者峰面積的比值確定待測(cè)物的含量[6]。在對(duì)混合物中的各個(gè)成分進(jìn)行定量分析時(shí),其關(guān)鍵在于每個(gè)成分定量峰的選擇,通常選擇完全獨(dú)立、無干擾的特征質(zhì)子信號(hào)峰進(jìn)行含量測(cè)定。將1HNMR指紋圖譜技術(shù)引入中藥注射液的化學(xué)成分表征中所面臨的難題是: 1HNMR譜的化學(xué)位移值范圍通常比較窄(δ 0~12),在該區(qū)間內(nèi)質(zhì)子信號(hào)峰相互重疊嚴(yán)重,不易尋找到完全獨(dú)立的信號(hào)峰用于多成分的含量測(cè)定。

    解卷積(Global spectral deconvolution,GSD)是一種1HNMR圖譜處理方法,可通過對(duì)全譜反褶積的精確校正鑒別復(fù)雜峰形,從復(fù)雜質(zhì)子信號(hào)中分離出重疊的信號(hào)峰。1HNMR譜在有雜質(zhì)峰、信號(hào)重疊和信噪比不高的情況下,可以使用解卷積提取定量峰計(jì)算積分面積確定化合物的濃度[7]。近來,已有相關(guān)報(bào)道運(yùn)用GSD分析方法對(duì)混合物進(jìn)行定量測(cè)定[8]。

    黃芪注射液,益氣養(yǎng)元,扶正祛邪,養(yǎng)心通脈,健脾利濕。作為臨床常用藥物用于心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝炎等癥狀,目前共有14家國內(nèi)藥企獲批生產(chǎn)。中國藥典和衛(wèi)生部頒布標(biāo)準(zhǔn)中黃芪藥材和黃芪注射液的定量指標(biāo)成分均為黃芪甲苷[9,10],并采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在前期研究中發(fā)現(xiàn),黃芪藥材中還存在大量氨基酸、有機(jī)酸、糖類化合物等初生代謝成分[11],但由于其極性較大,是常規(guī)反相HPLC方法的檢測(cè)盲點(diǎn)。本研究進(jìn)一步運(yùn)用質(zhì)子核磁共振(1HNMR)法對(duì)黃芪注射液中的化學(xué)成分進(jìn)行表征,并應(yīng)用定量1HNMR技術(shù)和解卷積處理方法對(duì)黃芪注射液中的多種初生代謝成分進(jìn)行含量測(cè)定。本研究將解卷積法引入中藥混合體系進(jìn)行含量測(cè)定,并測(cè)定了5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液樣品,比較了不同廠家樣品中初生代謝成分的含量差異。

    2實(shí)驗(yàn)部分

    2.1儀器與試劑

    BRUKER AVANCEⅢ600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀,質(zhì)子激發(fā)頻率600.23 MHz,配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀(瑞士Bruker公司); 5 mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管(美國Norell公司); D2O(氘代度>99.8%, 美國SigmaAldrich公司); 3(三甲基甲硅烷)丙酸d4鈉鹽(TSP)氘代度>98%(美國SigmaAldrich公司); 實(shí)驗(yàn)用黃芪注射液為市售產(chǎn)品,規(guī)格為每支裝10 mL,5個(gè)廠家共20批黃芪注射液,分別為QCB(1311102)、ZB(A20120709,A20130206)、SW(131001D2,130324D1,130803D2,130525D2,131116D3,130326D1,130313D2)、DL(1301072,1307222,1309212)、XY(1304023,1310022,1304011,1310031,1310103,1305081,1310072)。

    2.21HNMR測(cè)試條件

    采用zg30脈沖序列測(cè)定樣品溶液的1HNMR圖譜。測(cè)定溫度298 K,觀測(cè)頻率600.23 MHz,譜寬12019.2 Hz, 90°脈沖寬度13 μs,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536,掃描次數(shù)16次,延遲時(shí)間15 s,接受增益128。用TSP信號(hào)定標(biāo)。

    2.3樣品的制備

    取黃芪注射液樣品于

    Symbolm@@ 80℃冰箱中迅速冷凍,再將其放入真空冷凍干燥箱中凍干后精密稱取10 mg, 加入0.6 mL D2O(含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL),轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中,加封直接用于1HNMR測(cè)試。

