一種新型的利用DSS交聯(lián)劑避免重鏈輕鏈干擾的免疫沉淀技術(shù)

張婉+陳健+陳恒玲

摘 要 抗體是含有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，其中兩條較長的相對分子量較大的為重鏈，大小為55KDa，另外兩條較短的相對分子量較小的為輕鏈，大小25KDa。在免疫沉淀技術(shù)中如果目的條帶大小和重鏈輕鏈的大小一樣或接近將影響實驗結(jié)果的判斷。本文章通過DSS 使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯(lián)，即使高溫或還原劑作用下也不會破壞交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，而高溫或還原劑可以使抗體和抗原分開，從而達(dá)到SDS-PAGE 檢測到的條帶都是蛋白條帶而沒有重鏈輕鏈條帶的干擾的目的。

關(guān)鍵詞 DSS 重鏈 輕鏈 免疫沉淀

當(dāng)抗原或抗原類似物侵入機體將誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞尤其是漿細(xì)胞，分泌免疫球蛋白即抗體。本實驗用的是實驗室自制的多克隆抗體以及純化蛋白，并且把蛋白用針劑注射至兔子身體內(nèi)部，兔子在出現(xiàn)免疫之后會產(chǎn)生抗體。抗體的結(jié)構(gòu)決定了抗體能夠與抗原的特異性相結(jié)合。通過觀察可以看出，抗體的結(jié)構(gòu)圖形與“Y”字母相似，分子量大小為150KDa，重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)是由抗體在高溫或還原劑作用下分解而來，在兩條比較長的相對分子量中較大的是重鏈即H鏈，其分子量的具體大小是55KDa，而兩條相對較短的中較小是輕鏈即L鏈，其分子量的具體大小是25KDa，“Y”兩個分支的頂端含抗原的特異性結(jié)合位點，由重鏈和輕鏈共同決定?？贵w具有較強而穩(wěn)定的氨基酸結(jié)構(gòu)，能夠特異結(jié)合到抗原上，被應(yīng)用到免疫沉淀，免疫熒光，免疫組化等免疫學(xué)實驗技術(shù)中。

進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)亦或是蛋白質(zhì)同遺傳物質(zhì)之間互補作用的方法之一就是免疫沉淀?？贵w具有能夠同抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的特點，靈敏度高等優(yōu)點，達(dá)到確定蛋白質(zhì)機在體內(nèi)的完整生理特性的效果。抗體通過捕獲抗原達(dá)到富集，純化，目的蛋白或和目的蛋白相互作用的蛋白的目的。但傳統(tǒng)的實驗中如果目的蛋白與抗體的重鏈輕鏈的大小一致或接近時，將會影響實驗者對結(jié)果的判斷。因為傳統(tǒng)的實驗中，抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物在高溫或還原劑作用下分裂為抗原-抗體復(fù)合物和蛋白A/G磁珠，所以在后續(xù)的SDS-PAGE檢測中的上樣液含有抗體，結(jié)果中會出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈有可能遮蔽目的蛋白條帶，影響實驗者對結(jié)果的判斷。本實驗中使用DSS交聯(lián)劑使抗體和蛋白A/G磁珠緊密交聯(lián)，在高溫或還原劑作用下抗原-抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物分裂為抗原和抗體-蛋白A/G磁珠復(fù)合物，在后續(xù)的SDS-PAGE檢測中的上樣液將不含有抗體，凝膠結(jié)果中避免了抗體的重鏈和輕鏈的干擾，有利于實驗者對實驗結(jié)果進(jìn)行精確分析。

1 實驗材料

1.1 主要儀器和試劑

DSS（Thermo scientific），抗體（實驗室自制），蛋白A/G磁珠（Roche），NP-40蛋白裂解液（Biosharp），苯甲基磺酰（PMSF）， SDS-PAGE凝膠試劑盒（博士德生物），4度超高速離心機（Thermo scientific），垂直混合儀（其林貝爾儀器公司），bio-rad蛋白電泳儀

