夾脊電針對脊髓損傷后大鼠c-fosmRNA 及BNIP3 mRNA 表達影響的實驗研究*

李曉寧，張 良，楊慶紅，劉雙嶺，單筱淳，欒仲秋，孔 菲

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;2.安達市紅十字會醫(yī)院，黑龍江 安達151400;3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱150040;4.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040)

脊髓損傷是臨床上常見且嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾患。其發(fā)生原因多為意外事故如車禍傷、墜落傷等造成患者嚴重的肢體傷殘，對患者本人及其家庭造成極大的身心傷害和經(jīng)濟負擔，同時也為社會增添負擔。繼發(fā)性病理機制十分復雜，隨著電針療法的深入研究，電針治療脊髓損傷的臨床療效已被證實。本研究通過研究夾脊電針對c-fos mRNA 及BNIP3 mRNA 表達的影響，探討夾脊電針治療脊髓損傷的作用機制以及c-fos mRNA及BNIP3 mRNA 在脊髓損傷中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

將由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供的45只Wistar 健康雄性大鼠，重量為(200 ±20)g，隨機分為3 組:夾脊電針組、模型對照組、假手術對照組。每組再分為1 天、3 天、7 天3 個時間亞組，每個亞組為5 只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作 用改良的Allen’s 氏法［1］制作脊髓損傷模型。手術操作方法:首先用10%的水合氯醛(300 mg/kg)進行腹腔注射麻醉，再將麻醉后的大鼠于仰臥位固定于拱形鼠臺，腹部墊一約3 cm 的軟墊，在手術部位皮膚常規(guī)消毒。確定手術位置后，選取后背正中切口，在第8 胸椎上2.5 cm、下0.5 cm 切長約3 cm 的縱行切口。通特制手術鉗咬除T7～T9全部棘突及椎板，脊髓背側(cè)硬膜表面放置一塊彎曲度與脊髓表面相符合的金屬墊片作為打擊板，面積0.25 cm×0.4cm，用5 g 圓柱狀金屬棒在玻璃導管的引導下從20 cm 高處落下，行重力打擊，致傷力為5 g ×10 cm，以T8為中心造成該段脊髓損傷。脊髓損傷造模術后分層縫合切口。造模成功的標準:①身體痙攣性顫動;②尾巴痙攣性搖動;③硬脊膜內(nèi)充血或血腫。3 個征象出現(xiàn)2 個即為造模成功。術后處理:保持室溫在20℃～25℃，正常喂養(yǎng)。

1.2.2 治療方法 ①夾脊電針組:造模成功后進行電針治療，每次30 min，1 天1 次。技術指標:采用KWD-808II 型脈沖電針儀;取穴部位:在距損傷上下端兩個椎體的棘突間隙旁開距中線旁開約3 ～4 mm 處取穴。操作:用30 號一寸毫針垂直刺入4 ～5 mm，兩組導線分為正負極，分別上下連接針柄，正極在上，負極在下，然后打開電流輸出旋鈕，使用連續(xù)脈沖電流，電流輸出強度1 Hz，電壓0.5 V。②模型對照組:手術造模后不給予任何治療，僅常規(guī)飼養(yǎng)。③假手術對照組:手術后常規(guī)飼養(yǎng)，不給予任何治療。

1.2.3 檢測指標 ①CBS 聯(lián)合評分法:CBS 評分包括5 項指標，分別為:斜面試驗、步態(tài)、縮腿反射翻、正反射和趾伸反射，按照時間點對各組大鼠進行動態(tài)觀察并綜合評分，客觀準確的評價肢體恢復的情況。②c-fos mRNA 表達的檢測:各組動物在進行麻醉后，開胸腔暴露出心臟，依次灌注150 ml 生理鹽水，使其經(jīng)左心室流入主動脈，直至流出清亮液體，灌注多聚甲醛40 g/L 固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)切片呈冠狀。取標本切片，進行雜交，繼加生物素化鼠抗地高辛抗體標記物，最后DAB 顯色。③BNIP3 mRNA 表達的檢測:對各組大鼠分別取材后常規(guī)石蠟包埋、切片，采用RT-PCR 方法檢測，經(jīng)過勻漿化作用，分離階段，RNA 的沉淀、洗脫、再溶解，用于逆轉(zhuǎn)錄，觀察各組脊髓損傷后不同時間段內(nèi)BNIP3 mRNA 表達結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理

