遼寧千山地區(qū)含cry8類基因的蘇云金芽孢桿菌的分離、克隆與表達(dá)

孫鈺航++劉艷杰++李海濤++高繼國(guó)

摘要：QWH132、QZL1-2、QWH 7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從遼寧千山地區(qū)自行分離的含有cry8類基因的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），具有鞘翅目殺蟲活性。本研究在6株菌株中成功發(fā)現(xiàn)并克隆了6個(gè)靶標(biāo)生物為鞘翅目的cry8類基因，其中被鑒定為cry8C類、cry8D類、cry8F類（大小為3 525 bp）、cry8K類的基因各有1個(gè)，被鑒定為cry8E類的基因有2個(gè)，其大小分別為3 534、3 495 bp。后4個(gè)基因已在GenBank注冊(cè)，登記號(hào)依次為KC778983、KC778983、KC778984、KC778985。將6個(gè)基因插入pEB表達(dá)載體，經(jīng)過PCR檢測(cè)與 SDS-PAGE 分析證實(shí)它們能在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，這6個(gè)基因的表達(dá)約有126～128 ku的蛋白，這些菌株中的Cry8蛋白為進(jìn)一步發(fā)掘我國(guó)天然的蘇云金芽孢桿菌資源與構(gòu)建新的殺鞘翅目昆蟲的高效工程菌提供了重要的試驗(yàn)材料與新思路。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；大腸桿菌；質(zhì)粒；cry8基因；克隆；表達(dá)；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0028-04

收稿日期：2014-01-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2011AA10A203、2010RCB54）。

作者簡(jiǎn)介：孫鈺航（1984—），男，黑龍江牡丹人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：weiweiabcd222@163.com。

通信作者：高繼國(guó)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是目前應(yīng)用最多也是應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑。它是天然的昆蟲病原菌，對(duì)無脊椎動(dòng)物中的4個(gè)門（包括節(jié)肢動(dòng)物門中的16個(gè)目的3 000種以上）的害蟲有活性[1]，而對(duì)非目標(biāo)生物安全，從而廣泛用于防治鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等農(nóng)林害蟲[2]。蘇云金芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種殺蟲活性物質(zhì)，其中主要有Cry蛋白、Vip蛋白、Sip蛋白，其中對(duì)Cry蛋白與Vip蛋白的研究較深入[3]。隨著研究與應(yīng)用的深入，Bt殺蟲基因在殺蟲工程菌和轉(zhuǎn)基因抗蟲植物廣泛應(yīng)用的過程中已發(fā)現(xiàn)多種昆蟲在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性，在田間也發(fā)現(xiàn)了具有抗性的個(gè)體[4]，因此，篩選、克隆新的高毒力、殺蟲譜廣且不易產(chǎn)生抗性與交互抗性的基因是解決問題的重要途徑之一[5]。Cry8類蛋白質(zhì)在Bt中分布比較廣泛，它們對(duì)金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺滅作用[6]。但目前成功防治鞘翅目害蟲的Bt菌株和產(chǎn)品數(shù)量還相對(duì)較少，鞘翅目害蟲是糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、園藝和森林的重要害蟲，因此分離新的對(duì)鞘翅目害蟲具有較高殺滅效果的Bt菌株并研究其殺蟲蛋白基因，對(duì)于開發(fā)高效安全的生物殺蟲劑和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物有重要的理論和實(shí)踐意義[7]。近些年發(fā)現(xiàn)的Bt殺蟲活性物質(zhì)另外一種Sip蛋白也具有鞘翅目害蟲活性，Sip蛋白的發(fā)現(xiàn)為Bt殺蟲活性蛋白提供了一條新思路[8]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行分離出QWH132、QZL1-2、QWH7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101菌株，經(jīng)鑒定這些菌株中含有cry8類具有鞘翅目殺蟲活性的基因。本研究以這些菌株為模板，分離克隆菌株中的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因，并對(duì)其中所含的cry8類基因進(jìn)行克隆與表達(dá)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本試驗(yàn)所用菌株分離自遼寧千山采集的土樣，采用醋酸鈉-抗生素篩選法進(jìn)行分離[9]。其余菌株質(zhì)粒見表1。

1.1.2酶及生化試劑2×Taq mix、2 × Primer Star mix均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；其他均為市售國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純或電泳級(jí)純化學(xué)試劑。

1.1.3主要儀器主要儀器包括Labnet PCR儀[Multigene Gradient（TC9600-G-230V）]、蛋白電泳儀（BIO-RAD MiNi-PROTEAN Tetra system）、離心機(jī)Beckman（AllegraTM64R Centrifuge）、北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的ChampGel 6000全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)Gel Documentation And Image Analysis System等。

1.1.4培養(yǎng)基與抗生素液體LB：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，加水定容到1 000 mL，調(diào)pH 值為70；固體LB：在液體培養(yǎng)基中加入1.3%瓊脂。1/2固體LB：蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1 000 mL，加入1.3%瓊脂，調(diào)pH值至7.0；將氨芐青霉素、卡那霉素配制成100 mg/mL的水溶液，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾除菌，-20 ℃ 保存。

1.2方法

1.2.1從土壤中分離Bt菌Bt菌株分離純化的方法參照文獻(xiàn)[10]。表1菌株與質(zhì)粒

菌株質(zhì)粒特點(diǎn)描述來源大腸桿菌

（Escherichia coli）Rosetta

F-ompT hsdSB （RB-mB-） gal dcm λ（DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]） pLysSRARE（CamR）筆者所在實(shí)驗(yàn)室

JM109

rpsL（strr）、thr、leu、thi-1、lacY、galK、galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、Δ（lac-proAB）、[F′，traD36，proAB，laclqZΔM15]筆者所在實(shí)驗(yàn)室蘇云金芽孢桿菌QWH132筆者所在實(shí)驗(yàn)室QZL1-2筆者所在實(shí)驗(yàn)室QWH 7-2筆者所在實(shí)驗(yàn)室QZL144-1筆者所在實(shí)驗(yàn)室QZL144-2筆者所在實(shí)驗(yàn)室QWH101筆者所在實(shí)驗(yàn)室PlasmidspMD19-T VectorAmprTaKaRa公司pEB