ELISA驗(yàn)證兔鐵蛋白重鏈與RHDV VP60相互作用

孫宏勇，劉家森，王澤祥，陳淑慧，單麗玲，郭冬春，姜 騫，林 歡，曲連東

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室，黑龍江哈爾濱150001)

兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)可以引起兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病，即兔病毒性出血癥。衣殼蛋白VP60是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染的過程中起重要作用[1]。鐵蛋白(Ferritin)是由重鏈和輕鏈構(gòu)成，鐵蛋白重鏈(FTH)的表達(dá)水平與癌癥存在一定的關(guān)系，1993年研究表明一種腺病毒致癌基因(E1A致癌基因)可以抑制FTH mRNA及蛋白[2]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過SMART技術(shù)構(gòu)建兔肝臟細(xì)胞的真核表達(dá)cDNA重組質(zhì)粒文庫，篩選與VP60相互作用的蛋白，F(xiàn)TH是與VP60相互作用的候選蛋白之一[3]。本實(shí)驗(yàn)以VP60作為包被抗原采用ELISA方法進(jìn)一步驗(yàn)證FTH與RHDV VP60的相互作用。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)pLysS、pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)保存；pGEX-VP60由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；pMD18-T購自TaKaRa公司；3月齡新西蘭大白兔由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 酶及主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶以及連接酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；抗His標(biāo)簽單克隆抗體(MAb)購自Abmart公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(IgG-HRP)購自 Sigma公司；TRIzol及ProBondTMResin購自Invitrogen公司；Glutathione Sepharose 4B購自GE公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 FTH基因PCR引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中家兔FTH基因序列(M 63912.1)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增FTH基因。上游引物：5'-CGGAATTCATGATCAACCGCC AGATCAA-3'(EcoRⅠ)，下游引物：5'-CCGCTCG AGTTAGCTCTCGTTATCAC-3'(XhoⅠ)。引物由博仕生物有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參照TRIzol試劑說明書提取兔肝臟總RNA。采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增FTH基因并克隆至pMD18-T中，重組質(zhì)粒由華大基因公司進(jìn)行測序。并將FTH基因亞克隆至pET-32a(+)表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-FTH。

1.5 重組蛋白表達(dá) 將構(gòu)建的pET32a-FTH、pGEX-VP60、空質(zhì)粒pGEX-6p-1分別轉(zhuǎn)化于BL21(DE3)pLysS，37℃振蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。裂解誘導(dǎo)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白純化 參照ProBandTM蛋白純化說明書純化rFTH蛋白；參照GST fusion systerm蛋白純化說明書純化GST-VP60、GST標(biāo)簽蛋白，純化的rFTH、GST-VP60、GST蛋白采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.7 蛋白相互作用驗(yàn)證 采用50mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋 GST-VP60、GST蛋白。實(shí)驗(yàn)組：每孔包被40μg GST-VP60蛋白；對(duì)照組：每孔包被40μg GST蛋白，置于4℃過夜，PBS洗滌3次。以10g/L BSA于37℃封閉1h。將50μg rFTH蛋白1∶2倍比稀釋8個(gè)稀釋度，分別加入到試驗(yàn)組及對(duì)照組，室溫孵育1h。以His MAb(1∶5000)為一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1∶5000)為二抗，室溫孵育1h。通過TMB顯色，酶標(biāo)光度計(jì)測定OD490nm值。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析及表達(dá)載體的鑒定 以提取的兔肝臟總RNA制備的cDNA為模板，采用特異性引物PCR擴(kuò)增FTH基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示其片段大小約為500bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。經(jīng)Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切及測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒正確。

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：FTH PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照M:DL2000DNA Marker;1:PCR product of FTH gene;2:Negative control

2.2 FTH、GST-VP60、GST誘導(dǎo)表達(dá)純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pET32a-FTH、pGEX-VP60、pGEX-6p-1轉(zhuǎn)化于BL21(DE3)plysS，rFTH、VP60分子量分別約為39ku、86ku(圖2)，與理論上帶標(biāo)簽的重組蛋白的分子量相符，pGEX-6p-1經(jīng)轉(zhuǎn)化后表達(dá)GST標(biāo)簽蛋白約26ku。

2.3 蛋白相互作用驗(yàn)證 以40μg GST-VP60及GST包被酶標(biāo)板，將rFTH以1∶2比例倍比稀釋，進(jìn)行ELISA檢測。GST-VP60試驗(yàn)組OD490nm值為：1.936、1.691、1.584、1.327、1.09、0.978、 0.804、0.73；GST 對(duì)照 組 OD490nm：0.716、0.709、0.698、0.722、0.714、0.701、0.686、0.72。試驗(yàn)組 OD490nm值結(jié)果表明：OD490nm值與rFTH蛋白濃度呈正相關(guān)，表明GST-VP60與FTH相互結(jié)合；對(duì)照組OD490nm值結(jié)果表明：OD490nm值變化與FTH蛋白濃度無關(guān)，表明GST蛋白與FTH沒有相互作用(圖3)。因此，可以推斷VP60與FTH具有直接相互作用的關(guān)系。

圖3 ELISA驗(yàn)證FTH與VP60的相互作用Fig.3The interaction between FTH and VP60by ELISA

由于缺乏適合培養(yǎng)RHDV的細(xì)胞系，嚴(yán)重阻礙了對(duì)RHDV致病機(jī)理及宿主抗RHDV機(jī)制的研究。肝細(xì)胞是RHDV的主要靶細(xì)胞，肝細(xì)胞表面存在RHDV的受體。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選肝細(xì)胞中與VP60相互作用的蛋白，F(xiàn)TH是候選蛋白之一。FTH是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，協(xié)助鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。2002年，Gurerrero采用ELISA的方法體外驗(yàn)證輪狀病毒直接結(jié)合熱休克蛋白[4]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法體外驗(yàn)證VP60與鐵蛋白重鏈相互作用。FTH可能在RHDV感染細(xì)胞過程中起到共受體的作用。因?yàn)橛醒芯勘砻麒F蛋白輕鏈與鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原1是乙肝病毒的共受體[5]。因此，F(xiàn)TH重鏈在RHDV感染肝細(xì)胞過程中起到的具體作用需要進(jìn)一步研究。

[1]Meulenberg J JM,Van N A P,Van E Z A,et al.Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies[J].Virology,1998,252(9):106-114.

[2]Tsuji Y,Kwak E,Saika T,et al.Preferential repression of the H subunit of ferritin by adenovirus E1A in NIH-3T3mouse fibroblasts[J].JBiol Chem,1993,268:7270-7275.

[3]穆亞芳，劉家森，郭東春，等.兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60與兔肝臟細(xì)胞中相互作用蛋白的初步篩選[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(05)：354-357.

[4]Carlos A G,Daniela B,Selene Z,et al.Heat shock cognate protein 70is involved in Rotavirus cell entry[J].JVirol,2002,76(8):4096-4102.

[5]Hao Zhao-jing,Zheng Li,Lan K,et al.Ferritin light chain and squamous cell carcinoma antigen 1are coreceptors for cellular attachment and entry of hepatitis B virus[J].Int J Nanomedicine,2012,7:827-834.