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    氣相色譜—質譜法測定肉制品中的9種揮發(fā)性N—亞硝胺類物質

    2015-04-08 12:37何淑娟等
    肉類研究 2015年1期
    關鍵詞:固相萃取亞硝胺肉制品

    何淑娟等

    摘 要:研究建立一種適用于肉制品中9 種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的氣質聯(lián)用快速檢測方法。實驗優(yōu)化提取溶劑和色譜柱對提取和分離檢測影響的條件,同時考察4 種固相萃取單柱(酸性氧化鋁、C18、活性炭、PSA)和1種雙填料的混合固相萃取柱(PSA-C18)的凈化效果。結果表明:本檢測方法的線性系數(shù)均可達到0.999 2以上;線性范圍為0~10 μg/mL;重現(xiàn)性良好,相對標準方差均≤3.2%;回收率為85%~98%;檢測限分別為N-亞硝基二甲基胺

    1.0 μg/kg、N-亞硝基甲基乙基胺2.1 μg/kg、N-亞硝基二丁基胺0.8 μg/kg;其他均為0.5 μg/kg。該方法能夠滿足測定肉及肉制品中N-亞硝胺的殘留含量的需要。

    關鍵詞:氣質聯(lián)用;肉制品;N-亞硝胺;固相萃取

    Determination of Nine N-Nitrosocompounds in Meat Products by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

    HE Shujuan, ZHAO Limin, LI Qiang, CAI Lipeng, ZHANG Yan*

    (Hebei Institute of Food Quality Supervision Research, Shijiazhuang 050091, China)

    Abstract: This research has established a rapid detection method for nine volatile N-nitrosamines in meat and meat products by using gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS). In this experiment, we investigated the effect of extraction solvent type and chromatographic conditions on the extraction and separation of the target compounds. Meanwhile, comparison of solid-phase extraction (SPE) cartridges packed with acidic alumina, C18, activated carbon or PSA, or both C18 and PSA was carried out for the purification of the N-nitrosamines. Results showed that the linear range of the proposed method was

    0?10 μg/mL with correlation coefficients more than 0.999 2. Good reproducibility was observed with relative standard deviation (RSD) not exceeding 3.2% and the mean recoveries were in the range of 85%?98%. The detection limits for N-nitrosodimethyl amine (NDMA), N-nitrosomethyl ethyl amine (NMEA), N-nitro sodibutyl amine (NDBA) and six other N-nitrosamines were 1.0, 2.1, 0.8 and 0.5 mg/kg, respectively. This method can meet the requirement for the determination of N-nitrosamine residues in meat and meat products.

    Key words: gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS); meat products; N-nitrosamines; solid phase extraction

    中圖分類號:TS254 文獻標志碼:A 文章編號:1001-8123(2015)01-0027-04

    doi: 10.7506/rlyj1001-8123-201501007

    亞硝酸鹽在肉制品加工中起到很好的作用,不僅可以抑制梭狀肉毒桿菌的生長繁殖和產生毒素,對典型腌肉風味的產生起重要作用,還具有抗氧化的效果。但是,亞硝酸鹽在腌肉中可以轉化為亞硝酸,很容易和次級胺類物質反應產生致癌性物N-亞硝胺類化合物。N-亞硝胺物質一般結構為R2(R1)N—N=O,食品中N-亞硝胺主要在食品加工和貯藏過程中形成,常見于腌制、煙熏、焙烤等制品中。N-亞硝胺類化合物不僅具有致畸性和致突變性,而且對神經和腎臟有害[1-8]。

    目前用于檢測食品中的亞硝胺的前處理方法有很多,包括水蒸氣蒸餾法[9-10]、低溫真空蒸餾法[11]、溶劑液液萃取法[12]及固相萃取法[13]等。由于肉類食品的基質復雜性和食品中亞硝胺逐漸下降的趨勢[14-15],因此合適的前處理提取方法對準確檢測亞硝胺至關重要。

    目前熟肉制品中N-亞硝胺物質的檢測方法主要有氣相色譜法[16]、液相色譜法[17]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相色譜-熱能分析法等[18-21]。在

