縮膽囊素分子印跡整體柱的制備及固相微萃取—高效液相色譜分析研究

李樺等

摘 要 采用抗原決定簇法，開展了對(duì)縮膽囊素（CCK）神經(jīng)肽具有特異性識(shí)別和富集作用的新的分子印跡聚合物（MIP）整體柱合成與制備的研究。對(duì)MIP整體柱合成條件進(jìn)行了系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化，以縮膽囊素五肽（CCK5）為模板分子，在小移液器吸頭中原位聚合制備了可以特異性識(shí)別和富集CCK神經(jīng)肽的MIP整體柱。用掃描電鏡和紅外光譜對(duì)該分子印跡聚合物進(jìn)行了表征。將此MIP整體柱作為固相微萃取小柱，研究并優(yōu)化了固相微萃取條件，結(jié)合高效液相色譜紫外檢測(cè)法，建立了腦脊液中CCK5和CCK8的分析檢測(cè)方法； 本方法成功應(yīng)用于加標(biāo)腦脊液中CCK 神經(jīng)肽的分離富集，CCK5和CCK8的檢測(cè)限分別為4.38和15.95 ng/mL，平均加標(biāo)回收率分別為90.2%和87.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%和3.9%。此CCKMIP整體柱具有特異性強(qiáng)、經(jīng)久耐用的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 縮膽囊素； 分子印跡聚合物整體柱； 固相微萃??； 抗原決定簇

1 引 言

縮膽囊素 （Cholecystokinin， CCK） 是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多型性神經(jīng)肽，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CCK大部分以八肽CCK8 （AspTyrMetGlyTrpMetAspPheNH2）形式存在；也有部分以五肽CCK5 （GlyTrpMetAspPheNH2）形式存在，這兩種CCK型體具有相同的C端結(jié)構(gòu)[1]。CCK對(duì)攝食、體溫調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)和記憶等生理功能有重要的調(diào)控作用[2，3]，并且與多種神經(jīng)和精神性疾病發(fā)病緊密相關(guān)[4]。研究建立生物體液中縮膽囊素特異性和高靈敏的分析檢測(cè)方法具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。由于CCK在腦脊液和腦組織中含量低，目前報(bào)道的CCK定量檢測(cè)方法大多采用高靈敏度的放射免疫法 （RIA）[5，6]。但RIA方法需要昂貴的高特異性的抗體，且有交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)；而且RIA無法實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多型性CCK的同時(shí)定量檢測(cè)。

建立高效和特異性強(qiáng)的CCK神經(jīng)肽樣品富集方法是實(shí)現(xiàn)CCK液相色譜分析的重要前提。分子印跡聚合物 （Molecularly imprinted polymer， MIP） 是以目標(biāo)分子為模板合成的具有分子識(shí)別能力的聚合物[7]。整體柱是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑等混合物通過原位聚合而成的棒狀整體[8～10]。MIP整體柱不僅具有分子印跡聚合物優(yōu)異的識(shí)別能力，而且具有整體柱的高效、通透性好、傳質(zhì)速度快等特點(diǎn)[11]，可結(jié)合固相微萃取 （Solid phase microextraction， SPME），應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量分析物的分離與富集[12，13]?？乖瓫Q定簇法分子印跡技術(shù)是以多肽或蛋白質(zhì)中一個(gè)特異性的裸露短肽作為模板分子制備MIP來特異性識(shí)別整個(gè)多肽或蛋白質(zhì)[14]， 大大降低了印跡成本，已在蛋白質(zhì)印跡材料的合成中得以應(yīng)用，如合成能識(shí)別血管緊張素[15]、酪氨酸磷蛋白的分子印跡材料[16]。Papaioannou等[17]以CCK5為模板分子，以本體聚合法制備出了可以識(shí)別CCK8的MIP，但該報(bào)道僅研究了該MIP的選擇性和吸附性能，未將其應(yīng)用于固相微萃取或色譜分析。目前制備蛋白質(zhì)或肽MIP的報(bào)道絕大部分使用本體聚合法，用該方法所制備的塊狀MIP需要經(jīng)干燥、研磨和篩分等復(fù)雜過程，且在研磨時(shí)會(huì)破壞印跡位點(diǎn)。至今尚無原位聚合法制備CCK神經(jīng)肽分子印跡整體柱的相關(guān)報(bào)道。本研究采用抗原決定簇法，以縮膽囊素五肽CCK5為模板，首次以原位聚合法在移液器吸頭中合成了CCK神經(jīng)肽MIP整體柱，以此整體柱作為固相微萃取小柱，純化并富集腦脊液中的CCK神經(jīng)肽，結(jié)合高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLCUV）檢測(cè)，建立了MIPSPME對(duì)腦脊液中痕量CCK5及CCK8同時(shí)特異性富集和分析檢測(cè)的方法，獲得滿意結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1100型高效液相色譜儀（美國Aglient公司）， 配G1315B光電二極管陣列檢測(cè)器； Quant 200掃描電子顯微鏡 （荷蘭FEI公司）； Nicolet 5700 紅外光譜儀 （美國Nicolet公司）； LSP011A型注射泵 （保定蘭格恒流泵有限公司）。

