牛源犬新孢子蟲NcGRA7基因的克隆及原核表達分析

賈立軍，張守發(fā)，李男禮

(延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林延吉133002)

犬新孢子蟲(Neospora caninum)是引起多種孕畜流產(chǎn)、死胎以及新生兒運動神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的一種原蟲[1]。犬新孢子蟲終末宿主為犬，牛、馬、羊、鼠等均可以作為中間宿主[2]。犬新孢子蟲對牛的危害尤為嚴重，可以垂直傳播，帶蟲母?？梢詫⑾x體垂直傳播給新生犢牛，給畜牧業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。致密顆粒蛋白(NcGRA7)基因在犬新孢子蟲蟲泡的形成過程中起到一定作用，主要是調(diào)節(jié)帶蟲空泡(PV)，使蟲體獲得營養(yǎng)，滿足生長增殖的需要[4-5]。NcGRA7蛋白為犬新孢子蟲疫苗的候選抗原之一，而我國尚未見對該蛋白研究的報道。因此，本研究克隆牛源犬新孢子蟲NcGRA7基因，構(gòu)建NcGRA7基因原核表達質(zhì)粒，并表達重組蛋白，為犬新孢子蟲基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株與主要試劑 牛源犬新孢子蟲吉林株、牛的新孢子蟲病陽性血清和E.coli BL21菌株由延邊大學預(yù)防獸醫(yī)學實驗室分離并保存；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、Ex Taq酶、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒、辣根過氧化物酶標記抗牛IgG(HRP-LgG)均購自TaKaRa公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已發(fā)表的犬新孢子蟲NcGRA7基因序列(AF176649)設(shè)計一對引物，5'端分別引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物P1：5'-CGGAATTCGTTGTGGGTGCCAAG-3'；下游引物P2：5'-ATCCTCGAGCGCAACCGTCTTTGA-3'。

1.3 NcGRA7基因的PCR擴增 以犬新孢子蟲基因組DNA為模板，PCR擴增反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35個循環(huán)；72℃7m in。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4 NcGRA7基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，提取陽性重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒由北京英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 NcGRA7基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將pMD18-NcGRA7和pGEX-4T-1質(zhì)粒分別進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，T4DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，以含氨芐青霉素的固體LB平板挑選陽性克隆，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA進行PCR和雙酶切鑒定。

1.6 重組質(zhì)粒pGEX-NcGRA7的誘導(dǎo)表達 將陽性重組質(zhì)粒接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1%劑量接種于50m L相同LB培養(yǎng)基，200r/m in震搖培養(yǎng)至OD值為0.6左右，加入最終濃度為0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達，2h、4h、6h、8h分別取樣1.5m L。同時以誘導(dǎo)的pGEX-4T-1載體作為陰性對照。

1.7 NcGRA7基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將1.5m L誘導(dǎo)菌液4℃離心收集菌體，反復(fù)凍融3次，超聲波裂解菌體，12000r/m in離心2m in，取上清進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色觀察。

1.8 NcGRA7基因表達產(chǎn)物的western blot分析將SDS-PAGE檢測表達量最高的菌液以誘導(dǎo)pGEX-4T-1載體為對照進行SDS-PAGE電泳，以牛新孢子蟲病陽性血清為一抗、HRP-IgG為二抗進行western blot分析，檢測表達產(chǎn)物的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因的擴增 以提取的牛源犬新孢子蟲吉林株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增出大小為701bp的犬新孢子蟲NcGRA7基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖 1)。

圖1 犬新孢子蟲NcGRA7基因的PCR擴增Fig.1Identification of NcGRA7gene of N.caninum by PCR

2.2 pMD18-NcGRA7的鑒定及測序分析 提取質(zhì)粒DNA進行PCR和酶切鑒定。結(jié)果顯示，PCR擴增出大小為701bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒中含有目的基因；重組克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得2692bp和701bp的兩條目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明，克隆獲得的NcGRA7基因片段大小為701bp，編碼233個氨基酸，與GenBank中登錄的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性為98.7%。表明本實驗獲得的牛源犬新孢子蟲NcGRA7基因?qū)儆谌骆咦酉x基因。

2.3 重組質(zhì)粒的PCR與酶切鑒定 提取陽性重組表達質(zhì)粒DNA，進行PCR和酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示PCR擴增出一條約700bp的目的條帶，與預(yù)期大小相符；經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切獲得4969bp和701bp條帶，與預(yù)期片段大小相符。

2.4 NcGRA7基因表達產(chǎn)物的western blot分析將含有pGEX-NcGRA7的E.coli BL21(DE3)在37℃培養(yǎng)后，加入IPTG誘導(dǎo)表達，于不同時間取樣進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在約52ku處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白大小一致，誘導(dǎo)6h表達量達到峰值，而未誘導(dǎo)的重組菌對照組未見該條帶(圖2A)。采用牛新孢子蟲病陽性血清對表達蛋白進行western blot鑒定，結(jié)果在52ku處出現(xiàn)特異條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌則無該條帶(圖2B)，表明重組質(zhì)粒在E.coli中獲得表達，表達蛋白被牛新孢子蟲病陽性血清識別，具有較好的反應(yīng)原性。

圖2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE(A)及western blot(B)鑒定Fig.2SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of expressed protein

國內(nèi)外對犬新孢子蟲蛋白的研究多集中在表面蛋白，而對NcGRA7基因的研究報道甚少，Jenkins等將犬新孢子蟲NcGRA7基因表達后進行動物免疫試驗[6]；Zhang等從基因文庫中篩選出NcGRA7基因，并對其進行應(yīng)用研究[7]；Nishikawa等將脂質(zhì)體包埋NcGRA7基因免疫小鼠，并觀察其免疫效果[8]。而國內(nèi)尚未見對犬新孢子蟲NcGRA7基因的研究報道。本實驗對犬新孢子蟲NcGRA7基因進行克隆表達，表達蛋白為52ku，具有較好的反應(yīng)原性，為犬新孢子蟲NcGRA7基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Dubey J P,Carpenter J L,Speer C A,et al.New ly recognized falal protozoan disease of dogs[J].JAm Vet Med Assoc,1988,192(9):1269-1285.

[2]Lindsay D S,Dubey J P.Immunohistochemical diagnosis of Neospora caninum in tissue sections[J].Am J Vet Res,1989,50(11):1981-1983.

[3]丁德，賈立軍，田萬年，等.吉林株犬新孢子蟲的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)學報，2009，29(4)：423-425.

[4]Dubremetz J F,Achbarou A,Bermudes D,et al.Kinetics and pattern of organelle exocytosis during Toxoplasma gondii host-cell interaction[J].Parasitol Res,1993,79:401-408.

[5]Cesbron-Delauw M F.Dense granμle organelles of Toxoplasma gondii:their role in the host-parasite relationship[J].Parasitol Today,1994,10:293-296.

[6]Jenkins M,Parker C,Tuo W,et al.Inclusion of CpG adjuvant with plasmid DNA coding for NcGRA7improves protection against congenital neosporosis[J].Infection Immuniy,2004,72,1817-1819.

[7]Zhang H S,Huang P L,Liao M.et al.Dense-granule protein NcGRA7,a new marker for the serodiagnosis of Neospora caninum infection in aborting cows[J].Molecular Clinical Vaccine Immunol,2007,14(12):1640-1643.

[8]Nishikawa Y,Zhang H S,Ikehara Y,et al.Immunization with oligomannose-coated liposome-entrapped dense granule protein 7protects dams and offspring from Neospora caninum infection in mice molecular[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(6):792-797.