針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織及血清miRNA-29、miRNA-320 表達(dá)的影響*

張亞敏，徐 虹，孫 華，陳素輝，王富明，楊 楊

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730)

microRNA 是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒進(jìn)化過程中，高度保守，長(zhǎng)度約為18 ～24 個(gè)核苷酸的單鏈非編碼的RNA 分子，通過mRNA 剪切和抑制蛋白翻譯方式負(fù)調(diào)控靶基因，廣泛參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等生理病理過程［1-2］。研究表明，血漿和血清中穩(wěn)定存在的miRNA 可能是某些疾病診斷的生物標(biāo)識(shí)分子［3］，而特定的miRNA 參與了缺血性腦血管病腦損傷及損傷修復(fù)過程，對(duì)缺血性腦卒中相關(guān)的特定miRNA 進(jìn)行深入研究，將為本病提供一種新的診斷策略和治療相關(guān)生物標(biāo)識(shí)分子［1-2］。課題前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)針刺大鼠百會(huì)、足三里穴能明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損，并可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)中的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPS)及水通道蛋白(Aquaporin，AQPs)實(shí)現(xiàn)，miRNA-29 可能是調(diào)節(jié)ECM穩(wěn)態(tài)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)，miRNA-320 可上調(diào)腦缺血模型大鼠中AQP1 及AQP4 基因及蛋白的表達(dá)［6-8］。據(jù)此筆者假設(shè)電針百會(huì)和足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的MMPs/AQPs 的表達(dá)是否能通過microRNA 途徑調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步探討針刺百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材

健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠(230 ～270 g)，許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的操作符合北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究指南。器材包括:2636-4A 線栓(北京沙東生物技術(shù)公司)，水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)，紫外分光光度計(jì)UV-2000(尤尼柯上海儀器有限公司)，超純RNA 提取試劑盒(美國(guó)Omega R6812)，DNase set(美國(guó)Omega E1091)，cDNA 第一鏈合成試劑盒(美國(guó)Promega M5301)，熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)伯樂CFX96)。

1.2 動(dòng)物模型制備與納入標(biāo)準(zhǔn)

大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型制作參考Longa 等［9］的線栓法。10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉大鼠。消毒后切開頸正中皮膚，暴漏右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈剪口，插入線栓，使線栓沿頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入，以閉阻右側(cè)MCA 入口，2 h 后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注，大鼠清醒后以Bederson 評(píng)分法［10］對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分(1 ～3 分納入)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組和藥物組。后3 組先制作MCAO 模型，然后根據(jù)再灌注時(shí)間又分為1 天、3 天、5 天和7 天組。假手術(shù)組:除不插線栓外和模型組相同;模型組:造模成功后每日常規(guī)抓取1 次;電針組:造模成功后，根據(jù)李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［11］中的大鼠常用針灸穴位定位法分別取百會(huì)穴(頂骨正中處)和左側(cè)足三里穴(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約5 mm 處)，以一次性無菌針灸針刺入穴位，針柄接脈沖治療儀，疏密波、頻率2 Hz、強(qiáng)度約2 mA，以肌肉收縮為度，日1 次，每次20 min;藥物組:造模成功后腹腔注射依達(dá)拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，H20031342)3 mg/kg，日1 次。

1.4 腦組織及血清標(biāo)本的制備

實(shí)驗(yàn)大鼠按照規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血后并于室溫下靜置2 h，置于離心機(jī)中離心(3500 rpm)20 min，分離血清，存于-80℃冰箱中。取血于冰上分離缺血區(qū)腦組織置于凍存管內(nèi)，液氮凍存。

1.5 腦組織及血清microRNA 提取與檢測(cè)

應(yīng)用超純RNA 提取試劑盒(美國(guó)Omega R6812)提取腦組織及血清樣本中的miRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)腦組織和血清中的miRNA-29、miRNA-320 的表達(dá)。miRNA-29 的上游引物:GGCTAG CAC CAT TTG AAA T，下游通用引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;miRNA- 320 的上游引物:GGCAAA AGC TGG GUU GAG A，下游通用引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;以GADPH 作為內(nèi)參。通過公式2-ΔΔCT計(jì)算法得到各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ±s)描述，采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(K Independent Samples Test)。各種檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為P ＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織miRNA-29 的表達(dá)變化比較