CCK5五肽和CCK8八肽、亮啡肽、甲啡肽以及四肽YPLG（純度>98%）購于上海吉爾生化有限公司；甲基丙烯酸 （Methacrylic acid， MAA）、三氟乙酸 （Trifluoracetic acid， TFA， 化學(xué)純， 上海國藥集團(tuán)有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯 （Ethylene dimethacrylate， EDMA， 98%， 比利時(shí)Acros公司）；偶氮二異丁腈 （AIBN， 化學(xué)純， 上海試四赫維化工有限公司）；異辛烷 （Isooctane， >99.0%， 東京化成工業(yè)株式會(huì)社TCI）；人工腦脊液的配制： 145.0 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 1.0 mmol/L MgCl2， 1.2 mmol/L CaCl2， 0.45 mmol/L NaH2PO4， 2.33 mmol/L Na2HPO4， pH 7.4，于4℃保存?zhèn)溆?。其它試劑均為分析純。?.1% TFA 溶液配制10.0 μg/mL CCK5和CCK8標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 分子印跡整體柱的制備 將一定量的模板CCK5，溶解于甲醇和異辛烷的混合溶液中，依次加入單體MAA、交聯(lián)劑EDMA和引發(fā)劑AIBN。超聲混合均勻后，通入氮?dú)?0 min，移取反應(yīng)混合液于移液器吸頭中，吸頭的另一端用保鮮膜封口后于60℃反應(yīng)16 h。制得的MIP整體柱依次用甲醇、水及乙腈水（4∶6， V/V）混合溶液清洗，收集洗脫液進(jìn)行HPLC分析直至無模板。非印跡聚合物 （Nonimprinted polymers， NIP） 整體柱除不加模板分子外，其它步驟同上。

2.2.2 固相微萃取 （SPME） 過程 將MIP整體柱連接在注射器上，依次用1 mL乙腈水（1∶1， V/V）混合溶液和1 mL 0.1% TFA溶液平衡整體柱10 min，流速100 μL/min；將2 mL CCK5標(biāo)準(zhǔn)溶液以100 μL/min流速通過MIP整體柱； 用0.5 mL 含0.1% TFA的溶液清洗整體柱，流速100 μL/min；最后用100 μL乙腈水（1∶1， V/V））的混合溶液洗脫，流速為50 μL/min。收集洗脫液直接進(jìn)行HPLC分析，以考察MIP整體柱的富集效果。CCK8的萃取富集同上述過程。按照上述相同的方法考察NIP整體柱對(duì)CCK的富集效果。每次萃取實(shí)驗(yàn)在相同的條件下重復(fù)3次，計(jì)算平均富集因子及回收率。

