火針對脊髓損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損恢復程度和脊髓神經(jīng)超微結構的影響*

王劍歌，李巖，周震，陸軍，劉保紅，蔡志敏，程素利，周智梁

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津300193;2.天津市公安醫(yī)院，天津300042;3.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300150)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常導致患者殘疾或死亡的損傷性疾病，給無數(shù)家庭帶來極大痛苦。因此對于脊髓損傷的恢復，尤其是組織結構及運動神經(jīng)功能恢復的研究逐漸成為大家關注的熱點與難點。本研究通過建立急性SCI 模型大鼠，在不同時段運用Basso-Beattic-Bresnahan 行為功能評分(BBB運動評分)［1］，采用透射電鏡進行超微結構觀察，觀察火針療法對SCI 模型大鼠神經(jīng)功能缺損恢復程度和脊髓神經(jīng)超微結構的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康SD 雄鼠，重約260 ～300 g。由中國食品藥品檢定研究所提供(許可證號:SCXK(京)2009-0017);標準條件統(tǒng)一喂養(yǎng)。天津?qū)嶒瀯游镏行娘曫B(yǎng)、觀測、造模、取材。

1.2 實驗儀器

HITACHI H-7500 透射電子顯微鏡(Electron Microsope)(日本制造);超薄切片機LKB-III

1.3 實驗試劑

20 g/L 戊巴比妥鈉;2.5%戊二醛;二甲砷酸鈉緩沖液;1%鋨酸;酒精。

2 實驗方法

2.1 動物分組

本實驗通過隨機對照盲法，將大鼠分為火針治療組、脊髓損傷對照組、空白組和假手術組，其中火針治療組和脊髓損傷對照組每組又分為1 天、3 天、7 天、10天、14 天5 個時間段，每個時間段各10 只。

2.2 模型制備

采用改良的Allen's 法制備急性SCI 動物模型［2］，術后飼養(yǎng)大鼠謹防感染，每天常規(guī)擠壓膀胱排尿3 次，直到反射性膀胱排空形成。

2.3 治療方法

本實驗穴位選取參考《動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學》。具體穴位為T7、T8、T11、T12棘突下兩側的華佗夾脊穴。

火針針刺方法:穴位常規(guī)消毒后，左手持酒精燈，右手持火針。加熱針體至通紅后向選好的穴位速刺，每穴刺一針，共8 穴，深度為3 ～5 mm。

2.4 電鏡標本提取

大鼠處死后于冰上取大鼠損傷部位脊髓，投入4℃2.5%戊二醛固定液中固定2 h;二甲砷酸鈉緩沖液沖洗;1%鋨酸4℃固定2 h;ddH2O 沖洗;梯度酒精脫水;環(huán)氧丙烷置換;Epon812 包埋;包埋塊修整;取1 μm半薄切片，天青-美蘭染色，光學顯微鏡定位;醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

2.5 運動功能評分

在各評分時間點將大鼠排空膀胱后對其進行BBB 評分。首先將動物置于2 m2的光滑平地，使其自主運動5 min，然后參照評分標準評分。滿分為21 分，共分3 項。第一項為0 ～7 分，對大鼠下肢各個關節(jié)活動進行評判;第二項為8 ～13 分，評判下肢的步態(tài)及是否協(xié)調(diào);第三項為14 ～21 分，評判爪的精細動作。運動功能越好則得分越高。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，檢驗方法為非參數(shù)檢驗，P ＜0.05 表示差異具有顯著性意義。

3 實驗結果

3.1 BBB 評分結果

大鼠BBB 評分見表1。從術后3 天開始，火針治療組與脊髓損傷對照組評分結果均逐漸升高，并持續(xù)到術后14 天，但火針治療組評分均高于脊髓損傷對照組。

表1 大鼠各個時間段運動神經(jīng)功能BBB 評分比較

3.2 電鏡觀察

假手術組與空白組的有髓神經(jīng)纖維髓鞘排列規(guī)則，板層致密，髓索結構正常，與髓鞘之間無間隙。內(nèi)容物線粒體、微絲、微管數(shù)量正常。神經(jīng)元細胞結構清晰完整，含有高爾基復合體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、尼氏體、神經(jīng)原纖維和溶酶體等結構。細胞核大而圓，核膜完整，核染色質(zhì)顆粒細致，分布均勻。

