新城疫病毒疫苗株F蛋白裂解位點改造對誘導HepG2細胞發(fā)生自噬的影響

吳云舟，安 瑩，孫 田，何金嬌，王 卉，朱升龍，田貴游，尹杰超，張?zhí)煸缮?，?霽，曲素素，劉 暢，李德山

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/生物制藥學教研室，黑龍江哈爾濱150030)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)具有殺傷腫瘤細胞的能力，而對正常細胞不產(chǎn)生影響。其過程是通過啟動不依賴p53的內(nèi)源性凋亡通路誘導腫瘤細胞凋亡，并激活免疫系統(tǒng)對腫瘤進行識別殺傷和免疫記憶[1]。NDV感染早期可以誘導神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251發(fā)生自噬[2]。自噬是指一些需降解的蛋白質(zhì)和細胞器等胞漿成分被包裹，并最終運送至溶酶體降解的過程。廣義上的自噬包括巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(M icroautophagy)和分子伴侶介導的自噬(Chapeon-mediated autophagy)3種類型，通常所說的自噬即指巨自噬。

NDV融合蛋白(F)以前體F0的形式表達，F(xiàn)0在宿主細胞蛋白酶作用下裂解成F1和F2使病毒獲得感染性[3]。所有NDV弱毒株的F蛋白堿裂解位點具有共同的GGRQGR↓L基序，因此只有類胰酶的細胞外蛋白酶能夠裂解NDV弱毒株F蛋白，使病毒只能感染特定的組織細胞[5]。而強毒的F蛋白裂解位點為GR/KRQR/KR↓F基序，能夠裂解強毒株F蛋白的蛋白酶廣泛存在于各種組織和器官中[6]，因此能夠?qū)е轮旅娜硇愿腥綶7]。

由于NDV的F蛋直接影響病毒毒力與腫瘤殺傷能力，由此我們推測NDV的F蛋白可能在誘導自噬的過程中起到重要作用。隨著NDV反向遺傳操作操作技術的成熟，為NDV的研究提供了新的契機[8-9]。我們應用已經(jīng)建立的NDV Clone30株反向遺傳操作系統(tǒng)技術平臺，將Clone30株F蛋白的裂解位點由GGRQGR↓L突變?yōu)閺姸镜?GRRQRR↓F，并證明突變裂解位點的重組NDV可以在感染HepG2細胞早期增加其自噬程度，該結果為進一步研究NDV殺傷腫瘤細胞的機理奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞及實驗動物 NDV Clone30疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)包括感染性質(zhì)粒由本實驗室建立；pBPClone30-w t和輔助質(zhì)粒pBR-NP、pBR-P和pBR-L、幼倉鼠腎細胞(BHK-21)、雞胚成纖維細胞(DF-1)和人肝癌細胞(HepG2)均購自ATCC；SPF雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心。兔抗鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4連接酶均購自NEB公司；DNA分子量Marker、pMD18-T、RT-PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；RNA酶抑制劑、逆轉錄酶(M-MLV)、RNA提取試劑TRIzol均購自Promega公司；轉染試劑Lipofectmine 2000購自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA公司；LC3抗體購自sigma公司；細胞裂解液購自碧云天公司。

1.3 病毒F基因裂解位點序列的突變 在pBPClone30-w t的基礎上，通過PCR引物，將NDV的F基因裂解位點編碼序列由GGRQGRL突變?yōu)閺姸局甑腉RRQRRF，構建pClone30-mF質(zhì)粒。

1.4 重組病毒拯救 分別取1μg、0.5μg、0.25μg和0.1μg去內(nèi)毒素的質(zhì)粒pClone30-w t或 pClone30-FmF、pBR-NP、pBR-P、pBR-L采用 Lipofectamine 2000共轉染六孔板內(nèi)生長至70%～80%單層BHK-21細胞，具體操作步驟參照說明書進行。轉染孵育72h后將細胞反復凍融3次，1500r/m in收集上清，取100μL～200μL接種于9日齡SPF雞胚。3d～4d后，收集尿囊液，按常規(guī)方法進行血凝(HA)試驗和血凝抑制(HI)試驗。收獲HA及HI試驗結果為陽性的尿囊液，分裝后于-70℃凍存。

1.5 重組病毒的RT-PCR與序列分析 采用TRIzol試劑提取獲病毒F1代尿囊液中的總RNA。采用引物P1(5'-ATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3')和P2(5'-AATTCGGTTAGGTACAGGTTGAG-3')進 行 RTPCR鑒定。以反轉錄制備的病毒cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃ 5min；94℃1m in、54.5℃30s、72℃2m in，30個循環(huán)；72℃10min。將擴增產(chǎn)物測序驗證。

1.6 重組NDV一步生長曲線分析 將重組和野生型病毒分別按MOI為0.01接種于六孔板內(nèi)的DF-1細胞，其培養(yǎng)液為DMEM(5%胎牛血清，1μg/m L胰酶)。37℃培養(yǎng)，每間隔24h收獲上清，分別測定收獲上清的TCID50。

1.7 電鏡檢測重組病毒對自噬的影響 將重組和野生型NDV(MOI=1)分別接種HepG2細胞單層，收集培養(yǎng)4h和8h的細胞。用細胞刮刀收集細胞，吹打分散細胞，2000r/m in離心5m in收集細胞，加入2.5%戊二醛固定。將樣品進行電鏡樣品制作，透射電鏡觀察。

