雜質(zhì)延遲液相色譜四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜測定水產(chǎn)加工食品中23種全氟烷基化合物

郭萌萌等

摘 要 采用雜質(zhì)延遲法去除液相系統(tǒng)中的背景干擾，利用液相色譜四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜（LCMS/MSQTRAP）的同時(shí)定性定量功能，建立了水產(chǎn)加工食品中23種全氟烷基化合物（Perfluorinated alkyl substances， PFASs）的定性確證和定量測定方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取，C18填料和石墨化碳黑（GCB）分散固相萃取凈化，C18色譜柱分離，甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液梯度洗脫；在液相系統(tǒng)混合器和進(jìn)樣器之間串聯(lián)一根延遲色譜柱，去除液相系統(tǒng)的背景干擾；質(zhì)譜采集使用MS/MSQTRAP獨(dú)有的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）信息依賴性采集（IDA）增強(qiáng)子離子掃描（EPI）模式；同位素內(nèi)標(biāo)定量，在線EPI譜庫定性確證。23種目標(biāo)物在各自相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.995，定量限為0.02～0.1 μg/kg?；|(zhì)加標(biāo)回收率在67.5%～116.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.2%～14.7%。本方法有效控制了液相系統(tǒng)的背景干擾，一次進(jìn)樣即可完成23種PFASs的確證和測定，適用于水產(chǎn)加工食品中PFASs的監(jiān)控分析

關(guān)鍵詞 全氟烷基化合物； 水產(chǎn)加工食品； 雜質(zhì)延遲法； 液相色譜三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜

全氟烷基化合物（Perfluoroalkylated substances，PFASs）是一類新型持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs），具有疏油、疏水特性，對物理、化學(xué)和生物降解均有較好的抵抗作用。研究表明，PFASs在多種環(huán)境介質(zhì)和生物機(jī)體中廣泛分布并持久性存在，且具有生殖毒性[1]、神經(jīng)毒性[2]和免疫毒性[3]。2009年，全氟辛烷磺酸（鹽）及全氟辛基磺酰氟被列入《斯德哥爾摩公約》優(yōu)控名單[4]；2010年歐盟發(fā)布2010/161/EU號[5]議案，提議開展食品中PFASs的監(jiān)控；2011年，歐盟發(fā)布食品中PFASs污染的調(diào)查報(bào)告，發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物源性食品中PFASs殘留水平明顯高于陸源食品，故而提出水產(chǎn)動(dòng)物源性食品常態(tài)化監(jiān)控PFASs的建議[6]。目前，我國僅對鮮活水產(chǎn)品中PFASs污染狀況進(jìn)行了初步調(diào)查，水產(chǎn)加工食品中PFASs污染仍不明確。比較而言，水產(chǎn)加工食品因增加了加工環(huán)節(jié)，加工過程、包裝材料等均可能增加PFASs污染風(fēng)險(xiǎn)，另外魚罐頭、即食海產(chǎn)品等作為日常膳食的一類食品，是我國廣大內(nèi)陸地區(qū)消費(fèi)者攝取水產(chǎn)蛋白的主要來源之一，因此建立水產(chǎn)加工食品中PFASs的檢測方法十分必要。

目前，針對水產(chǎn)品中PFASs的檢測方法多采用液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行分析[7～9]，固相萃取法進(jìn)行樣品凈化[9～11]。液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定時(shí)，流動(dòng)相溶劑、在線脫氣機(jī)及色譜流路中均可能含有氟聚合物而引入背景干擾，部分組分如全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸等化合物的儀器背景干擾值接近或高于定量限，難以實(shí)現(xiàn)PFASs的準(zhǔn)確定量和有效監(jiān)測；同時(shí)，水產(chǎn)加工食品的基質(zhì)較鮮活水產(chǎn)品更為復(fù)雜，當(dāng)樣品中目標(biāo)物殘留較低時(shí)，采用四極桿質(zhì)譜定性時(shí)部分化合物的兩對MRM離子比率偏差較大，造成定性困難；另外，固相萃取凈化方法的操作較繁瑣，且對長碳鏈（C≥11）羧酸類PFASs的回收率不理想。針對上述問題，本研究結(jié)合雜質(zhì)延遲技術(shù)，在液相系統(tǒng)混合器和進(jìn)樣器之間串聯(lián)一根延遲色譜柱，去除了液相系統(tǒng)的背景值，并采用Qtrap質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）信息依賴采集（IDA）增強(qiáng)子離子掃描（EPI）模式，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中23種PFASs的同時(shí)定量定性分析，同時(shí)采用C18填料和石墨化碳黑（GCB）進(jìn)行分散固相萃取凈化，簡化了樣品前處理步驟，在保證全部目標(biāo)物獲得良好回收率的前提下，有效降低了復(fù)雜基質(zhì)的干擾。這些改進(jìn)顯著提高了方法的準(zhǔn)確性和可靠性，為準(zhǔn)確監(jiān)測水產(chǎn)加工食品中的PFASs污染水平提供了有效的技術(shù)保障。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Prominence UFLC液相色譜（Shimadzu公司）；5500QTRAP四極桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜（AB SCIEX公司）；T18 basic均質(zhì)機(jī)（IKA公司）；XW80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）；Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)（Hitachi公司）；NEVAP 112氮吹儀（Organomation公司）；MilliQ超純水儀（Millipore公司）。

