鯉春病毒血癥病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT—LAMP）檢測方法的建立

吳業(yè)穎+張國彬

摘 要：根據(jù)鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）核蛋白N編碼基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，以病毒全基因組RNA為模板，通過對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了SVCV的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測方法。結(jié)果表明，本方法可在64℃下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸區(qū)段的大量擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶，反應(yīng)體系中添加SYBR Green I熒光染料后，綠色陽性結(jié)果明顯區(qū)別于橙色陰性結(jié)果。該檢測體系具有極高的特異性，只能檢測到目標(biāo)病毒，與草魚呼腸孤病毒（GCRV）和斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒（CCRV）無交叉反應(yīng)，其靈敏度比RT-PCR高100倍。本研究建立的檢測方法靈敏度及特異性高，且不需要昂貴儀器設(shè)備，為快速檢測鯉春病毒血癥病毒與診斷鯉春病毒血癥提供了簡捷快速的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：鯉春病毒血癥病毒；逆轉(zhuǎn)錄；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測

中圖分類號(hào)：S941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp，SVC）是一種在鯉科魚類中發(fā)生的出血性、高傳染性病毒病，能感染四大家魚和其他幾種鯉科魚類，經(jīng)常在鯉科魚類特別是鯉、錦鯉中流行，并導(dǎo)致患病魚大量死亡，危害嚴(yán)重。該病的病原菌為鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV），又名鯉魚彈狀病毒（Rhabdovirus carpio），屬于彈狀病毒科水泡性口炎病毒屬成員。歷史上，該病主要流行于歐洲、中東地區(qū)和俄國，自2002年美國和2003年中國分離到該病毒的報(bào)道以來，引起了研究者及水產(chǎn)養(yǎng)殖者的廣泛關(guān)注。由于該病發(fā)病快、危害大，因此快速、特異、敏感、簡便的檢測SVCV對(duì)鯉春病毒血癥防控具有重要的意義。

目前國內(nèi)外學(xué)者已建立了多種檢測SVCV的方法，其中中和試驗(yàn)、免疫熒光（IF）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等免疫學(xué)方法的特異性有待提高，而RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)方法雖然特異性強(qiáng)，靈敏度高，但由于需要PCR儀等貴重儀器而不適于其在基層的廣泛應(yīng)用。

2000年Notomi等首次提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-ediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，該技術(shù)主要針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴(kuò)增功能的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，不需要模板的熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）是在常規(guī)LAMP反應(yīng)體系中加逆轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)了RNA模板的一步擴(kuò)增。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)、人類醫(yī)學(xué)及食品衛(wèi)生等領(lǐng)域，并逐漸成為水產(chǎn)動(dòng)物病原的主要檢測方法之一。

本文針對(duì)SVCV含量最豐富的病毒粒子蛋白-核蛋白N，建立了鯉魚春季病毒血癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，并對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為基層實(shí)驗(yàn)檢測鯉魚春季病毒血癥病毒提供無需特殊儀器，更為簡單、便捷、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超速離心機(jī)（Beckman）；分光光度計(jì)（Eppendorf）；PCR擴(kuò)增儀（Biometra）；電泳儀；凝膠成像儀（Bio-Rad）；Bst DNA聚合酶（New England）；Betaine（Sigma）；Trizol Reagent、RNA酶抑制劑、SYBR Green I（Invitrogen）；dNTP、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Bio basic inc.）。

1.2 細(xì)胞與病毒

草魚腎臟組織細(xì)胞系（CIK）、斑點(diǎn)叉尾鮰腎組織細(xì)胞系（CCK）、草魚呼腸孤病毒GCRV-104株、斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒730株（CCRV）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）來自長江水產(chǎn)研究所。GCRV在CIK細(xì)胞上增殖培養(yǎng)，CCRV在CCK細(xì)胞上增殖培養(yǎng)， SVCV在EPC細(xì)胞上增殖培養(yǎng)。

1.3 RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank公布的SVCV毒株的N基因序列（U18101），應(yīng)用PrimerExplorer V4（http：// primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html）在線軟件設(shè)計(jì)1組RT-Lamp引物，委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（見表1）。1.4 病毒RNA提取