2.2.3 人腦脊液樣品處理

取1.5 mL正常男性受試者的腦脊液 （武漢協(xié)和醫(yī)院） 于離心管中，加入6 mL氯仿，振蕩，以3000 r/min離心10 min，取0.8 mL上清液，分別加入10 μg/mL CCK5、CCK8標(biāo)準(zhǔn)溶液26 μL和100 μL，用0.1% TFA溶液稀釋至2 mL，得到CCK5和CCK8加標(biāo)濃度分別為0.13和0.50 μg/mL的腦脊液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18 （250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm， 大連依利特分析儀器有限公司）；流動(dòng)相：乙腈水（3∶7， V/V），含0.1% TFA；流速：1 mL/min；柱溫：28℃；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

3 結(jié)果與討論

本研究采用富集因子（Enrichment factor， EF）衡量整體柱對(duì)CCK的富集效果，用印跡因子（Imprinted Factor，IF）考察整體柱對(duì)CCK的特異性識(shí)別能力。EF和IF的定義如下：

EF=C1C0（1）

IF=EFMIPEFNIP（2）

式中， C0 是指上樣前溶液中CCK的濃度； C1是指過柱后洗脫液中CCK的濃度； EFMIP和EFNIP分別指MIP整體柱和NIP整體柱的富集因子。

3.1 分子印跡整體柱的制備及性能考察

3.1.1 MIP整體柱制備條件的選擇及優(yōu)化 為了得到對(duì)CCK具有特異性識(shí)別能力且通透性良好的MIP整體柱，分別對(duì)單體與交聯(lián)劑的比例、單體與模板的比例、聚合反應(yīng)溶劑的種類及比例進(jìn)行了系統(tǒng)的選擇及優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，如圖1A和圖1B所示：單體與交聯(lián)劑和模板與單體的比例最佳比例分別為1∶4和1∶13。由于CCK5在甲醇中溶解性良好，但是僅用甲醇作為溶劑制備的MIP整體柱通透性差，因此本實(shí)驗(yàn)在甲醇為主的溶劑體系中分別加入乙腈、十二醇以及異辛烷作為發(fā)泡劑，通過考察混合溶液中甲醇與各種發(fā)泡劑之間不同比例對(duì)通透性及富集效果的影響，實(shí)驗(yàn)表明， 以含4.5%異辛烷甲醇混合溶液作為溶劑制備所得的MIP整體柱，不僅具有良好的通透性且有較高的富集因子（EF） （圖1C），而選用其他溶劑制備所得的整體柱通透性較差。因此，制備MIP整體柱采用含4.5%異辛烷甲醇混合溶液為反應(yīng)溶劑，模板CCK5、單體MAA及交聯(lián)劑EDMA的比例為1∶13∶52。

3.1.2 分子印跡整體柱的表征 實(shí)驗(yàn)對(duì)所制備的MIP整體柱進(jìn)行了表征，圖2為MIP整體柱截面的掃描電鏡圖（SEM）?？梢钥闯?，此MIP整體柱為多孔的交聯(lián)狀聚合物，結(jié)構(gòu)致密，孔徑均勻，機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定，為傳質(zhì)提供了良好的場(chǎng)所和通道。圖3為MIP整體柱（a）， NIP（b）整體柱和單體甲基丙烯酸MAA（c）的紅外光譜圖。比較圖3a和3b可見， MIP和NIP具有相似的特征吸收峰位置和強(qiáng)度。3445.1和3444.1 cm

3.1.3 MIP整體柱特異性考察及識(shí)別機(jī)理 本研究用含有1 μmol/L CCK5 （GlyTrpMetAspPheNH2），1 μmol/L CCK8 （AspTyrMetGlyTrpMetAspPheNH2），2 μmol/L 四肽YPLG （TyrProLeuGlyNH2），2 μmol/L甲啡肽 （TyrGlyGlyPheMet）及2 μmol/L亮啡肽 （TyrGlyGlyPheLeu）的混合多肽溶液，按照2.2.2節(jié)進(jìn)行固相微萃取實(shí)驗(yàn)，考察MIP整體柱對(duì)CCK的特異性識(shí)別效果。結(jié)果表明，MIP整體柱對(duì)CCK5和CCK8具有明顯的富集效果，印跡因子分別為4.5和4.2，而對(duì)YPLG、甲啡肽及亮啡肽沒有富集作用。此結(jié)果證明所制備的MIP整體柱對(duì)CCK神經(jīng)肽的識(shí)別具有高度的特異性，這種特異性識(shí)別機(jī)制可從抗原決定簇法制備得到的分子印跡聚合物識(shí)別目標(biāo)分子的原理得以解釋，即如圖4a所示，聚合過程中功能單體MAA與模板分子CCK5通過非共價(jià)作用（氫鍵，靜電引力）自組裝，加入交聯(lián)劑與致孔劑后， 整個(gè)混合物固化形成一種在形狀和官能團(tuán)上與模板CCK5互補(bǔ)的多孔材料；模板通過溶劑沖洗后，合成得到的大孔MIP留下空的印跡位點(diǎn)（圖4b），該MIP即可以特異性地識(shí)別CCK5。由于CCK8的C端含有與CCK5相同的5個(gè)氨基酸序列，因此，此MIP整體柱也可識(shí)別與富集CCK8。