全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸、全氟丁烷磺酸、全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸、全氟辛烷磺酸、全氟癸烷磺酸、全氟辛烷磺酰胺、N甲基全氟辛烷磺酰胺、N乙基全氟辛烷磺酰胺、N甲基全氟辛基磺酰胺乙醇、N乙基全氟辛基磺酰胺乙醇、13C4全氟辛酸、13C4全氟辛烷磺酸、13C8全氟辛烷磺酰胺（Wellington Labortories公司）；甲醇、乙腈（HPLC級，Merk公司）；甲酸、乙酸銨（HPLC級，F(xiàn)luka公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）； C18萃取劑（50 μm，艾杰爾公司）；石墨化碳黑（CNWBOND CarbonGCB， 120～400目，CNW公司），其它未作特殊說明的試劑均為分析純。

2.4 質(zhì)量控制

為防止樣品前處理步驟中引入高背景值，實(shí)驗(yàn)過程避免使用聚四氟乙烯材質(zhì)的器皿，且器皿在使用前用超純水和甲醇充分清洗。定量分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。每批樣品進(jìn)行測試時(shí)，同時(shí)做空白試驗(yàn)、基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)和線性試驗(yàn)，空白試驗(yàn)確保試劑空白中所有分析物的含量低于定量限；基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)加入PFASs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2 ng）和內(nèi)標(biāo)物（1 ng）驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，回收率控制在60%～120%范圍內(nèi)；采用至少5個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，且線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上。

3 結(jié)果與討論

3.1 雜質(zhì)延遲法色譜條件的優(yōu)化

依據(jù)色譜柱對液相系統(tǒng)中干擾物能捕集并釋放的原理[11]，流動(dòng)相溶劑、在線脫氣機(jī)和色譜流路中的PFASs在分析色譜柱中濃縮，可能與作為分析樣品進(jìn)樣的目標(biāo)物在同一時(shí)間檢出。為了將來自液相系統(tǒng)的PFASs背景干擾組分與樣品中的目標(biāo)組分PFASs分離，在混合器和進(jìn)樣器之間安裝延遲色譜柱（如圖1），使干擾組分較目標(biāo)組分延遲洗脫。

選用對PFASs有一定保留的色譜柱作為延遲柱[13]，在液相系統(tǒng)混合器和進(jìn)樣器之間串聯(lián)后，調(diào)整色譜的梯度洗脫條件， 使干擾組分在目標(biāo)組分之后洗脫時(shí)基線分離（圖2），達(dá)到了去除液相系統(tǒng)中背景干擾的目的。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