    2.4方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

    2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品(乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸),置于2 mL容量瓶中,用含有TSP的D2O稀釋到刻度,搖勻,倍比稀釋得到5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,各取0.6 mL置于核磁管中,測(cè)定1HNMR圖譜,記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品定量峰的積分面積,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.4.2精密度和重復(fù)性取同一份黃芪注射液供試品溶液,在上述2.2項(xiàng)下條件下連續(xù)測(cè)定6次,記錄定量峰積分面積,計(jì)算精密度(RSD值)。取同一批次黃芪注射液供試品溶液6份,上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄定量峰積分面積,計(jì)算重復(fù)性(RSD值)。

    2.4.3穩(wěn)定性取同一份黃芪注射液供試品溶液,分別在0, 2, 4, 6, 8, 12和24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄積分面積,記錄定量峰積分面積,計(jì)算RSD值。

    2.4.4加樣回收率稱取同一批次黃芪注射液供試品5 mg,共6份; 然后分別稱取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,溶解、稀釋到濃度分別為0.08960, 0.9858, 0.4674, 0.2693, 0.4579, 0.3551, 0.0870和0.0289 mg/mL,取混合標(biāo)準(zhǔn)600 μL加入6份供試品中,在上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄積分面積,計(jì)算回收率。

    3結(jié)果與討論

    3.11HNMR指紋譜分析

    黃芪注射液樣品的1HNMR指紋譜(圖1)質(zhì)子信號(hào)峰分布在δ 0~9.5 之間,其中δ 0.0~3.2 是氨基酸和有機(jī)酸質(zhì)子信號(hào)區(qū),δ 3.2~5.5 是糖基質(zhì)子信號(hào)區(qū),δ 5.5~9.5為黃酮類質(zhì)子信號(hào)區(qū)

    根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況,并結(jié)合二維核磁相關(guān)信息,共鑒定出24種化學(xué)成分,其中包括4種次生代謝成分: 毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮7 OβD吡喃葡萄糖、芒柄花素、2′羥基3′,4′二甲氧基異黃烷7 OβD吡喃葡萄糖; 20種初生代謝成分: 7種氨基酸(亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、甘氨酸),5種有機(jī)酸(乳酸、乙酸、琥珀酸、丙二酸、甲酸),6種糖(葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、蜜三糖、阿拉伯糖),乙醇和甜菜堿。質(zhì)子信號(hào)的詳細(xì)歸屬見表1。

    紫色代表實(shí)驗(yàn)峰形(Purple: experimental peak shape); 綠色代表解卷積處理法的峰形(green: The peak shape of GSD processing)。

    面積進(jìn)行比較,計(jì)算8種成分的含量。

    3.3方法學(xué)考察結(jié)果

    方法學(xué)考察結(jié)果見表2,普通峰提取積分定量核磁法的乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9763~0.9990,精密度RSD為1.6%~4.6%,穩(wěn)定性RSD為0.75%~8.6%,重復(fù)性RSD為0.94%~4.6%,加樣回收率的范圍為80.7%~98.1%。

    綜合比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2和表3)顯示, 解卷積定量核磁法的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性總體優(yōu)于普通峰提取積分定量核磁法,尤其對(duì)質(zhì)子信號(hào)峰重疊度較高的脯氨酸和焦谷氨酸,以及端基質(zhì)子信號(hào)峰距水峰較近的葡萄糖和蔗糖的含量測(cè)定準(zhǔn)確度改善顯著。

    3.4樣品測(cè)定

    采用解卷積1HNMR定量分析法測(cè)定5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液中8種初生代謝成分(乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸)的含量。結(jié)果參見表4。

    3.5模式識(shí)別分析

    5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品的NMR數(shù)據(jù)(每批n=3),采用主成分分析(Principal components analysis,PCA)法對(duì)60個(gè)樣品進(jìn)行無監(jiān)督的模式識(shí)別分析。PCA碎石圖顯示: 主成分PC1和PC2的累積解釋變量超過90%(圖3A); 得分圖顯示: 5個(gè)廠家黃芪注射液樣品具有明顯的聚類和分組效果(圖3B)。圖4進(jìn)一步顯示: 乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分在5個(gè)廠家樣品中含量水平差異顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 8種初生代謝成分對(duì)區(qū)分不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品也具有重要作用。

