馬A3Z3V1抑制馬傳染性貧血病毒早晚期反轉(zhuǎn)錄的鑒定

吳星亮，張澤力,2，尹 鑫,3，艾有為,2，戈 曼,3，王曉鈞*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001)

APOBEC3(A3)家族是細胞內(nèi)的一種胞嘧啶脫氨酶，在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞中，A3分子表達并被包裹進子代病毒中，在第二輪感染過程中，A3通過胞嘧啶脫氨酶活性將負鏈DNA中的C突變?yōu)閁，在前病毒DNA中形成超級突變，阻斷病毒的復(fù)制[1]。

已知馬體細胞內(nèi)至少存在5種APOBEC3類似的蛋白，這些蛋白具有不同的剪接形式，某些成員在體外實驗研究中被證明可以抑制EIAV的復(fù)制，引起EIAV基因組的超級突變，導(dǎo)致病毒喪失感染能力[2]。目前，對馬APOBEC3限制EIAV的機制尚不明確。為此，本實驗建立了檢測EIAV早晚期反轉(zhuǎn)錄的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR(qPCR)方法[3-7]，并且應(yīng)用該方法評價了一種馬APOBEC3分子A3Z3V1在EIAV的逆轉(zhuǎn)錄過程中的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒及感染性克隆 pcDNA-actin、pcDNA-2HA與pcDNA-A3Z3V1均為本實驗室構(gòu)建；EIAV強毒感染性克隆pLG-UK3為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 熒光定量試劑盒(PlatinumRSYBRRGreen qPCR SuperM ix-UDG)購自上海英俊生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche；Tissue DNA Kit購自O(shè)MEGA；限制性內(nèi)切酶DpnⅠ購自NEB。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照UK3基因序列(AF016316)，β-actin 基因序 列(NM_001081838.1)設(shè)計并合成3對引物(表1)，其中，檢測早期反轉(zhuǎn)錄引物為UK3.R/U5.F和UK3.R/U5.R；晚期反轉(zhuǎn)錄引物為 Late.gag.F和Late.gag.R；內(nèi)參基因 β-actin的引物為q.actin.F和q.actin.R，引物由上海英俊生物有限公司合成(圖1)。

表1 引物序列Table 1Primer sequences

1.4 標準品制備、標準曲線繪制及相對熒光定量方法的建立 測定質(zhì)粒濃度，按照公式：拷貝/m L=6.02×1023×DNA 濃度(g/m L)/MW(g/moL)(其中MW=雙鏈DNA長度×660)，換算成DNA拷貝數(shù)。取1μL重組質(zhì)粒標準品依次做10倍稀釋，選取102～1087個稀釋度的重組質(zhì)粒為模板，進行熒光定量PCR，并繪制標準曲線。采用相對熒光定量方法-2-ΔΔCt法進行目的基因相對表達量的計算。

圖1 EIAV早晚期反轉(zhuǎn)錄引物擴增位置示意圖Fig.1The sequence amplified by EIAV early and late qPCR

1.5 病毒拯救 本實驗采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將pLG-UK3(18μg)與 pcDNA-A3Z3V1(2μg)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，48h后收集病毒上清作為實驗組；同時，用pLG-UK3(18μg)與質(zhì)粒pcDNA-2HA(2μg)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48h后收集上清溶液作為對照組。

1.6 病毒感染試驗及病毒DNA的提取 收集轉(zhuǎn)染細胞上清溶液，13000r/m in 5m in，取上清溶液按照說明書操作步驟，測定上清中病毒的RT值。同時，用DNase 37℃消化上清溶液2h，去除殘留重組質(zhì)粒。采用等量RT值的病毒分別感染驢皮細胞(FDD)，分別于2h、6h和18h收集感染細胞。

1.7 A3Z3V1對EIAV抑制作用的檢測 將提取的細胞DNA使用DpnⅠ酶于37℃消化1h，進一步去除殘存的重組質(zhì)粒。利用已建立的qPCR方法-2-ΔΔCt法檢測樣品。

2 結(jié) 果

2.1 qPCR標準曲線的建立 以重組質(zhì)粒作為標準品，根據(jù)OD260nm值計算其拷貝數(shù)，其中：β-actin為1×1010拷貝 /μL，UK3為 5.7×1010拷貝 /μL，將標準品做10倍梯度稀釋，取其中7個梯度，堿基含量分別為：1×102～1×108拷貝 /μL，5.7×102～5.7×108拷貝/μL作為繪制標準曲線的模板。

采用已優(yōu)化條件，分別以稀釋的標準品為模板進行 qPCR檢測。擴增后繪制標準曲線(圖 2)，β-actin與UK3標準品標準曲線的斜率之差小于0.1，而且均在100%左右(表2)。因此，在實驗中病毒早晚期RT產(chǎn)物DNA相對拷貝數(shù)為：2Ct(R)-Ct(V)(R表示β-actin，V 表示 virus)。

圖3 EIAV早晚期反轉(zhuǎn)錄本的相對量Fig.3Relative amount of EIAV early and late reverse transcripts

圖2 熒光定量PCR的標準曲線Fig.2Standard curves of the qPCR

表2 標準曲線的相關(guān)參數(shù)Table 2Relative parameters of standard curve

2.2 拯救病毒RT值的測定 用RT試劑盒檢測本實驗中兩種病毒的RT值，其中，實驗組為1.0±0.05，對照組為 1.5±0.07。

2.3 qPCR檢測A3Z3V1的功能試驗 采用已建立的qPCR方法檢測拯救EIAV在2h、6h和18h的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，結(jié)果顯示，在早期反轉(zhuǎn)錄過程中，A3Z3V1使EIAV的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別減少了4倍，7倍和1倍；在晚期反轉(zhuǎn)錄過程中，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別減少了3倍，2倍和1倍。結(jié)果表明A3Z3V1對EIAV的早晚期反轉(zhuǎn)錄過程均有抑制作用，并且對早期反轉(zhuǎn)錄的抑制作用更為明顯(圖3)。

3 討 論

本實驗采用相對qPCR方法，利用內(nèi)參基因校正目的基因，從而能更加準確的反應(yīng)A3Z3V1對EIAV反轉(zhuǎn)錄的影響。2-ΔΔCt法優(yōu)化體系建好之后，在以后的每次試驗中無需再對目的基因和內(nèi)參基因做標準曲線，只需對待測樣品進行qPCR檢測即可，因此這也要求在建立2-ΔΔCt法之前，對目的基因和內(nèi)參基因作標準曲線，并通過優(yōu)化條件使得兩者的擴增效率均接近100%，標準曲線斜率之差小于0.1。

本實驗證明馬A3Z3V1對EIAV的早晚期逆轉(zhuǎn)錄過程具有抑制作用，但是其具體機理還不清楚。目前，存在兩種比較流行的理論，一種是胞嘧啶脫氨酶依賴性的，另一種是胞嘧啶脫氨酶非依賴性的[8-9]。本實驗結(jié)果無法在這兩種理論中做出選擇，本方法只能用于鑒定免疫因子是否是通過其對逆轉(zhuǎn)錄過程的抑制而抑制病毒的復(fù)制。另外，在整個逆轉(zhuǎn)錄過程中，前病毒DNA水平在6h左右時含量最高，在18h后前病毒DNA水平明顯降低。因此，這是否意味著在宿主細胞中還存在其它的免疫因子，它能夠在病毒感染之后，受不斷積累的病毒核酸的誘導(dǎo)將病毒核酸降解，這還有待進一步研究。

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