雙酶
- 雞IL-2和IL-4融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性
和真核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切、回收與鑒定 按QuickCutEcoR I和QuickCutKpnI說明書，將pUC57-ChIL-4重組質(zhì)粒和pCI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收pCI(約4 000 bp) 和ChIL-4的目的條帶；同樣方法雙酶切與鑒定pUC57-ChIL-2和pCI，膠回收pCI與ChIL-2的目的條帶。1.3.3 連接與轉(zhuǎn)化 按DNA Ligation Kit說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，雙酶切后的pCI分別與IL-4和IL-2片段按摩爾比3∶1
中國獸醫(yī)雜志 2022年4期2022-07-07
- 山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)
dⅢ和EcoRⅠ雙酶切并進(jìn)行膠回收，回收純化后的IL-2基因與pVAX1載體利用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化成功的單菌落質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，同時(shí)送往上海英濰捷基公司測序。1.5 山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞及鑒定抽提無內(nèi)毒素pVAX1-IL-2質(zhì)粒，利用Lipofatamiane 2000將pVAX1-IL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相同劑量的pVAX1載體空載體對照組，正常細(xì)胞為空白對照組
吉林畜牧獸醫(yī) 2022年1期2022-02-23
- 剛地弓形蟲SRS29C截短型基因的克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
此后用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如表3，酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，將正確的克隆質(zhì)粒送至測序公司進(jìn)行基因序列測定。表3 雙酶切反應(yīng)體系 μL1.2.5 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a（＋）和pET-32a (＋)以及測序正確的克隆質(zhì)粒pEASY-Blunt- SRS29Ccut分別用Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系見表3，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收pET-28a和pET-32a載體片段以及帶有Ⅰ和Ⅰ
天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 2021年3期2021-10-13
- 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證Nlu-miRNA-8對Ccdc124的靶向調(diào)控
述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下，體系總體積為40μL。PCR產(chǎn)物酶切體系：PCR產(chǎn)物20μL，10×H緩沖液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性內(nèi)切酶2μL，NotI限制性內(nèi)切酶2μL，ddH2O 8μL，共40μL。反應(yīng)程序?yàn)樵?7℃酶切4 h，隨后進(jìn)行回收純化。1.2.4 psi-CHECK2雙酶切處理 psi-CHECK2載體含有限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI酶切位點(diǎn)。用兩種內(nèi)切酶XhoI和NotI對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系
湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年15期2021-09-01
- 轉(zhuǎn)基因大穗小麥與受體小麥差異基因的初步研究
總DNA的限制性雙酶切。取滅菌0.5 mL離心管，按照表1中所列配制反應(yīng)液進(jìn)行酶切反應(yīng)，總體積為30 μL。37 ℃水浴鍋中保育5 h，同時(shí)對作為對照的λDNA進(jìn)行37 ℃保育2 h，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。表1 不同植物材料基因組總DNA限制性雙酶切反應(yīng)液配制量表（2）酶切DNA的電泳分離及硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印。酶切DNA的電泳分離：酶切后的DNA樣品與Marker一起進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。酶切片段的原位變性及硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)?。?/div>
廣東蠶業(yè) 2021年7期2021-08-26
- 香菇柄雙酶同步糖化工藝優(yōu)化
酶和糖化酶，設(shè)計(jì)雙酶同步糖化制備香菇柄水解液，提高其還原糖含量，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化糖化工藝條件，以期得到無酸堿處理的高還原糖香菇柄水解液，為后續(xù)香菇柄酒等發(fā)酵食品的開發(fā)提供參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑香菇柄：市售；纖維素酶（酶活20 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；糖化酶（酶活50 000 U/g）：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；酒石酸鉀鈉、硫酸銅、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。中國釀造 2021年5期2021-06-04
- 部分?jǐn)U增結(jié)合雙片段連接法克隆系列截短基因突變體
R Ⅰ/SalⅠ雙酶切插入pEGFP_C2載體(未發(fā)表數(shù)據(jù))。為了降低克隆cyclinE及其截短基因的激酶活性缺失(kinase-deficient, KD)突變體[17]過程中重復(fù)擴(kuò)增帶來的隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)，本研究利用OE-PCR擴(kuò)增C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2這3個(gè)原始質(zhì)粒中含突變位點(diǎn)的一小段共有序列，再采用雙片段連接法置換原始質(zhì)粒中的對應(yīng)序列以構(gòu)建完整突變基因，以期對常規(guī)OE-PCR作適當(dāng)改進(jìn)，提供一種克隆生物技術(shù)進(jìn)展 2021年1期2021-01-27