處理運用SPSS19.0 進行統(tǒng)計學分析，CBS 評分、c-fos mRNA 基因表達比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 示檢驗的差別有統(tǒng)計意義。BNIP3 mRNA 檢測，符合正態(tài)分布采用t 檢驗;不符合正態(tài)分布采用Wilcoxon 檢驗，P ＜0.05 示檢驗的差別有統(tǒng)計意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 CBS 聯(lián)合評分

實驗中對大鼠的CBS 五項指標進行觀察并評分，分別在術后第1 天、3 天、7 天對大鼠進行聯(lián)合行為評分，干預后不同時間CBS 評分的差異有統(tǒng)計學意義。3 組大鼠CBS 評分的組間差異總體上有統(tǒng)計學意義。干預1 天、3 天后，3 組大鼠的動作完成無顯著差異;干預7 天后，夾脊電針組大鼠的動作完成明顯優(yōu)于假手術組和模型組，具有顯著性差異。見表1。

表1 各組CBS 聯(lián)合評分比較

2.2 c-fos mRNA 的表達結(jié)果

c-fos mRNA 陽性表達，在前角神經(jīng)元處表達最強，也可見于后角的中小神經(jīng)元等處。假手術組脊髓內(nèi)存在少量c-fos mRNA 弱陽性的神經(jīng)細胞，且3 個時間點表達的變化不顯著;模型組和夾脊電針組的cfos mRNA 表達，在術后均迅速升高，在術后第1 天時明顯升高，第3 天時，表達逐漸下降，第7 天時有所回升;夾脊電針組和模型組在各時間點的c-fos mRNA表達陽性細胞數(shù)量，與假手術組相比，差異具有顯著意義(P ＜0.05);術后第1 天時，夾脊電針組與模型組相比，c-fos mRNA 表達陽性細胞數(shù)低于模型組;術后第3 天時，夾脊電針組與模型組相比，不具有顯著差異;術后第7 天時，夾脊電針組與模型組相比，c-fos mRNA 表達陽性細胞數(shù)高于模型組。見表2。

表2 各組c-fos mRNA 表達結(jié)果比較

2.3 各組BNIP3 mRNA 表達水平比較

由表3 可知，夾脊電針組內(nèi)比較，治療7 天組與治療1 天和3 天組相比，BNIP3 mRNA 表達水平明顯降低(P ＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;夾脊電針組與模型夾脊電針組相比，夾脊電針組7 天時，BNIP3 mRNA表達水平有明顯降低(P ＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。

表3 各組治療不同時間BNIP3 mRNA 表達水平比較(±s)

表3 各組治療不同時間BNIP3 mRNA 表達水平比較(±s)

注:與3 天比較，* P ＜0.05;與模型組7 天比較，#P ＜0.05。

組別 1 天 3 天 7天夾脊電針組 0.759 ±0.059 0.643 ±0.060 0.200 ±0.074*#模型組 0.781 ±0.047 0.819 ±0.875 0.716 ±0.091假手術組0.00 ±0.000 0.00 ±0.000 0.00 ±0.000

3 討論

夾脊電針治療脊髓損傷的機理復雜，從中醫(yī)角度講，督脈損傷是脊髓損傷的病理基礎，夾脊電針通過疏通督脈，起到振奮陽氣使陰陽調(diào)和的作用。夾脊電針［2］對脊髓損傷大鼠運動及感覺功能恢復取得了一定臨床療效。從現(xiàn)代醫(yī)學角度講，夾脊穴位于脊神經(jīng)后支，電刺激可直接作用于脊髓及其包膜，調(diào)節(jié)血液供應及神經(jīng)功能。對夾脊穴電刺激，可影響到與交感神經(jīng)有聯(lián)系的脊神經(jīng)，使機體產(chǎn)生反應，而交感神經(jīng)通過神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)，釋放有關的化學介質(zhì)，從而治療疾病。有學者很早提出［3］:夾脊電針形成電場，可以促進脊髓纖維的再生;夾脊電針可以通過提高抗氧化酶的活性，使組織免受自由基的繼發(fā)損傷;使細胞凋亡因子得到抑制，傷區(qū)脊髓組織的微循環(huán)得以改善，促進脊髓損傷的恢復。