1.2 動物材料

成熟昆明白小鼠（雄性）。

2 實驗方法

2.1 提總蛋白

實驗之前充分準(zhǔn)備好各種實驗用品，包括手術(shù)器械、5ml玻璃軍均漿器、1.5mlEP管、1ml槍頭、200ul槍頭、10ul槍頭實行高壓滅菌，同時放在烘箱里面?zhèn)溆谩?度離心機預(yù)冷，勻漿器放入冰盒中冰鎮(zhèn)，配蛋白裂解液（用120mM氯化鈉溶液配0.5%NP-40），1ml蛋白裂解液中加10ul，0.1mM的苯甲基磺酰，混勻，放入冰盒中。斷髓法處死小鼠，取小鼠睪丸組織100mg，稱量時用吸水紙盡量吸干組織表面的水分，之后轉(zhuǎn)存在冰鎮(zhèn)的里面，同時放入具有的蛋白裂解液來進(jìn)行均漿，所有的操作過程都在冰上進(jìn)行，把均漿全部轉(zhuǎn)移至管中1.5mlEP、4度、1000*g，離心10min。同時把清至轉(zhuǎn)移到新型的EP管里面，放在冰塊上面?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蛋白A/G磁珠與抗體結(jié)合

準(zhǔn)備實驗試劑，配置溶液Ⅰ （0.01M中性磷酸鹽溶液）。對蛋白A/G進(jìn)行震蕩，使得磁珠能夠完全混到液體內(nèi)部，便于液體的吸取，并且吸取混勻的50ul液體至1.5mlEP里。1000*g、4度、離心1min，去除上清。使用200ul溶液進(jìn)行磁珠的清洗，1000*g、4度、離心1min，之后進(jìn)行磁珠兩次的重復(fù)清洗振蕩蛋白A/G磁珠瓶子，使磁珠充分混勻到。去除上清，往EP管內(nèi)加入90ul溶液Ⅰ 和10ul一抗溶液。將EP管固定在垂直混合儀上，以合適的轉(zhuǎn)速使溶液混勻，在室溫狀態(tài)下孵育一個小時。在孵育之后，1000*g、4度、離心1min。棄去上清，EP管內(nèi)加入200ul溶液Ⅰ清洗磁珠，此時抗體已和磁珠結(jié)合，1000*g、4度、離心1min。再次對磁珠進(jìn)行兩次的清洗。

2.3 DSS交聯(lián)蛋白A/G磁珠和抗體

準(zhǔn)備實驗試劑，配置2.5mM的DSS溶液，溶液Ⅱ0.1M，ph2.0。除去上述EP管內(nèi)的上清，加入32ul溶液Ⅰ和18ul 2.5mM的DSS溶液，將EP管固定在垂直混合儀上以合適的轉(zhuǎn)速使溶液混勻，是室溫狀態(tài)下孵育一個小時。在結(jié)束相關(guān)交聯(lián)之后，1000*g、4度、離心1min。棄去上清，用50ul溶液清洗珠子，1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進(jìn)行兩次清洗。除去上清，運用蛋白解液進(jìn)行磁珠的清洗，1000*g、4度、離心1min。在結(jié)束清洗之后，除去上清，EP管放在冰上備用。

2.4 蛋白和一抗孵育

將2.1中提取的蛋白即上清加入到含有已經(jīng)交聯(lián)一抗的蛋白A/G磁珠的EP管中即2.3的EP管中。將EP管固定于垂直混合儀上，以合適的速度旋轉(zhuǎn)，4度，過夜。

2.5 10%SDS-PAG凝膠檢測

實驗之前充分準(zhǔn)備好實驗過程中需要的試劑，并進(jìn)行電泳液的配置，tris-base 3.03g、18.77g氨基酸、1g sds，在充分溶解之后，使用蒸餾水對其。同時進(jìn)行配置，0.25g的（R250）、50ml甲醇50ml，10ml的冰醋酸，在完全溶解之后，使用蒸餾水進(jìn)行定容達(dá)到100ml。配置10%分離膠，蒸餾水2.7毫升，30%丙烯酰胺（29：1）3.3毫升，3.8ml的1MTris-hcl PH8.8、100微升的濃度為10%的SDS ，以及100微升的濃度為10%的過硫酸銨，在混勻之后添加4微升的TMEMD ，混勻，灌入已測漏的垂直玻璃板內(nèi)，用蒸餾水液封。室溫聚合30分鐘。把上面運用在液封方面的蒸餾水倒去。同時配置濃度為5%的濃縮膠、2.7ml的、0.67ml濃度為30%的丙烯酰胺，0.5ml的1Mtris-hclPH6.8、40微升濃度為10%的SDS，在與40微升的濃度為10%的過硫酸銨攪勻之后，加入TMEMD 4微升，混勻，灌入垂直玻璃板內(nèi)，在整個玻璃板被灌滿直至溢出的時候插入數(shù)字，室溫狀態(tài)下聚合半小時。