- 攜帶IL-2/NK4雙基因減毒沙門氏菌TPIN的遺傳穩(wěn)定性研究
體系1.2.4 雙酶切鑒定 挑取待測菌落于10 mL LA和LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h后，按質(zhì)粒提取試劑盒操作提取質(zhì)粒，測濃度后進(jìn)行雙酶切鑒定(表3)。表3 酶切體系取上述混合物于37 ℃水浴1 h后，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。1.2.5 TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞 挑取新鮮接種的TPIN和Ty21a初始代菌落分別接種于10 mL LA和10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)OD600為0.6，離心，D-PBS洗滌微生物學(xué)雜志 2020年3期2020-09-07
- 水稻OsWHY1基因克隆及過表達(dá)與RNAi載體構(gòu)建
acⅠ與SpeⅠ雙酶切正義鏈載體與PTCK303表達(dá)載體，回收片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒后用RS引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證.用KpnⅠ與BamHⅠ雙酶切反義鏈載體與連接有正義鏈的PTCK303表達(dá)載體，回收片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒后用RAS引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證與SacⅠ與BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證.利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌液加入50%甘油于-80 ℃保存.2 結(jié)- 擬南芥RBS1基因RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選
aI限制性內(nèi)切酶雙酶切，雙酶切產(chǎn)物跑膠、回收，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，涂卡那抗生素平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，取邊緣整齊透亮的菌落，擴(kuò)菌落PCR，取陽性菌落搖菌，提取重組質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR，雙酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)插入基因片段S與重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段大小一致(圖2B)，此時(shí)S片段反向連入pFGC5941載體，命名為pFGC5941-RBS1.之后再次用SF及SR引物重新擴(kuò)增RBS1特異片段S，將PCR產(chǎn)物跑膠回收后，和以上構(gòu)建- 扁果枸杞表皮蠟質(zhì)合成相關(guān)基因LbCER1的RNAi載體構(gòu)建
hoI/KpnI雙酶切，回收小片段，同 T4連接酶與經(jīng)同種限制性內(nèi)切酶雙酶切并回收大片段的載體pKANNIBAL連接，得到重組克隆pKANNIBAL-LbCER1(+)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。以P3、P4為引物，進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增檢測陽性菌落。P3序列為5′-AGAAGACGTTCCAACCACG，P4序列為5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC。挑取陽性菌落測序驗(yàn)證pKANNIBAL-LbCER1(+)質(zhì)粒構(gòu)建的正確食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年10期2020-06-12
- 潛在抑癌基因eIF4E3野生型和突變體質(zhì)粒的構(gòu)建*
ES2-EGFP雙酶切與純化、回收：用限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI雙酶切eIF4E3基因片段及空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP。用限制性內(nèi)切酶NheI、BamHI分別雙酶切eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因片段及空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP。將eIF4E3酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收；提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，找到相應(yīng)的目的條帶切膠并回收。1.2.3 目的片段和載體質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化、提取、鑒定：使用T4 DNA Ligase產(chǎn)品將目的片段與線性載體黑龍江醫(yī)藥 2020年4期2020-05-19
- 膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其與microRNA-30b關(guān)系初探
Ⅰ/Xho Ⅰ 雙酶切，回收純化，克隆至pIRES2-EGFP載體。1.4 載體構(gòu)建 NheⅠ/XhoⅠ雙酶切載體pIRES2-EGFP和1095 bp的CTHRC1 PCR產(chǎn)物(見1.3)，行1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，切膠回收載體及DNA片段。按照TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2 .0試劑盒說明書配制連接體系, 將CTHRC1 DNA片段與pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α E.coli C臨床肝膽病雜志 2020年2期2020-02-28
- 雙熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證乳腺癌中l(wèi)ncRNA PVT1 為let-7c-5p的靶基因
baⅠ和NotⅠ雙酶切，將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收。目的片段與載體質(zhì)粒摩爾比7∶1，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α 中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)12h，挑取單菌落進(jìn)行搖床培養(yǎng)。12h 后收集菌體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測 MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.3。提取對照質(zhì)粒pGL3、重組質(zhì)粒pRL-TK-Pw 和pRL浙江醫(yī)學(xué) 2020年1期2020-01-18