    GB/T 5009.26—2003《食品中N-亞硝胺類的測定方法》中氣相色譜-熱能分析樣品前處理復雜、耗時長、儀器方法成本高,實際可操作性不強。而氣相色譜-質譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)是最常見的檢測N-亞硝胺物質的方法。本研究選擇9種常見的揮發(fā)性亞硝胺,利用GC-MS的高效分離能力和高靈敏性建立了一種適用于肉制品的快速、準確的檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    熟制豬肉制品為市售。

    N-亞硝基二甲基胺(NDMA)(純度>99.9%) 美國Sigma公司;N-亞硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亞硝基二乙基胺(NDEA)、N-亞硝基吡咯烷(NDEA)、N-亞硝基嗎啉(NDEA)、N-亞硝基二丙基胺(NDPA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基二丁基胺(NDBA)、N-亞硝基二苯基(NDPhA)(純度

    均>98%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;二氯甲烷(色

    譜純) 美國J.T.Baker公司。

    1.2 儀器與設備

    Agilent 7890A/MS 5973i氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(配

    有電子轟擊離子源(EI)) 美國Agilent 公司;HGB550高速組織搗碎機 美國Waring公司;K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司;Visiprep DL固相萃取

    裝置 美國Supelco 公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;數(shù)顯型漩渦混合器 美國Talboys公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品制備

    將熟肉制品切成小塊,在組織搗碎機粉碎成勻漿或粉末狀均勻樣品。準確稱取粉碎的熟肉樣品20.0 g,置于50 mL具塞離心管中,加入30 mL二氯甲烷,渦旋振蕩1 min,超聲提取20 min,4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min;吸取有機相層以20 mL二氯甲烷重復提取1次,合并2 次萃取相;將合并液放入100 mL雞心瓶中,于40 ℃水浴中旋轉蒸發(fā)至2 mL左右,待凈化。

    1.3.2 樣品凈化

    用10 mL二氯甲烷活化固相萃取柱,將2 mL待凈化樣品轉移至固相萃取柱,并用10 mL二氯甲烷分3 次洗脫固相萃取柱,收集所有洗脫液,于35 ℃雞心瓶中旋轉濃縮至近干,用1.0 mL二氯甲烷復溶,過0.22 μm有機膜,備用。

    1.3.3 色譜條件

    色譜柱:DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 ?m);升溫程序:40 ℃保持4 min;以5 ℃/min升至100 ℃,再以20 ℃/min升至250 ℃,保持2 min;進樣口溫度:250 ℃;載氣(N2)流速1.5 mL/min;隔墊吹掃流量:3 mL/min;不分流進樣;進樣量:1.0 ?L。

    1.3.4 質譜條件

    電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;接口溫度240 ℃;離子掃描模式。上述條件下,9 種N-亞硝胺類化合物的保留時間定性及定量離子如表1所示。

    2 結果與分析

    2.1 色譜柱的優(yōu)化

    考察不同極性的氣相色譜柱非極性柱HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)、中等極性柱DB-1701(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)、極性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)對9 種待測N-亞硝胺類化合物分離的影響。結果表明,選用非極性柱HP-5MS時,

    N-亞硝胺二甲基胺的色譜峰受溶劑峰影響大,且有色譜峰展寬的現(xiàn)象,峰形有拖尾現(xiàn)象;選用中等極性柱DB-1701時,仍有峰展寬的現(xiàn)象,而選用強極性柱DB-WAXETR時,獲得的色譜峰峰形對稱,分離度好。這是因為亞硝胺分子質量小,具有強極性和強揮發(fā)性,當使用強極性柱DB-WAXETR時有利于9 種物質很好的分離。因此,本實驗選用DB-WAXETR作為色譜柱。

    2.2 柱溫升溫速率的優(yōu)化

    N-亞硝胺類化合物的分子質量小、沸點低、出峰時間快,因此需要優(yōu)化柱溫的升溫速率,以獲得最佳的分離效果。選擇柱溫的起始溫度為40 ℃,分別比較了升溫速率為5 ℃/min和10 ℃/min時的分離效果,結果顯示,當初期升溫速率為10 ℃/min時,溶劑峰影響較大,且

    N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基二丙基胺的色譜峰不能很好地分開;當升溫速率為5 ℃/min時,9 種物質能夠很好地分開,所以選擇升溫速率為5 ℃/min。當柱溫升至100 ℃時,較難分離的N-亞硝基二丙基胺已經出峰,此時將升溫速率提高至20 ℃/min,當柱溫升高到250 ℃時,待測物均已出峰。在上述優(yōu)化條件下,對9 種N-亞硝胺混合標準溶液進行分析,得到標準品的總離子流圖見圖1。