將上述樣品即2.4中蛋白抗體蛋白A/G磁珠復(fù)合物進(jìn)行離心，1000*g、4度、離心1min。去上清液，加入200ul的蛋白裂解液往EP管中清洗磁珠，所進(jìn)行的離心條件是1000*g、4度、離心1min。之后對磁珠進(jìn)行兩次的重復(fù)清洗。去除上清，加入40ul溶液Ⅱ洗脫抗原，在室溫保持五分鐘。1000*g、4度、離心1min，收集上清，加入20ul溶液Ⅱ洗脫抗原，室溫5分鐘。將收集的洗脫液12000*g 4度 離心10min。將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)（盡量不要吸到珠子）。往60ul洗脫液中加入15ul的5*loading buffer，混勻備用，往含有40ul磁珠的EP管中加入10ul的5*loading buffer混勻備用。將兩個EP管在沸水中煮8分鐘。含洗脫液的EP管12000*g，4度，離心2分鐘，收集上清備用。

把放電泳槽內(nèi)部，同時倒進(jìn)去電泳液，輕輕拔下梳子，進(jìn)行點樣，點樣順序marker，煮沸的洗脫液即蛋白液，蛋白A/G磁珠。電泳條件，30v，60分鐘后電壓調(diào)至80v，保持2.5個小時。在結(jié)束電泳之后，把凝膠取出并放在玻璃皿里面，并把其倒入溶液里面進(jìn)行染色，將玻璃皿轉(zhuǎn)移到搖床上，合適的轉(zhuǎn)速染色，時間40分鐘。在染色之后把染色液收回，運用凝膠脫色：將凝膠放在打的玻璃器皿中并加入自來水，之后放進(jìn)微波爐里進(jìn)行高溫加熱，七分鐘之后換水，再次依據(jù)上面的條件進(jìn)行脫色，直到凝膠上面出現(xiàn)清晰的條帶。在結(jié)束脫色之后，對其進(jìn)行拍照，實現(xiàn)實驗結(jié)果的保存（圖1）。切下的目的條帶可以進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜鑒定。

從圖1中可以看出抗體的重鏈輕鏈出現(xiàn)在蛋白A/G磁珠泳道，蛋白A/G磁珠和抗體在DSS作用下緊密交聯(lián)，蛋白液泳道是沒有重鏈和輕鏈的，說明DSS交聯(lián)劑成功避免了重鏈輕鏈對目的蛋白條帶的干擾。

3 結(jié)果與討論

從實驗結(jié)果中看出，抗體的重鏈和輕鏈出現(xiàn)在蛋白A/G磁珠泳道中而未出現(xiàn)在抗原液泳道中，說明DSS交聯(lián)劑可以有效避免抗體的重鏈輕鏈對實驗結(jié)果的干擾。免疫沉淀是以抗體與抗原特意性結(jié)合為基礎(chǔ)研究蛋白相互作用的經(jīng)典方法。研究蛋白質(zhì)間的相互作用對解釋疾病的機制如腫瘤異質(zhì)性和藥物的研發(fā)如抗體藥具有重要意義。DSS交聯(lián)的免疫沉淀方法能夠避免重鏈輕鏈干擾，希望能為科研學(xué)者提供一個新思路。綜上所述，本實驗的優(yōu)點可以分為以下三點：DSS交聯(lián)劑能夠成功避免免疫沉淀中抗體的重鏈輕鏈對實驗結(jié)果的干擾；DSS交聯(lián)劑與其他方功法如使用試劑盒（pierce）相比較，樣品可以進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，為開展功能試驗打下基礎(chǔ)；DSS交聯(lián)劑溶液配置方便，使用簡單，與使用實驗盒相比較極大地降低了實驗成本。

*通訊作者：陳恒玲

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