- 肺炎克雷伯菌產(chǎn)CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因環(huán)境研究
2.1接合子質(zhì)粒雙酶切 對篩選出的含有CTX-M-14基因的陽性接合子用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行抽提，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)，紫外投射儀下觀察結(jié)果，確認(rèn)接合子質(zhì)粒存在后用BamHI和SalI雙酶切。雙酶切反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)體系為接合子質(zhì)粒7 μL，水8 μL，10×Buffer 4 μL，BamHI 3 μL，SalI 3 μL，混勻并離心，37 ℃水浴酶切3～4 h，經(jīng)0.6%瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)，用凝膠成像攝相。1.2.2.2PB中國人獸共患病學(xué)報(bào) 2019年10期2019-11-05
- 申克孢子絲菌STE20基因RNA干擾菌株的構(gòu)建方法
oⅠ和HindⅢ雙酶切；將PUC-PUT用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切。酶切后再分別純化回收。c.將酶切后的純化PCR片段與酶切后純化的PUC-PUT載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-PSUT(見圖1)。d.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證[5]。酶切體系：PCR片段(50～100 ng/μL)5 μLXhoⅠ1 μLHindⅢ1 μL 10×buffer2 μLddH2O11 μLTotal 20μL酶切溫度：37℃，時(shí)中國真菌學(xué)雜志 2019年3期2019-07-10
- 肝片吸蟲SAP-2蛋白的基因克隆、表達(dá)及其診斷潛力初步評估
-2基因的擴(kuò)增及雙酶切鑒定以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增SAP-2基因。RT-PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，與pMD19-T(simple)載體4 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，篩選出陽性轉(zhuǎn)化西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2018年12期2019-01-18
- 外泌體源性oar-miR-10b在綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及靶基因的鑒定
LO空載體并進(jìn)行雙酶切，將雙酶切的目的片段BCL2L2和PmirGLO 16℃過夜連接，將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)18 h后提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測 取生長狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞，以5×104CPU接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入100 μL的DMEM無血清培養(yǎng)基，置于室溫平衡15 min以上。每孔加入100 μL的Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2018年12期2018-12-24
- 家蠶非編碼RNA Bm-152功能初探
mHI、NcoI雙酶切actinA3啟動(dòng)子，連接在pFBDM載體上，獲得pFBDM[A3]載體.NcoI、KpnI雙酶切Bm-152 PCR產(chǎn)物，連接在pFBDM[A3]上，獲得pFBDM[A3-Bm-152]載體.BamHI、BglII雙酶切pFBDM[A3-Bm-152]載體，BglII雙酶切piggyBac[A3-EGFP]，連接獲得piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體.陰性對照為實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建成功的piggyBac[A3- 戊型肝炎病毒與ING5相互作用的研究
和HindIII雙酶切，膠回收載體和目的基因片段，以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用BamHΙ和HindIII雙酶切鑒定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為PGC-ING5。反應(yīng)體系如下：PGC載體骨架(200 ng)5 μL，目的片段(100 ng)12 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，total中國人獸共患病學(xué)報(bào) 2018年7期2018-07-31
- 人參3-O-UGT1基因RNAi表達(dá)載體工程菌的構(gòu)建
T和正義片段同時(shí)雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將測序驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-S；使用SmaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質(zhì)粒pMD-S和反義片段同時(shí)雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，采用熱轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-3UGT1-RNAi(3種重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示)。圖1 三種重組載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schemat吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版） 2018年1期2018-03-10
- BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒電泳彌散原因初探