待SVCV感染的EPC細(xì)胞、CCRV感染的CCK細(xì)胞、GCRV感染的CIK細(xì)胞出現(xiàn)90%病變后收獲，同時(shí)收獲正常的EPC細(xì)胞對(duì)照，于-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，5000r/min，4℃離心30 min，取沉淀，經(jīng)Trizol試劑裂解后，采用氯仿、異丙醇抽提病毒RNA，分光光度計(jì)（Eppendorf biophotometer）測定RNA濃度。

1.5 SVCV陽性模板的確認(rèn)

將上述RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測，確認(rèn)制備的檢測模板呈SVCV陽性后，進(jìn)行RT-LAMP檢測方法的建立。

1.6 RT-LAMP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

采用25μl反應(yīng)體系，包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，DTT4mM，MgCl2，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer混勻后于不同溫度（60、61、62、63、64、65℃）溫育60 min，80℃滅活2min。確定最佳溫育溫度后，再優(yōu)化反應(yīng)體系中MgCl2濃度（0、2、4、6、8mM）。

1.7 RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，150V電泳25min后，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.8 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

檢測GCRV-104株感染CIK細(xì)胞后的總RNA、SVCV感染EPC細(xì)胞后的總RNA、CCRV感染CCK細(xì)胞后的總RNA，同時(shí)設(shè)立無模板的空白對(duì)照和正常EPC細(xì)胞的總RNA陰性對(duì)照。

1.9 RT-LAMP的靈敏度試驗(yàn)

將提取的SVCV總RNA測其濃度，按10倍梯度稀釋該RNA作為模板，采用優(yōu)化好的RT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)展，同時(shí)以RT-PCR方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 SVCV的RT-LAMP檢測方法條件優(yōu)化

經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系如下：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs 1mM，Betaine 0.5M，DTT 4mM，MgCl2 6mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，模板RNA 5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer。反應(yīng)管于64℃溫育1h后，80℃滅活2分鐘。

2.2 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP（見圖3）方法進(jìn)行檢測，只有SVCV出現(xiàn)典型的梯形擴(kuò)增條帶，而對(duì)照GCRV-104、CCRV和EPC均無擴(kuò)增條帶，說明設(shè)計(jì)的RT-LAMP引物具有良好的特異性。

2.3 RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測

將10倍系列稀釋的模板分別進(jìn)行RT-LAMP、RT-PCR檢測，結(jié)果顯示至少能夠檢測到10-5稀釋度的模板RNA（圖4），而RT-PCR只能檢測到10-3稀釋度的模板RNA（圖5），說明RT-LAMP檢測具有很高的靈敏度。

3 討論

SVCV主要由核蛋白（N）、聚合酶（L）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）和糖蛋白（G）組成。其中核蛋白N是含量最豐富的病毒粒子蛋白，它與病毒RNA 相互作用形成核衣殼的雙螺旋結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Shivappa等和Liu等分別針對(duì)SVCV的G基因和M基因建立了病毒的LAMP檢測方法。本研究針對(duì)SVCV N蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，為SVCV的檢測提供新的靶基因。

本研究建立了1種對(duì)SVCV的LAMP快速檢測方法。根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，合適的引物對(duì)LAMP反應(yīng)的成功至關(guān)重要，特異性的區(qū)域保證了反應(yīng)的特異性，引物的正確結(jié)構(gòu)保證了莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的形成和延伸。通過對(duì)反應(yīng)溫度和鎂離子濃度兩個(gè)重要參數(shù)的優(yōu)化，提高了反應(yīng)靈敏度。本研究建立的反應(yīng)體系在64℃恒溫保持1h即可完成擴(kuò)增，不需要昂貴的PCR儀，且反應(yīng)時(shí)間比普通RT-PCR節(jié)省2～3h。反應(yīng)后加入熒光染料SYBR Green I即可肉眼觀察結(jié)果，檢測靈敏度是RT-PCR方法的100倍。而且與GCRV-104、CCRV等病毒都沒有交叉反應(yīng)，表明設(shè)計(jì)的引物特異性好，能夠滿足檢測需求。該方法簡便快速、靈敏特異，可應(yīng)用于鯉春病毒血癥的現(xiàn)場應(yīng)急診斷與檢測，可為鯉春病毒血癥的有效防控提供有力的技術(shù)支撐。

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（本文審稿 戴定蘭）