1.8 自噬相關蛋白LC3的western blot檢測 將重組和野生型NDV(MOI=1)分別接種HepG2細胞單層，收集培養(yǎng)4h的細胞。按照常規(guī)方法，以LC3抗體(1∶5000)為一抗，兔抗鼠IgG-HRP為二抗，對自噬相關蛋白LC3進行western blot檢測。檢測結果應用密度分析法檢測相關蛋白的表達量。

2 結 果

2.1 重組病毒的拯救 將pClone30-w t或pClone30-FmF與輔助質(zhì)粒 pBR-NP、pBR-P、pBR-L共轉染BHK-21細胞。共轉染后72h收獲細胞上清，接種于9～11日齡的SPF雞胚尿囊腔。72h后收獲雞胚尿囊液，HA和HI試驗結果均呈陽性。收獲病毒陽性尿囊液作為拯救病毒rC30-w t與rC30-FmF的F1代。取F1和F3代病毒尿囊液進行RT-PCR及序列分析結果證實重組病毒F蛋白裂解位點氨基酸序列已突變,其結果與預期相符(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 重組NDV細胞水平增殖能力檢測 將2種重組病毒按MOI為0.01感染DF-1單層細胞，每間隔24h收集樣品做TCID50檢測病毒滴度。結果顯示雖然本實驗構建的重組病毒復制有些許推延，但在病毒復制動力學和復制量上是一致的(圖1)。

2.3 電鏡檢測重組病毒對自噬的影響 分別采用rC30-w t與rC30-FmF感染HepG2細胞(MOI=10)，感染4h后，用透射電鏡進行觀察。圖2A為空白對照，細胞處于正常狀態(tài)，細胞器均勻分布在細胞中。圖2B為雷帕霉素處理組，細胞內(nèi)細胞器減少，自噬體和自噬溶酶體增加；圖2C為rC30-w t感染后細胞變化結果，細胞內(nèi)細胞器狀態(tài)相對正常，病變不明顯；圖2D為rC30-Fm F感染后細胞變化結果，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬小體及自噬溶酶體，表明病毒感染早期顯著增加HepG2細胞的自噬程度，由此證明F蛋白在NDV感染早期對自噬程度的影響具有重要作用。

2.4 重組病毒感染細胞中檢測 對rC30-w t與rC30-Fm F感染4h后細胞內(nèi)自噬標志蛋白LC3II進行western blot進行檢測。結果顯示，正常細胞LC3II表達較少；雷帕霉素給藥組，做為陽性對照，LC3II表達水平顯著增加與正常組相比差異極顯著(p<0.01)；rC30-w t與rC30-Fm F感染組細胞內(nèi)LC3II表達顯著增加，與正常組相比異極顯著(p<0.01)；rC30-Fm F感染組與rC30-w t組相比LC3II表達差異極顯著(p<0.01)。由此可以證明rC30-FmF在感染早期可以顯著增加HepG2細胞的自噬程度(圖3)。

圖1 重組病毒增殖曲線Fig.1Grow th curve of the recombinant virus

A:Mock infected cells;B:Rapamycin treated cells;C:NDV rC30-w t infected cells;D:NDV rC30-FmF infected cells Note:Autophagosomes(Black arrow);Autolysosomes(White arrow);A:Bar=2μm;B to D:Bar=1μm

3 討 論

圖3 重組NDV誘導HepG2細胞發(fā)生自噬western blot檢測Fig.3Western blot detection of autpphagy in HepG2cells induced by recombinant NDV

研究表明，副粘病毒家族成員可以誘導感染細胞發(fā)生自噬，如猿猴病毒5可以通過自噬途徑激活類漿細胞的樹突細胞[10]；同時，風疹病毒可以通過CD46介導誘導HeLa細胞發(fā)生自噬[11]。盡管自噬被認為是細胞感染病毒后細胞的一種應激防御反應，但有研究表明，自噬對一些RNA病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒[12]、登革熱病毒[13]和柯薩奇病毒[14]的感染有促進作用。最新研究表明，在NDV感染早期，Beclin-1表達量提高，即class III PI3K/Beclin-1在NDV病毒引起自噬的過程中發(fā)揮重要作用。同時，在NDV感染U251細胞后分別檢測到m TOR、AKt、p70S6K磷酸化程度均有上升，證明classIPI3K/Akt/m TOR通路在NDV感染后仍然發(fā)揮作用[7]。然而NDV病毒通過何種蛋白調(diào)控細胞發(fā)生自噬，其分子機制尚不明確。

本研究通過反向遺傳操作技術構建應用反向遺傳技術，將弱毒疫苗株LaSota裂解位點的氨基酸序列GGRQGR↓L成功突變成GRRQRR↓F。研究發(fā)現(xiàn)，在感染HepG2細胞早期，不同裂解位點的NDV可以引起不同程度的自噬，表明F蛋白存在的不同形式可能與自噬密切相關，進而影響病毒殺傷腫瘤細胞的效果。

本研究證明，NDV的F蛋白在誘導自噬發(fā)生的過程中起到重要作用。通過透射電鏡觀察細胞病變及自噬體形成，確定不同裂解能力的F蛋白在NDV感染早期可引起不同程度的自噬。通過對LC3II進行western blot檢測進一步證明改造為強毒F蛋白的裂解位點誘導自噬的程度更強。本研究為進一步明確NDV誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的機制奠定了基礎。

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