腦缺血再灌注損傷1 天到7 天時(shí)間內(nèi)，miRNA-29 表達(dá)在模型組、電針組和藥物組呈先升高后降低趨勢(shì)，再灌注3 天時(shí)達(dá)到峰值，同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，電針組和藥物組大鼠腦組織miRNA-29 表達(dá)均顯著低于模型組(P ＜0.05)，電針組與藥物組都能下調(diào)腦組織中miRNA-29 表達(dá);同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，電針組和藥物組大鼠腦組織miRNA-29 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，電針對(duì)miRNA-29 下調(diào)作用弱于藥物。見表1。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織miRNA-29 的表達(dá)變化

2.2 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-29 的表達(dá)變化比較

血清中miRNA-29 表達(dá)與腦組織中趨勢(shì)一致;同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與模型組相比，電針組和藥物組血清中miRNA-29 表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與藥物組相比，電針組血清miRNA-29 表達(dá)在1 天、3 天及5 天時(shí)間點(diǎn)顯著升高，差異具有顯著性(P ＜0.05)，但在7 天時(shí)間點(diǎn)，電針組和藥物組表達(dá)差異無顯著性。見表2。

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-29c 的表達(dá)變化(±s)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-29c 的表達(dá)變化(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05;與電針組比較，* P ＜0.05;與藥物組比較，OP ＜0.05。

組別 n 1 天 3 天 5 天 7天假手術(shù)組 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型組 3 2.46±0.13△＊O 2.71±0.15△＊O 2.53±0.10△＊O1.76±0.30△＊O電針組 3 1.90±0.07△☆O 2.06±0.09△☆O 2.01±0.06△☆O1.42±0.05△☆藥物組 3 1.21±0.05△☆＊1.39±0.10△☆＊1.23±0.04△☆＊1.27±0.03△☆

2.3 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織miRNA-320 的表達(dá)變化比較

腦缺血再灌注損傷1 天到7 天，miRNA-320 的表達(dá)在模型組、電針組和藥物組呈先降低后升高趨勢(shì)，再灌注3 天時(shí)為最低點(diǎn);與模型組相比，同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織miRNA-320 表達(dá)在電針組和藥物組均顯著升高(P ＜0.05)，電針組與藥物組都能上調(diào)miRNA-320 表達(dá);與藥物組相比，同一時(shí)間點(diǎn)電針組miRNA-320 表達(dá)顯著低于藥物組(P ＜0.05)，電針組作用弱于藥物組。見表3。

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦缺血區(qū)miRNA-320的表達(dá)變化(±s)

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦缺血區(qū)miRNA-320的表達(dá)變化(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05;與電針組比較，* P ＜0.05;與藥物組比較，OP ＜0.05。

組別 n 1 天 3 天 5 天 7天假手術(shù)組 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型組 3 0.50±0.01△＊O 0.30±0.01△＊O 0.52±0.01△＊O0.50±0.01△＊O電針組 3 0.74±0.07△☆O 0.48±0.02△☆O 0.69±0.01△☆O0.71±0.01△☆O藥物組 3 0.82±0.02△☆＊0.62±0.01△☆＊0.81±0.01△☆＊0.81±0.01△☆＊

2.4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-320 的表達(dá)變化

血清miRNA-320 表達(dá)與腦組織中趨勢(shì)一致;同期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，電針組和藥物組大鼠血清miRNA-320 表達(dá)高于同期的模型組(P ＜0.05)，電針組與藥物組都能上調(diào)miRNA-320 表達(dá);與藥物組相比，電針組miRNA-320 表達(dá)低于同一時(shí)間點(diǎn)藥物組(P ＜0.05)，與調(diào)控腦組織miRNA-320 的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。見表4。

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-320 的表達(dá)變化(±s)

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清miRNA-320 的表達(dá)變化(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05;與電針組比較，* P ＜0.05;與藥物組比較，OP ＜0.05。

組別 n 1 天 3 天 5 天 7天假手術(shù)組 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型組 3 0.49±0.03△＊O 0.36±0.03△＊O 0.51±0.02△＊O0.44±0.11△＊O電針組 3 0.79±0.05△☆O 0.54±0.04△☆O 0.65±0.02△☆O0.80±0.04△☆O藥物組 3 0.88±0.04△☆＊0.70±0.08△☆＊0.73±0.02△☆＊0.91±0.01△☆＊