    4結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)子核磁共振指紋譜檢測(cè)并鑒定出黃芪注射液中24種成分,其中20種為初生代謝成分,根據(jù)黃芪注射液的工藝\[10\]推測(cè)其中的乙醇可能來源于藥材提取過程中使用的溶劑,而其他19種初生代謝成分均為黃芪藥材中的化學(xué)成分。分別采用普通峰提取和解卷積峰提取的定量核磁法,對(duì)乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的含量進(jìn)行分析,方法學(xué)考察結(jié)果顯示: 對(duì)于重疊度較高的質(zhì)子信號(hào)峰,以及巨大溶劑峰信號(hào)旁邊的樣品質(zhì)子信號(hào)峰,解卷積定量核磁法可有效改善其含量測(cè)試的準(zhǔn)確度。應(yīng)用該方法對(duì)5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品中8種初生成分進(jìn)行定量分析,結(jié)合PCA模式識(shí)別法成功區(qū)分了不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品。結(jié)果顯示: 正大青春寶藥業(yè)樣品中除焦谷氨酸外,其他都趨于中等水平; 大理藥業(yè)樣品中氨基酸、有機(jī)酸和糖類成分的濃度相對(duì)偏低; 上海新亞藥業(yè)樣品中蔗糖的濃度較低,其他氨基酸和有機(jī)酸成分較其他廠家高。上述研究提示: 除黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等指標(biāo)成分,氨基酸、有機(jī)酸、糖類等初生代謝成分受不同廠家藥材來源、生產(chǎn)工藝影響也較大,是區(qū)分不同廠家黃芪注射液產(chǎn)品的重要指標(biāo)。

    References

    1Holzgrabe U, Wawer I, Diehl B (Eds.). NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis. Elsevier, 2011: 135-136

    2Sharma R, Gupa P K, Mazumder A, Dubey D K, Vijayaraghavan R. J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 2009, 49(4): 1092-1096

    3GAO ZhaoMing, ZHANG YuBing, YU YongLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39(4): 601-602

    高照明, 張玉冰, 于永良. 分析化學(xué), 2011, 39(4): 601-602

    4YU Shan, GUO QiangSheng, WANG HuiLin, GAO JianPing, XU Xu. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(1): 69-74

    禹 珊, 郭強(qiáng)勝, 王會(huì)琳, 高建平, 許 旭. 分析化學(xué), 2015, 43(1): 69-74

    5Schievano E, GuardiniK, Mammi S. J. Agric. Food Chem., 2009, 57(7): 2647-2652

    6Zoppi A, Linares M, Longhi M. J. Pharm. Biomed. Anal., 2005, 37(3): 627-630

    7Carlos C, Felipe S, Santiago D, Stan S, Antony N D. Tony Davies Column, 2011, 23(1): 26-30

    8Michael A, Bernstein, Stan S, CHEN Peng, Agustin B, Carlos C. Anal. Chem., 2013, 5: 5778-5786

    9National Pharmacopoeia Committee. The Pharmacopoeia of the People′s Republic of China (Part Ⅰ, 2010). China Medical Science Press, 2011, 283-284

    國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典 (一部, 2010). 中國醫(yī)藥科技出版社, 2011, 283-284

    10Chinese Pharmacopoeia Committee. Drug Standard of Ministry of Health of the People′s Republic of China. China Medical Science Press, 2007, WS3B333598

    國家衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn). 中國醫(yī)藥科技出版社, 2007, WS3B333598

    11CHEN YanYan, LI XiaoNan WANG YueFei, JIANG MiaoMiao. China Science Paper, 2014, 12(9): 1410-1413