    從左至右依此為N-亞硝基二甲基胺、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二乙基胺、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉N-亞硝基二丙基胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基二丁基胺、N-亞硝基二苯基胺。

    2.3 樣品前處理條件的選擇

    2.3.1 樣品提取方法的優(yōu)化

    水蒸氣蒸餾法操作繁瑣,耗時長,適用性不強,且操作溫度高,易使被測物質亞硝胺損失。趙華[22]、吳燕燕[23]等采用超聲振蕩提取法提取水產品中的N-亞硝胺,樣品添加回收率均在70%~105%,因此本研究采用超聲振蕩提取法對樣品進行前處理。

    本研究中9 種N-亞硝胺的極性不同,因此分別選用不同極性的二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、甲醇作為提取溶劑,結果表明,以二氯甲烷作為提取溶劑時目標物的回收率最高,正己烷次之。這是因為正己烷和二氯甲烷為親油性,乙酸乙酯為親油性同時有一定的親水性,丙酮、甲醇為親水性,對于含油脂較多的熟肉制品樣品,正己烷和二氯甲烷提取效率相對較高,但是正己烷的親油性太強,對水溶性的N-亞硝基二甲基胺溶解性較差,有峰形展寬的現(xiàn)象,綜合考慮選擇二氯甲烷作為提取溶劑,經過超聲法提取樣品中的N-亞硝胺。

    2.3.2 萃取溶劑體積的優(yōu)化

    在其他實驗條件相同的情況下,對20.00 g空白樣品加入固定質量濃度的混合N-亞硝胺標準溶液進行加標實驗,比較二氯甲烷用量20、30、40、50、60 mL 5個水平的萃取效果。由圖2可知,二氯甲烷體積20~40 mL時,二氯甲烷用量與色譜圖對應的峰響應強度成正比;用量40~60 mL時平均峰響應強度基本不變。因此選用40 mL為萃取體積。

    2.3.3 固相萃取凈化柱的優(yōu)化

    乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)為一種弱陰離子交換吸附劑,主要去除脂肪酸、油脂和極性色素,ODS-C18(C18)具有疏水作用,可去除油脂和非極性極強的干擾物,目前這兩種填料被廣泛應用于食品中農藥殘留檢測。王秀元等[24]采用活性炭柱凈化腌制水產品,對亞硝胺的回收率達87%,楊寧等[25]采用氧化鋁和C18混合小柱凈化腌菜中9種亞硝胺,回收率在75.7%~116.1%。

    本實驗對5種固相萃取柱(PSA柱、PSA-C18混合柱、C18柱、活性炭柱、酸性氧化鋁柱)的凈化效果進行了比較。通過樣品加標實驗,比較每種萃取柱分別對9 種N-亞硝胺的回收率以確定最佳的固相萃取柱。由表2可知,PSA和C18混合柱的凈化效果最好,回收率可達83.43%~94.92%。這是因為肉制品中含有大量的油脂和脂肪酸,PSA和C18可以很好地去除油脂和脂肪酸,因此本實驗采用PSA和C18混合柱對樣品進行凈化。

    2.4 標準曲線和靈敏度

    分別配制9 種N-亞硝胺系列質量濃度的混合標準溶液進行GC-MS測定,每個水平重復測定3 次,采用外標法進行定量,以定量離子的峰面積(Y)為縱坐標,以其質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸,得到的9 種N-亞硝胺的線性方程見表3。該方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,相關系數(shù)達0.999 2以上。

    2.5 回收率及精密度

    3 結 論

    本研究所建立的氣相色譜-質譜聯(lián)用法快速測定肉制品中9 種揮發(fā)性N-亞硝胺含量的分析方法,通過比較不同提取方法和不同固相萃取小柱凈化效果的影響,優(yōu)化了實驗分析條件。較GB/T 5009.26—2003前處理簡單快速,特異性強,重現(xiàn)性好,大幅縮短檢測時間,適用于高通量分析檢測N-亞硝胺類化合物,是一種易于操作,靈敏度高的測定方法。

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