脊髓損傷對照組顯示大量有髓神經(jīng)髓鞘分層水腫，髓索明顯縮小，線粒體、微絲、微管明顯減少，見封三圖1。

神經(jīng)元細胞膜局部缺如，細胞質(zhì)輕度水腫，細胞器數(shù)量減少，線粒體部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，嵴有缺失和空化現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度溶合和脫顆?，F(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少，見封三圖2。

火針治療組顯示有髓神經(jīng)髓鞘分層水腫，髓索明顯縮小，線粒體、微絲、微管明顯減少，見封三圖3。

神經(jīng)元細胞質(zhì)輕度水腫，細胞器數(shù)量減少，線粒體部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，可見嵴有缺失現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度溶合和脫顆粒現(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少，核形狀比較整齊，核膜、核仁較正常，見封三圖4。

4 討論

研究提示，初級神經(jīng)元的損失是神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能障礙的最根本的原因，并且神經(jīng)元的存活是神經(jīng)損傷后再生修復的先決條件［3］。在脊髓損傷模型大鼠運動功能評定方面，本實驗選擇BBB 評分。其特點是包括了SCI 后大鼠后肢恢復過程中所有行為變化，與脊髓損傷的程度相符度高，且評分者在評分時主觀因素少［4］。

火針療法，古代稱為“焠刺”，不同于毫針的特點是需要將針體加熱燒紅后，再進行針刺?！鹅`樞·官針》云:“焠刺者，刺燔針則取痹也?！奔顾钃p傷屬于中醫(yī)“痿證”、“痹癥”。脊髓損傷后臨床癥狀多是因為督脈不通、氣滯血瘀。火針可以行氣活血、溫通經(jīng)脈，在臨床應用中對于多種疾病具有顯著療效，尤其是痹證［5］。華佗夾脊穴與督脈相連，針刺可以直達病所，同時避免了直接刺激督脈腧穴出現(xiàn)損失脊髓的可能性。因此，火針針刺華佗夾脊穴安全、有效，一定程度上減輕了脊髓損傷的臨床癥狀。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)火針能夠促進脊髓損傷大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子陽性神經(jīng)元的表達和運動神經(jīng)元功能的恢復［6］，且火針干預的血清能夠誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖分化［7］。

本研究結果提示，脊髓損傷后的神經(jīng)功能學評分與電鏡下脊髓的組織結構變化具有相關一致性?；疳樦委熀蟠笫蠊δ芑謴统潭扰c脊髓損傷對照組相比有顯著性差異，電鏡下火針治療組大鼠脊髓損傷部位可見神經(jīng)元胞核和神經(jīng)纖維修復再生，表明火針可以促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復。

［1］ Scheff SW，Saucier DA，Cain ME. A statistical method for analyzing rating scale data:the BBB locomotor score［J］.J Neurotrauma，2002，19(10):1251-1260

［2］ 孫立明，李巖，周震，等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關蛋白表達的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，26(12):49-53

［3］ Fu S Y，Gordon T.The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration［J］.Molecular neurobiology，1997，14(1-2):67-116

［4］ 王民，王棟琪，宋煥瑾.脊髓損傷后大鼠后肢運動功能恢復不同評分標準的比較［J］. 西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2006，27(3):243-245

［5］ 李巖，周震，賀普仁，等.火針治療痹癥的療效觀察［J］.中國針灸，2003，23(7):408-411

［6］ 李巖，程素利，周震，等. 火針對大鼠脊髓損傷后運動功能及BDNF 表達的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29(9):545-547

［7］ 李巖，周震，程素利，等.火針干預脊髓損傷大鼠血清對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2013，30(1):25-27