    陳燕燕, 李曉男, 王躍飛, 姜苗苗. 中國科技論文, 2014, 12(9): 1410-1413

    AbstractTo establish the quantification method for 8 primary metabolites (amino acids, organic acids and carbohydrates) in Huangqi Injection, proton magnetic resonance (1H NMR) technique was employed based on processing approach of global spectral deconvolution (GSD). About 10 mg of each sample was precisely weighed after freezedrying, and then directly dissolved in D2O for NMR analysis. 20 primary metabolites and 4 secondary metabolites were detected and identified in the same 1H NMR spectrum. Among them, 8 primary metabolites (acetate, proline, pyoglutamate, malonate, glycine, glucose, sucrose, formate) were selected to determine the contents using an internal standard method. In the given concentration ranges, it showed a good linear correlation for 8 components (R2>0.9990) , with the RSD of precision lower than 3.8%, the RSD of repeatability lower than 2.7%, the RSD of stability lower than 4.5%, and the recovery rate between 91.40%-102.7%. The results indicated more accurately integral areas could be obtained by GSD processing compared to the ordinary method, which further improved the accuracy of content analysis. 1H NMR method based on GSD was successfully used to determine the levels of 8 primary metabolites in Huangqi Injection samples of 20 batches from 5 manufacturers. The score plots of PCA also showed the samples from different manufacturers clustered and classified well.

    KeywordsProton magnetic resonance; Deconvolution; Huangqi Injection ; Primary metabolites

    (Received 23 January 2015; accepted 7 April 2015)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81303181)

    第八屆科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽征集合作期刊邀請(qǐng)函

    一、 科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽簡(jiǎn)介(以下簡(jiǎn)稱“大賽”)

    原創(chuàng)大賽以儀器信息網(wǎng)為平臺(tái),倡導(dǎo)“鼓勵(lì)創(chuàng)新、積極分享、促進(jìn)交流”的理念,挖掘原創(chuàng)精品,促進(jìn)分析人員的技術(shù)交流,提高行業(yè)整體儀器應(yīng)用水平。

    自2008年起,大賽已成功舉辦了七屆,參與人數(shù)近3000人,累計(jì)征集作品6600余篇,展現(xiàn)次數(shù)500萬次,合作期刊、媒體及展會(huì)100余家。深受業(yè)內(nèi)用戶的歡迎和支持,樹立了良好的品牌活動(dòng)形象。

    二、本屆大賽時(shí)間:2015年7月1日~9月30日

    三、本屆大賽網(wǎng)址:http://www.instrument.com.cn/activity/2015yc/

    四、大賽征稿對(duì)象和范圍

    1、征稿對(duì)象

    儀器使用者、分析測(cè)試從業(yè)人員、行業(yè)專家、廠商工程師等。儀器信息網(wǎng)注冊(cè)用戶即可參與(快速注冊(cè)地址: http://bbs.instrument.com.cn/)。

    2、征稿范圍

    共設(shè)立色譜、質(zhì)譜、光譜及X射線、材料測(cè)試、食品檢測(cè)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及采購、綜合類九個(gè)賽區(qū)。

    五、征集作品類別:儀器維護(hù)維修、儀器使用經(jīng)驗(yàn)、圖譜解析、分析方法開發(fā)與應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)室管理方法與建設(shè)、儀器選型、采購交流等多方面。

    六、2015年度大賽亮點(diǎn)

    2015年將舉辦第八屆原創(chuàng)大賽,本屆大賽禮品總價(jià)值超過10萬元,是儀器論壇2015年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng),儀器信息網(wǎng)將利用優(yōu)勢(shì)資源進(jìn)行全方位宣傳,征集原創(chuàng)作品近千篇,吸引百萬人次關(guān)注,將對(duì)行業(yè)產(chǎn)生廣泛和深遠(yuǎn)的影響力。

    同時(shí),大賽充分吸取往屆經(jīng)驗(yàn),結(jié)合大眾評(píng)審團(tuán)打分、網(wǎng)站和微信投票及專家打分三個(gè)方面選拔獲獎(jiǎng)作品。月度參賽作品將在擁有10萬粉絲的微信公眾平臺(tái)進(jìn)行投票;每個(gè)賽區(qū)邀請(qǐng)3位以上業(yè)內(nèi)知名專家進(jìn)行年度評(píng)審,并對(duì)參賽作品進(jìn)行點(diǎn)評(píng)。