歐盟規(guī)定[14]用LCMS/MS方法檢測有機(jī)污染物時(shí)，其定性確證方法要求每種化合物選用兩對MRM離子，需要4個(gè)確證點(diǎn)（Identification Point，IP），即一個(gè)母離子，兩個(gè)子離子（母離子IP為1.0，子離子IP為1.5）。但在本課題組前期建立的方法[7]中， PFBA， PFPeA， PFHxA， PFOSA， NMeFOSE和NEtFOSE僅能檢測到一對穩(wěn)定的MRM離子，且水產(chǎn)加工食品基質(zhì)復(fù)雜，存在一定程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)樣品中目標(biāo)物殘留很低時(shí)，可能其它化合物的兩對MRM離子也不能同時(shí)檢測到，為定性分析帶來極大困難。本方法首先采用目標(biāo)物的單標(biāo)溶液通過流動(dòng)注射進(jìn)質(zhì)譜，以多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子模式重點(diǎn)優(yōu)化各化合物的子離子和碰撞能，增加了PFPeA， PFHxA和PFOSA的MRM掃描離子（見表1）；然后利用MRMIDAEPI模式， 采用23種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過自動(dòng)進(jìn)樣器采集數(shù)據(jù)，該模式按照常規(guī)定量方法設(shè)定目標(biāo)物的MRM離子對，在實(shí)際掃描過程中，尚某MRM通道采集的信號強(qiáng)度超過預(yù)設(shè)值后，就會觸發(fā)EPI增強(qiáng)子離子掃描模式，進(jìn)而獲得對應(yīng)MRM通道的母離子的增強(qiáng)二級離子全掃描質(zhì)譜圖，以用于定性分析； 同時(shí)建立目標(biāo)物的在線EPI質(zhì)譜庫， 輔助定性。而此時(shí)，MRM通道采集的信號依然可以作為定量分析的數(shù)據(jù)。與MRM模式相比，EPI譜圖由離子阱采集，其靈敏度高于四極桿，增強(qiáng)了二級碎片子離子掃描，且為全掃描質(zhì)譜圖，確證信息更為豐富，因而可以有效輔助痕量水平（例如≤0.1 μg/kg）或檢出限濃度樣品的定性確證，很好地解決了傳統(tǒng)四極桿MRM模式對低濃度樣品的定性難題。圖3顯示的是MRMIDAEPI模式與傳統(tǒng)MRM模式下，0.1 μg/kg PFOA陽性沙丁魚罐頭樣品的離子碎片信息。從圖3可見，EPI掃描模式下，碎片離子響應(yīng)增強(qiáng)近10倍，且該模式除采集母離子m/z 413和子離子m/z 369， 169外，還采集了m/z 219， 395等子離子的信息，確證點(diǎn)IP達(dá)7.0，遠(yuǎn)高于歐盟對有機(jī)污染物的確證要求，極大地提高了分析結(jié)果的可靠性。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

水產(chǎn)品加工食品的基質(zhì)復(fù)雜，除脂肪、蛋白等內(nèi)源性雜質(zhì)外，還存在色素、糖等添加劑，本研究將鮮活水產(chǎn)品中PFASs的前處理方法[7]進(jìn)一步優(yōu)化，勻漿試樣的取樣量由5 g減為2 g，同時(shí)重點(diǎn)考察了凈化填料用量的不同對目標(biāo)物回收率和凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)選取墨魚丸樣品為測試基質(zhì)，按 2.2.1步驟進(jìn)行提取，再添加2 ng PFASs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用C18萃取劑吸附脂肪等非極性共萃物，通過對比50～250 mg C18對回收率和凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)C18用量為150 mg時(shí)，平均回收率均優(yōu)于其它用量（圖4），且凈化后的樣品溶液澄清，去脂效果較好。在此基礎(chǔ)上，添加GCB去除色素及具有共軛結(jié)構(gòu)的谷氨酸、精氨酸等水產(chǎn)加工食品的風(fēng)味成分，實(shí)驗(yàn)考察了150 mg C18與30～60 mg GCB的配比情況，GCB為50 mg時(shí)，可有效去除色素等雜質(zhì)，且平均回收率高于90%（圖5）。因此，本方法最終采用150 mg C18+50 mg GCB對樣品提取液凈化，在保證回收率的前提下，可有效降低水產(chǎn)加工食品中非極性和極性風(fēng)味成分及脂肪酸等對測定的干擾。

3.4 靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

取適量PFASs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.3節(jié)條件下依次測定，以各組分和內(nèi)標(biāo)物的面積比值為縱坐標(biāo)，各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。采用雜質(zhì)延遲法，儀器的背景干擾得到了有效控制，5次平行測定中干擾組分的平均濃度不高于0.1 μg/L。在空白樣品中添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2節(jié)步驟進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）≥10確定各組分定量限（LOQ），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，23種化合物的線性良好，定量限為0.02～0.10 μg/kg，滿足甚至高于目前食品基質(zhì)中PFASs測定方法的指標(biāo)[15，16]。