3 討論

缺血性腦血管病約占腦卒中總數(shù)的80%，死亡率和致殘率均較高，造成了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)［12］。探索缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制，并采取安全有效的干預(yù)措施來降低缺血性腦血管病引起腦組織損傷，已成為亟待解決的難題。本病屬中醫(yī)中風(fēng)范疇，病機(jī)為陰陽(yáng)失調(diào)、氣血逆亂。根據(jù)針灸經(jīng)絡(luò)理論，百會(huì)穴總督一身之陽(yáng)，位于頭部巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，具有開竅醒神之功?！安∽?cè)谀X，首取督脈”為治療腦缺血疾病的首選，且百會(huì)穴為手足三陽(yáng)、督脈、足厥陰之會(huì)，內(nèi)系于腦，可通督醒神。足三里穴為足陽(yáng)明經(jīng)要穴，陽(yáng)明經(jīng)多氣多血，又“主潤(rùn)宗筋”，宗筋約束骨骼，利于關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)，對(duì)中風(fēng)之“肢體痿痹不用”尤為適宜。腦缺血后機(jī)體正氣不足，屬于積損正衰，百會(huì)和足三里穴兩穴同用具有補(bǔ)中益氣、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)之效，研究顯示其對(duì)缺血性腦血管病的良好調(diào)節(jié)作用［13-14］。

miRNAs 家族通過與特定mRNA 的3'端非翻譯區(qū)(3'-Untranslated Regions，3'UTR)的不完全或完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制靶mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)或促使其降解。最近的研究表明腦缺血后大量的基因被誘導(dǎo)或抑制，可能與miRNA 介導(dǎo)的mRNA 的降解和翻譯負(fù)調(diào)控作用相關(guān)。腦出血和腦水腫形成的主要原因是血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的開放，造成腦組織的繼發(fā)性損傷。BBB 是腦組織與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的通道，對(duì)腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持起著重要作用［15］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后諸多因子參與了后續(xù)的BBB 破壞。MMPs 可降解和重塑包括緊密連接蛋白、基膜蛋白等的細(xì)胞外基質(zhì)，和BBB 完整性密切相關(guān)［16-17］，AQPs 是一組具有高選擇性的水孔道特異蛋白家族，分布于腦部的主要為AQP4。AQP4是膠質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞間液、腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和交換的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與了腦缺血再灌注后BBB 破壞，腦水腫的形成［18-19］。miRNA-29 家族調(diào)節(jié)包括富含半胱氨酸的分泌蛋白、層粘連蛋白、膠原I及膠原IV、MMPs 等，是調(diào)節(jié)ECM 穩(wěn)態(tài)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)［6-7］。研究顯示miRNA-29 在人和大鼠的腦缺血后上調(diào)，可能通過調(diào)控ECM 參與了腦缺血后血腦屏障的破壞［20］，Sepramaniam 等［8］報(bào)道抗miRNA-320 可上調(diào)MCAO 模型大鼠中AQP1 及AQP4 基因及蛋白的表達(dá)。miRNA-320 能與編碼AQP4 蛋白的mRNA 結(jié)合，導(dǎo)致其翻譯停滯或降解，負(fù)調(diào)控AQP4 蛋白表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究選定的陽(yáng)性對(duì)照藥為依達(dá)拉奉，可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，減輕腦缺血后和腦缺血引起的水腫及組織損傷，并緩解損傷后伴隨的神經(jīng)癥狀［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)針刺大鼠百會(huì)、足三里穴能下調(diào)miRNA-29 的表達(dá)。電針能抑制細(xì)胞外基質(zhì)破壞的miRNA-29 在腦組織及血清中的表達(dá)，從而多途徑減少ECM 降解，且電針組大鼠腦組織及血清miRNA-320 表達(dá)較模型組顯著升高，可能通過此途徑下調(diào)了AQP4 蛋白的表達(dá)，減輕腦水腫程度，保護(hù)缺血后腦組織。藥物組對(duì)miRNA-29、miRNA-320 的調(diào)控作用優(yōu)于同時(shí)期的電針組。