3.2 MIP整體柱固相微萃取 （SPME） 條件優(yōu)化

為了獲得較高的富集效果，本研究分別對(duì)洗脫液的種類、上樣溶液pH值、上樣體積、洗脫液體積及流速進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。如圖5所示，當(dāng)上樣溶液pH=1.8，上樣體積為2 mL，用100 μL乙腈水（1∶1， V/V） 混合溶液以0.05 mL/min的流速洗脫，MIP整體柱對(duì)CCK5及CCK8的富集效果分別可以達(dá)到19和18倍。取CCK5和CCK8加標(biāo)濃度均為1 μmol/L的人工腦脊液，在優(yōu)化的條件下經(jīng)過MIP整體柱萃取后，進(jìn)行HPLC分析，圖6b為其色譜圖，與不經(jīng)萃取直接分析的色譜圖（圖6a）相比，CCK5和CCK8信號(hào)強(qiáng)度得到大幅度提高。

3.3 分析方法評(píng)價(jià)

3.3.1 線性范圍及檢出限 取10.0 μg/mL 的CCK5和CCK8標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用人工腦脊液分別稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳萃取條件下，按照2.2.2節(jié)進(jìn)行SPME實(shí)驗(yàn)，洗脫液直接進(jìn)行HPLC分析。以色譜峰面積對(duì)上樣前濃度進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），結(jié)果見表1。CCK在較寬的濃度范圍內(nèi)線性良好（R2>0.99）。經(jīng)過MIP整體柱萃取富集之后，CCK5和CCK8檢出限分別達(dá)到4.4和16 ng/mL。

3.3.2 腦脊液樣品分析 腦脊液中含有大量的蛋白、糖類及無機(jī)鹽等，基質(zhì)干擾效應(yīng)較大。以CCK5和CCK8加標(biāo)濃度分別為0.13和0.50 μg/mL的腦脊液，未經(jīng)萃取直接用HPLC 分析，未見CCK峰（圖7b）。圖7a為以上加標(biāo)腦脊液經(jīng)過MIP整體柱固相微萃取后的HPLC圖譜，可以檢測(cè)到CCK5和CCK8。

為了考察該萃取方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，對(duì)該加標(biāo)濃度的腦脊液進(jìn)行了重復(fù)分析檢測(cè)（n=3），測(cè)得CCK5和CCK8的平均加標(biāo)回收率分別為90.2%和87.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%和3.9%，說明方法的重現(xiàn)性好。此整體柱經(jīng)過上百次萃取實(shí)驗(yàn)后，富集因子無明顯降低，證明此MIP整體柱具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和耐用性。

4 結(jié) 論

本研究采用抗原決定簇法的基本原理，在移液器吸頭中合成制備了縮膽囊素分子印跡聚合物整體柱，研究結(jié)果表明，此MIP整體柱對(duì)縮膽囊素類神經(jīng)肽具有特異性識(shí)別和富集能力。將此MIP整體柱作為固相微萃取小柱，研究并優(yōu)化了固相微萃取條件，結(jié)合高效液相色譜紫外檢測(cè)法，建立了腦脊液中CCK5和CCK8同時(shí)分析檢測(cè)的方法，本方法成功應(yīng)用于對(duì)加標(biāo)腦脊液中縮膽囊素的富集和檢測(cè)。該CCKMIP整體柱具有特異性強(qiáng)、經(jīng)久耐用的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