    七、期刊與本屆原創(chuàng)大賽

    儀器論壇擁有超過200萬的科學(xué)儀器行業(yè)注冊(cè)會(huì)員,原創(chuàng)大賽作為儀器論壇年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng),擁有知名度高、宣傳度廣、影響力大的特點(diǎn)。

    原創(chuàng)大賽希望與期刊合作,所有參賽作品在網(wǎng)上參賽的同時(shí),可將論文格式的文章投稿合作期刊,并享受快速審稿的"綠色通道",在1個(gè)月內(nèi)獲得錄用與否的通知。

    與本屆原創(chuàng)大賽合作的期刊,可以在大賽頁面中設(shè)置獨(dú)立期刊介紹頁面。期刊可以通過大賽,收到大量投稿,此外,可以借助大賽平臺(tái)充分展現(xiàn)期刊特點(diǎn),極大的提升期刊影響力。

    猜你喜歡
    黃芪注射液
    黃芪注射液聯(lián)合氯沙坦治療IgA腎病合并高尿酸血癥的療效研究
    觀察黃芪注射液以及阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用于心臟病伴肺動(dòng)脈高壓治療中的可行性
    復(fù)合輔酶、黃芪注射液聯(lián)合α—干擾素治療小兒病毒性心肌炎療效觀察
    黃芪注射液聯(lián)合丹紅注射液治療骨折合并慢性心力衰竭的臨床價(jià)值分析
    黃芪注射液聯(lián)合阿托伐他汀治療急性心肌梗死的療效觀察
    黃芪注射液聯(lián)合鹽酸多奈哌齊片治療血管性癡呆的臨床研究
    探析縮宮素結(jié)合黃芪注射液用于協(xié)調(diào)性子宮收縮乏力治療的臨床療效
    黃芪注射液對(duì)白血病患兒感染因素的影響
    分析丹參注射液與黃芪注射液的臨床藥理及聯(lián)用研究
    復(fù)方丹參與黃芪注射液治療冠心病療效觀察
    日本a在线网址| 午夜免费成人在线视频| 亚洲图色成人| 国产亚洲精品久久久com| 天美传媒精品一区二区| 草草在线视频免费看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲美女黄片视频| 亚洲真实伦在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av二区三区四区| 国产在线男女| 麻豆国产av国片精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美成人a在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品,欧美在线| 少妇丰满av| 久久久午夜欧美精品| 国产三级在线视频| 成人国产麻豆网| 97超视频在线观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成熟少妇高潮喷水视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产 一区精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲三级黄色毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲国产精品成人综合色| 国产单亲对白刺激| 少妇高潮的动态图| 少妇被粗大猛烈的视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 色综合婷婷激情| 22中文网久久字幕| 亚洲精品国产成人久久av| 一本一本综合久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 全区人妻精品视频| 色吧在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品久久电影中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 草草在线视频免费看| 欧美黑人巨大hd| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久久久久久久久久黄片| 国产人妻一区二区三区在| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99热这里只有是精品50| 日日夜夜操网爽| 伊人久久精品亚洲午夜| 一区二区三区激情视频| 精品人妻1区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 综合色av麻豆| 国产成年人精品一区二区| 色哟哟·www| 欧美性猛交黑人性爽| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产精品成人综合色| 久99久视频精品免费| 最新在线观看一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 搞女人的毛片| 精品福利观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 动漫黄色视频在线观看| av.在线天堂| 国产熟女欧美一区二区| 欧美日韩综合久久久久久 | 免费在线观看影片大全网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲在线观看片| 国产高清三级在线| 国产色爽女视频免费观看| av黄色大香蕉| 日韩欧美在线乱码| 91在线观看av| 可以在线观看毛片的网站| 十八禁国产超污无遮挡网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 床上黄色一级片| 18禁在线播放成人免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产男人的电影天堂91| 国产伦人伦偷精品视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久久久久午夜电影| 久久久久久久精品吃奶| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美色视频一区免费| 国产美女午夜福利| 国产成人aa在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 精品欧美国产一区二区三| 国产欧美日韩一区二区精品| bbb黄色大片| 久9热在线精品视频| 三级毛片av免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产 一区 欧美 日韩| 联通29元200g的流量卡| 亚洲,欧美,日韩| 在线观看舔阴道视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产毛片a区久久久久| 黄色一级大片看看| 看十八女毛片水多多多| 999久久久精品免费观看国产| av在线蜜桃| 国产三级在线视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一区二区三区四区激情视频 | 精品久久久久久,| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久久久精品吃奶| 两个人视频免费观看高清| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲avbb在线观看| 免费人成在线观看视频色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 赤兔流量卡办理| 黄色一级大片看看| 亚洲电影在线观看av| 欧美+亚洲+日韩+国产| www日本黄色视频网| 日韩欧美三级三区| av视频在线观看入口| av女优亚洲男人天堂| 免费看日本二区| 99精品在免费线老司机午夜| 波野结衣二区三区在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产91精品成人一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久国产成人免费| 国产单亲对白刺激| 观看免费一级毛片| 日本熟妇午夜| 22中文网久久字幕| 午夜a级毛片| 久久久久久国产a免费观看| 午夜老司机福利剧场| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本三级黄在线观看| 久久久久久久久中文| 在线天堂最新版资源| 国产av在哪里看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜免费激情av| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 久久亚洲精品不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 内射极品少妇av片p| www.