本研究結(jié)果表明針刺大鼠百會(huì)、足三里穴能下調(diào)腦缺血大鼠腦組織及血清miRNA-29 的表達(dá)，上調(diào)miRNA-320 表達(dá)，減輕缺血再灌注后腦損傷，針刺對(duì)腦缺血再灌注后腦組織有一定的保護(hù)作用，但具體保護(hù)作用機(jī)制與依達(dá)拉奉的作用機(jī)制尚待研究。針刺及藥物在防治腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究雖然已取得了一定的成效，為臨床防治腦缺血性疾病奠定了一定的理論基礎(chǔ)。然而腦缺血再灌注損傷的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，因此，多機(jī)制、多藥物聯(lián)合運(yùn)用的綜合性研究有待進(jìn)一步開展，可從整體、分子和基因水平等不同角度對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，將針刺與藥物聯(lián)合應(yīng)用，采用中西醫(yī)結(jié)合療法開展基礎(chǔ)與臨床研究，為臨床防治腦缺血性疾病提供科學(xué)依據(jù)，是今后研究的重要方向。

［1］ Liu DZ，Tian Y，Ander BP，et al. Brain and blood microRNA expression profiling of ischemic stroke，intracerebral hemorrhage，and kainate seizures［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30(1):92-101

［2］ Lim KY，Chua JH，Tan JR，et al. MicroRNAs in Cerebral Ischemia［J］.Transl Stroke Res，2010，1(4):287-303

［3］ Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10):997-1006

［4］ Xu H，Zhang Y，Sun H，et al. Effects of acupuncture at GV20 and ST36 on the expression of matrix metalloproteinase 2，aquaporin 4，and aquaporin 9 in rats subjected to cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.PLoS One，2014，9(5):e97488

［5］ Zhang YM，Xu H，Sun H，et al.Electroacupuncture treatment improves neurological function associated with regulation of tight junction proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014:989340

［6］ Du B，Ma LM，Huang MB，et al.High glucose down-regulates miR-29a to increase collagen IV production in HK- 2 cells［J］. FEBS Lett，2010，584(4):811-816

［7］ Ogawa T，Iizuka M，Sekiya Y，et al.Suppression of type I collagen production by microRNA-29b in cultured human stellate cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1):316-321

［8］ Sepramaniam S，Armugam A，Lim KY，et al.MicroRNA 320a functions as a novel endogenous modulator of aquaporins 1 and 4 as well as a potential therapeutic target in cerebral ischemia［J］. J Biol Chem，2010，285(38):29223-29230

［9］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91

［10］ Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-476

［11］ 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007

［12］ 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).2013 中國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒［M］.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2013

［13］ Tao J，Xue XH，Chen LD，et al.Electroacupuncture improves neurological deficits and enhances proliferation and differentiation of endogenous nerve stem cells in rats with focal cerebral ischemia［J］. Neurol Res，2010，32(2):198-204

［14］ Dong H，F(xiàn)an YH，Zhang W，et al. Repeated electroacupuncture preconditioning attenuates matrix metalloproteinase-9 expression and activity after focal cerebral ischemia in rats［J］. Neurol Res，2009，31(8):853-858

［15］ Krueger M，Hartig W，Reichenbach A，et al. Blood- brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions［J］. PLoS One，2013，8(2):e56419

［16］ Morancho A，Rosell A，Garcia-Bonilla L，et al.Metalloproteinase and stroke infarct size:role for anti-inflammatory treatment?［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1207:123-133

［17］ Kurzepa J，Kurzepa J，Golab P，et al.The significance of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in the ischemic stroke［J］.Int J Neurosci，2014，124(10):707-716

［18］ Manley GT，F(xiàn)ujimura M，Ma T，et al. Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke［J］.Nat Med，2000，6(2):159-163

［19］ Zeng X，Asmaro K，Ren C，et al. Acute ethanol treatment reduces blood-brain barrier dysfunction following ischemia/reperfusion injury［J］.Brain Res，2012，1437:127-133

［20］Tan JR，Koo YX，Kaur P，et al.microRNAs in stroke pathogenesis［J］.Curr Mol Med，2011，11(2):76-92

［21］ Isahaya K，Yamada K，Yamatoku M，et al.Effects of edaravone，a free radical scavenger，on serum levels of inflammatory biomarkers in acute brain infarction［J］. J Stroke Cerebrovasc Dis，2012，21(2):102-107

［22］ 劉春寒，薛慎伍.依達(dá)拉奉對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷的保護(hù)和MDA、SOD 的影響［J］.藥學(xué)與臨床研究，2011(6):518-520