References

1 Rehfeld J F. Best Pract. Res. Clin. Endoc. Metab.， 2004， 18（4）： 569-586

2 Hebb A L O， Poulin J F， Roach S P， Drolet G. Prog. NeuroPsychopharmacol. Biol. Psychiatry， 2005， 29（8）： 1225-1238

3 Szelényi Z. Clin. Chim. Acta.， 2010， 411（56）： 329-335

4 Sun C S， Sun J L， Erisir A， Kapur J. Neurobiol. Dis.， 2014， 62： 44-55

5 RojasGarcía C R， Morais S， Rnnestad I. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol.， 2011， 158（4）： 455-460

6 JIANG YuanXu， WANG Yun， LUO Fei，LIU HongXiang， HAN JiSheng. J. Peking Univ. Health Sci.， 2001， 33（4）： 351-353

蔣袁絮， 王 韻， 羅 非， 劉紅香， 韓濟(jì)生. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2001， 33（4）： 351-353

7 Szatkowska P， Koba M， Kos'lin'ski P， Szablewski M. MiniRev. Org. Chem.， 2013， 10（4）： 400-408

8 LIU XiangJun， LIU JiZong， ZHAO Rui， LIU GuoQuan， Cheng Yi. Chem. J. Chinese Universities， 2007， 28（10）： 1878-1880

劉祥軍 劉吉眾 趙 睿 劉國詮 陳 義. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 28（10）： 1878-1880

9 Nema T， Chan E C Y， Ho P C. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 87（18）： 130-141

10 JIANG LinBo， XIONG XiYue， CHEN YingZhuang， CHEN Bo. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（10）： 1526-1530

姜琳博，熊喜悅，陳應(yīng)莊，陳 波. 分析化學(xué)， 2013， 41（10）： 1526-1530

11 Tan J， Jiang Z T， Li R and Yan X P. TRACTrend Anal. Chem.， 2012， 39： 207-217

12 Zhang W P， Chen Z L. Talanta， 2013， 103（15）： 103-109.

13 ZHANG HongWu， GUO JianWen， LI Kang， WANG WeiSheng， WU YuPing， LU QiWen， QU HaiYun. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（5）： 699-704

張紅武， 郭建文， 李 康， 王偉聲， 吳玉萍， 盧琦雯， 翟海云. 分析化學(xué)， 2012， 40（5）： 699-704

14 Rachkov A， Minoura N. J. Chromatogr. A， 2000， 889（12）： 111-118

15 Rachkov A， Hu M J， Bulgarevich E， Matsumoto T and Minoura N. Anal. Chim. Acta， 2004， 504（1）： 191197

16 Li Q S， Shen F， Zhang X， Hu Y F， Zhang Q X， Xu L， Ren X Q. Anal. Chim. Acta， 2013， 795（17）： 82-87

17 Papaioannou E H， Kyriakides M L， Papi R M， Kyriakidis D A. Macromol. Chem. Phys.， 2007， 208（24）： 2621-2627

ract The synthesis and preparation of molecularly imprinted polymer （MIP） monolith for selective recognition of cholecystokinin were carried out by epitope imprinting technique. The MIP was synthesized by using CCK5 as template in a micropipette tip， and the polymerization conditions were investigated and optimized. The synthesized MIPs were characterized by scanning electron microscope （SEM） and infrared spectroscopy. By using this MIP monolith as solid phase microextraction （SPME） column and coupling to high performance liquid chromatographyultraviolet （HPLC/UV） detection， an analytical method was developed for the determination of CCK， and the parameters affecting SPME were optimized. The proposed method was successfully applied to determination of CCK5 and CCK8 in spiked cerebrospinal fluid （CSF） simultaneously. The detection limit of CCK5 and CCK8 were 4.38 ng/mL and 15.95 ng/mL， respectively； the mean recoveries were 90.2% and 87.6% with the relative standard deviations of 3.2% and 3.9%. This CCKMIP monolith showed high specificity， excellent reusability.