本實驗運用CBS［4］聯(lián)合評分法進行評分，考慮到造模后，對大鼠損傷較大，游泳實驗易引起傷口感染，影響實驗結(jié)果，故采用85 分評分標準，使觀察指標更精準和客觀。通過CBS 評分法得出:干預1 天、3 天后，3 組大鼠的CBS 評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義;干預7 天后，夾脊電針組大鼠的CBS 評分與假手術組和模型組比較，差異具有顯著意義。說明夾脊電針的治療短期內(nèi)療效一般，但長期治療效果顯著。

c-fos 基因?qū)儆诩纯淘缙诨虻囊环N，在正常生理情況下，c-fos 基因的陽性細胞數(shù)表達在神經(jīng)元及細胞中呈低水平，中樞神經(jīng)元受到各種外界刺激后，受體和第二信使被激活，誘導c-fos 轉(zhuǎn)錄合成m RNA，并譯成蛋白在胞漿中與目的基因結(jié)合，使目的基因的表達被激活，促使其產(chǎn)生迅速、一過性表達。c-fos 基因被誘導的數(shù)量與所受刺激強度一致，可作為研究脊髓損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能及結(jié)構(gòu)的指標［5］。有學者研究發(fā)現(xiàn):刺激因素的不同對c-fos 基因表達出現(xiàn)的快慢及持續(xù)時間長短有所不同。本實驗通過觀察得出:3組間相比較，假手術組分別與夾脊電針組、模型組相比，c-fos mRNA 表達的陽性細胞數(shù)顯著升高;3 個時間點相比較，夾脊電針組和模型組的c-fos mRNA 表達的陽性細胞數(shù)1 天達到最高，3 天時明顯下降，這提示了大鼠脊髓損傷后c-fos mRNA 的表達增強與脊髓繼發(fā)性損傷有密切關系，這可能與一種機體對機械刺激以及疼痛的應激性反應有關;7 天時c-fos mRNA表達的陽性細胞數(shù)表達回升，在第7 天時，夾脊電針組與模型組比較，明顯高于模型組。根據(jù)Hayashi 等［6］研究，發(fā)現(xiàn)即刻早期基因可能促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，進而促進損傷神經(jīng)細胞的再生;此外，柯青［7］在研究針刺促進脊髓可塑性的關系中發(fā)現(xiàn):第7 天時，針刺脊髓及背根節(jié)c-fos mRNA 的表達有促進作用，表達顯著增加，提示c-fos mRNA 可能是促進脊髓可塑性的分子機制之一。故第7 天時，模型對照組與夾脊電針組c-fos mRNA 表達水平回升。

BNIP3 屬于Bcl2 家族成員，BNIP3 蛋白C 末端含有一個跨膜區(qū)域可與線粒體膜結(jié)合，引起線粒膜通透性孔開放，膜電位降低，活性氧增加，導致細胞死亡［8］。而BNIP3 mRNA 的促細胞凋亡機制［9］主要有與缺氧以及缺氧誘導因子有關的途徑、促細胞凋亡線粒體途徑、非依賴Caspase 的細胞凋亡途徑。于大堂等［10］發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠線粒體自噬相關蛋白BNIP3表達增高?？梢夿NIP3 表達與脊髓損傷密切相關。

綜上所述，夾脊電針治療脊髓損傷不僅可以改善運動、感覺功能，通過抑制脊髓損傷后促凋亡細胞

BNIP3 mRNA 的表達以及對脊髓損傷有益的即刻凋亡基因c-fos 基因的表達，起到促進脊髓可塑性、抑制細胞凋亡的作用，而且長期療效較好，是安全、經(jīng)濟、環(huán)保的優(yōu)選治療方法，為脊髓損傷的長期、分階段治療提供了理論依據(jù)。脊髓損傷的各階段c- fos 基因、BNIP3 mRNA 對細胞凋亡的影響已得到證實，但其對脊髓損傷后恢復的作用機制仍不十分明確，還需進一步探討。

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