選取魚丸、海米和沙丁魚罐頭為測試基質(zhì)，分別添加相當(dāng)于0.1， 1.0和10.0 μg/kg濃度的PFASs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品。同時(shí)做空白試驗(yàn)，扣除本底值后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，PFASs在魚丸中的加標(biāo)回收率在72.2%～108.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～12.8%；PFASs在海米中的加標(biāo)回收率在75.1%～116.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.2%～13.5%；PFASs在沙丁魚罐頭中的加標(biāo)回收率在67.5%～104.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%～14.7%，方法的準(zhǔn)確度與精密度良好。

3.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法分析了20份市售水產(chǎn)加工食品（魚丸、蝦丸、海米和沙丁魚罐頭各5份），發(fā)現(xiàn)部分樣品存在PFASs污染（見表3），總量為0.82～7.437 μg/kg，并對陽性樣品進(jìn)行EPI譜庫檢索，匹配度均大于90%，且陽性樣品中PFOA，PFOS和PFOSA的檢出率較高，在樣品中富集普遍。因此，建議開展水產(chǎn)加工食品中PFASs的殘留監(jiān)測，并以PFOA、PFOS和PFOSA為重點(diǎn)監(jiān)控目標(biāo)。

4 結(jié) 論

利用雜質(zhì)延遲技術(shù)，通過在液相系統(tǒng)混合器和進(jìn)樣器之間安裝延遲色譜柱，實(shí)現(xiàn)了色譜流路中PFASs假陽性干擾的去除。不過，由于延遲了目標(biāo)物的保留時(shí)間，造成分析的平衡時(shí)間略有延長，但液相色譜系統(tǒng)的背景干擾得到有效控制，從而提高了方法的準(zhǔn)確性；采用Qtrap質(zhì)譜特有的MRMIDAEPI掃描模式實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)定性與定量分析，有效判別假陽性樣品，并解決痕量水平或檢出限濃度樣品的定性難題，提高了分析結(jié)果的可靠性；分散固相萃取的凈化方式，簡化了樣品的前處理操作，降低了水產(chǎn)加工食品中風(fēng)味成分及脂肪酸對測定的干擾。本方法的建立為進(jìn)一步開展全國水產(chǎn)動(dòng)物源性食品中全氟烷基化合物的殘留水平調(diào)查提供了技術(shù)手段。

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act A comprehensive method for the simultaneous identification and detection of 23 perfluorinated alkyl substances （PFASs） in processed aquatic products by impurity delay was developed using liquid chromatography coupled with quadrupole/linear ion trap tandem mass spectrometry （LCQ/TrapMS）. The sample was extracted with acidified acetonitrile， cleanedup by dispersive solid phase extraction using C18 and graphitized carbon blacks （GCB）. The separation of 23 PFASs was performed on a Kinetex XBC18 （100 mm×2.1 mm，2.6 μm） column using gradient elution of 5 mmol/L ammonium acetate and methanol as mobile phase. And a short C18 HPLC column was inserted between the mixer and the autosample， which delayed compounds coming from the LC system. A scheduled multiple reaction monitoring （MRM） in negative mode as survey scan and an enhanced product ion （EPI） scan as dependent scan in an informationdependent acquisition （IDA） experiment were adopted in mass spectrometry acquisition. Online labbuilt MS/MS library and the isotope internal standards were employed for the identification and quantification. The calibration curves for the detection of 23 PFASs were linear well with correlation coefficient over 0.995. The limits of quantification for all analytes were ranged from 0.02 μg/kg to 0.1 μg/kg. The average spiked recoveries for 23 PFASs were between 67.5% and 116.4%， with relative standard deviations （RSDs） from 5.2% to 14.7%. The background coming from the part of LC was controlled well by the impurity delay. The proposed method can be used to identify and detect the 23 PFASs in a single run， and also suitable for the analysis of processed aquatic product samples.

Keywords Perfluorinated alkyl substances； Processed aquatic products； Impurity delay； Liquid chromatographyquadrupole/linear ion trap tandem mass spectrometry

（Received 5 February 2015； accepted 12 June 2015）

This work was supported by the Special Foundation for Basic Research Program of the Ministry of Science and Technology， China （No.20144FY30100）