色视频.com| 日韩亚洲欧美综合| 成人永久免费在线观看视频| 久久久午夜欧美精品| 久久香蕉精品热| 又爽又黄a免费视频| 国产伦在线观看视频一区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品,欧美在线| 亚洲欧美清纯卡通| 99热这里只有精品一区| 国产高清三级在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产毛片a区久久久久| 一区二区三区激情视频| 亚洲综合色惰| 一区二区三区四区激情视频 | av中文乱码字幕在线| 99热网站在线观看| 欧美激情在线99| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品久久视频播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久9热在线精品视频| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品日产1卡2卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人三级黄色视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 又紧又爽又黄一区二区| 免费观看人在逋| 观看免费一级毛片| 精品国产三级普通话版| xxxwww97欧美| 国产视频一区二区在线看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久伊人网av| aaaaa片日本免费| 亚洲专区国产一区二区| av在线天堂中文字幕| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产三级中文精品| 久久九九热精品免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 内地一区二区视频在线| 亚洲真实伦在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇的逼好多水| 如何舔出高潮| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲四区av| 免费看光身美女| 亚洲av成人av| 真实男女啪啪啪动态图| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 51国产日韩欧美| h日本视频在线播放| 色综合站精品国产| 日本一本二区三区精品| 国产主播在线观看一区二区| 在线看三级毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 日本免费a在线| 亚洲在线观看片| 男女下面进入的视频免费午夜| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线a可以看的网站| 舔av片在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品久久国产高清桃花| 一个人看视频在线观看www免费| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品永久免费网站| 黄片wwwwww| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99视频精品全部免费 在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲无线观看免费| 久久久久久国产a免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品福利在线免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久久久久电影| 国模一区二区三区四区视频| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人美女网站在线观看视频| 美女黄网站色视频| 亚洲图色成人| 久久亚洲精品不卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av美国av| 高清在线国产一区| 午夜a级毛片| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| .国产精品久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产在线男女| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产av麻豆久久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国产在视频线在精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产视频内射| 亚洲真实伦在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本黄大片高清| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色综合站精品国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产男人的电影天堂91| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久这里只有精品中国| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲 国产 在线| 99在线视频只有这里精品首页| 全区人妻精品视频| 禁无遮挡网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 在线观看舔阴道视频| 久久久久久久午夜电影| 波多野结衣巨乳人妻| 九色成人免费人妻av| 乱码一卡2卡4卡精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 天堂网av新在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩欧美在线二视频| 美女大奶头视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 22中文网久久字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 欧美色视频一区免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产老妇女一区| 久久亚洲真实| 在线a可以看的网站| 欧美黑人巨大hd| 99久久九九国产精品国产免费| а√天堂www在线а√下载| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 老司机深夜福利视频在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av成人精品一区久久| 免费av毛片视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品一区二区三区人妻视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| 精品国产三级普通话版| 韩国av在线不卡| 国产亚洲精品av在线| 久久久成人免费电影| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲无线观看免费| 亚洲自拍偷在线| 岛国在线免费视频观看| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产高清三级在线| 亚洲美女黄片视频| 精品久久久久久久末码| 成人美女网站在线观看视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 黄色视频,在线免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 春色校园在线视频观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品国产清高在天天线| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| av黄色大香蕉| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av美国av| 国产v大片淫在线免费观看| 国产高潮美女av| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲经典国产精华液单| 我要看日韩黄色一级片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 岛国在线免费视频观看| 成人无遮挡网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 亚洲四区av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本黄大片高清| 嫩草影院精品99| 少妇人妻精品综合一区二区 | eeuss影院久久| 免费在线观看成人毛片| 欧美一区二区精品小视频在线| 超碰av人人做人人爽久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最近中文字幕高清免费大全6 | 麻豆成人av在线观看| 国产精品三级大全| 亚洲图色成人| 国产av在哪里看| 国产高清有码在线观看视频| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成人久久性| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产69精品久久久久777片| 悠悠久久av| 久久午夜福利片| 特级一级黄色大片| 久久精品综合一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 免费看a级黄色片| 亚洲国产色片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜视频国产福利| 黄色女人牲交| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久久久成人| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区三区av在线 | 成人三级黄色视频| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品91蜜桃| 亚洲性夜色夜夜综合| 十八禁国产超污无遮挡网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 中亚洲国语对白在线视频| 伦精品一区二区三区| 哪里可以看免费的av片| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人国产麻豆网| 久久草成人影院| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 最新在线观看一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲色图av天堂| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品免费久久久久久久清纯| netflix在线观看网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产大屁股一区二区在线视频| eeuss影院久久| 国产精品伦人一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 全区人妻精品视频| 午夜福利在线观看吧| 黄色配什么色好看| 听说在线观看完整版免费高清| 成人一区二区视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品影院6| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 黄片wwwwww| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品精品国产色婷婷| 白带黄色成豆腐渣| av女优亚洲男人天堂| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩欧美在线二视频| 长腿黑丝高跟| 伊人久久精品亚洲午夜| 毛片女人毛片| 亚洲乱码一区二区免费版| 高清在线国产一区| 国国产精品蜜臀av免费| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 91精品国产九色| 久久国产乱子免费精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 婷婷精品国产亚洲av在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产黄色小视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 国产大屁股一区二区在线视频| 欧美精品国产亚洲| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲av成人精品一区久久| 有码 亚洲区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 免费av不卡在线播放| 午夜福利在线观看吧| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 精品人妻视频免费看| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产在视频线在精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜久久久久精精品| 亚洲综合色惰| 久久人妻av系列| 国产私拍福利视频在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成年版毛片免费区| 国产麻豆成人av免费视频| 热99在线观看视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久人妻av系列| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品人妻久久久影院| av黄色大香蕉| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 草草在线视频免费看| 如何舔出高潮| 村上凉子中文字幕在线| 一级av片app| 一a级毛片在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩欧美三级三区| 日本一本二区三区精品| 亚洲熟妇熟女久久| 国产在线男女| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 伦理电影大哥的女人| 毛片一级片免费看久久久久 | 中文字幕av成人在线电影| 麻豆国产av国片精品| 精品一区二区三区人妻视频| 日本一二三区视频观看| 国产视频一区二区在线看| 嫁个100分男人电影在线观看| 永久网站在线| 一进一出抽搐动态| 97碰自拍视频| 国产日本99.免费观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲人成网站在线播| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 国产成人福利小说| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 少妇的逼好多水| 国产黄片美女视频| 国产美女午夜福利| 日韩欧美精品v在线| 午夜福利成人在线免费观看| 一a级毛片在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品永久免费网站| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av成人精品一区久久| 国产成人福利小说| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| av天堂中文字幕网| 最近在线观看免费完整版| 精品人妻1区二区| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产在视频线在精品| 日本爱情动作片www.在线观看 | 精品久久国产蜜桃| 九九在线视频观看精品| 极品教师在线视频| 淫秽高清视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲无线在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲avbb在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲美女搞黄在线观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 色av中文字幕| 乱人视频在线观看|