mHⅠ+XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒電泳彌散原因初探金科華1,2,張惠敏3,楊志珅3,金天穎3,盧曉曉3(1湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院,咸寧 437100;2湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;3湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)目的 探討TaKaRa公司(中國大連)快速限制酶BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切質(zhì)粒pET-28a、pET-28a-SDHA產(chǎn)生彌散的原因。 方法 比較4種條件下酶切對彌散的影響:①BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切Elution Buffer(山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2017年11期2017-12-01
- 靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能驗(yàn)證
hoI和HpaI雙酶切后的pLL3.7慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建重組的pLL3.7-YWHAE-shRNA表達(dá)質(zhì)粒和pLL3.7-NC-shRNA陰性對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Stable3，挑取重組陽性菌落抽提質(zhì)粒行雙酶切及測序(福州鉑尚生物技術(shù)有限公司)鑒定。siYWHAE-1：F：5′-TGCTGAGCAGTTGTCCGCGTTTCAAGAGAACGCGGACAACTGCTCAGCTTTTTTC-3′R：5′-TCGAGAAAAAAGCTGAGCA福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2017年3期2017-08-11
- 噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37的原核表達(dá)與鑒定
oRⅠ與SalⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-28a-EGFP。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以確保插入基因的準(zhǔn)確。將目的基因片段gp37與測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP用SalⅠ與XhoⅠ雙酶切，雙酶切產(chǎn)物回收后連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2016年5期2017-01-06
- 魚腥藻PCC7120染色體基因?qū)sr0757/alr0758的表達(dá)優(yōu)化及其鑒定
過菌落PCR以及雙酶切鑒定后送測序.測序正確后保存質(zhì)粒，分別命名為 pMD18-T-asr0757和pMD18-T-alr0758．表1 PCR引物及序列注：下劃線為括號內(nèi)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶識別的酶切位點(diǎn)序列．1.2 .3重組表達(dá)載體 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的構(gòu)建BamH1和EcoR1雙酶切測序正確的質(zhì)粒pMD18-T-asr0757、pMD18-T-alr0758以及表達(dá)載體pET-30a(+)，回收各自雙酶切目的片- pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
和EGFP-C3雙酶切，構(gòu)建EGFP-C3-GRK2-S670A，SalI/BamHI雙酶切EGFP-C3-GRK2-S670A和pIRES-EGFP，得到pIRES-EGFP-GRK2-pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒；重組質(zhì)粒；細(xì)胞轉(zhuǎn)染G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(Gprotein-coupledreceptorkinase2，GRK2)在G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors，GPCRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2016年10期2016-11-25
- 基因工程中的單酶切與雙酶切
現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)中常用雙酶切的方法。2 雙酶切雙酶切，即采用兩種不同的限制酶同時(shí)處理目的基因和質(zhì)粒。因?yàn)橄拗泼妇哂刑禺愋?，不同的酶作用于不同的堿基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。當(dāng)應(yīng)用DNA連接酶進(jìn)行連接時(shí)，就只能存在一種正連情況，而不會(huì)出現(xiàn)反連的問題。正因?yàn)榭梢杂行У胤乐瑰e(cuò)誤連接的現(xiàn)象出現(xiàn)，雙酶切的做法被廣泛應(yīng)用于基因工程中表達(dá)載體的構(gòu)建，也可以用于制備體外轉(zhuǎn)錄的模板。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引起的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，可生物學(xué)教學(xué) 2016年6期2016-08-20
- 雙酶梭菌TK6的篩選及益生物質(zhì)對其代謝活力的影響
300457）雙酶梭菌TK6的篩選及益生物質(zhì)對其代謝活力的影響李敬杰，劉金輝，王海寬 （工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）本實(shí)驗(yàn)采用傾注法從健康成年人的糞便中篩選雙酶梭菌（Clostridium bifermentans）TK6，該菌有益于反芻動(dòng)物，其發(fā)酵產(chǎn)物有消化酶、短鏈脂肪酸以及α-酮異己酸（KIC）等益生物質(zhì).分別利用7種低聚糖（低聚葡萄糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、棉籽糖以及水蘇糖）天津科技大學(xué)學(xué)報(bào) 2016年3期2016-08-02
- 鹿骨雙酶法酶解工藝的研究
0012）?鹿骨雙酶法酶解工藝的研究于浩，張海悅*，李震，楊雪 （長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）摘要：以新鮮鹿骨為原料，探討鹿骨酶解的最佳工藝條件；以水解度為指標(biāo)，確定以堿性蛋白酶和胰蛋白酶為試驗(yàn)用酶，通過正交試驗(yàn)確定鹿骨雙酶法酶解的最佳工藝條件。結(jié)果表明：堿性蛋白酶在pH 9.0、溫度50℃的條件下水解時(shí)間為3 h，再在pH 8.0、溫度37℃條件下，加入胰蛋白酶水解2 h，此時(shí)的水解度為12.72%，分別是堿性蛋白酶和胰蛋白酶最食品研究與開發(fā) 2016年9期2016-06-13
- 超聲波輔助復(fù)合酶提取雞軟骨中硫酸軟骨素
用超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素，以硫酸軟骨素得率為考察指標(biāo)，選取最優(yōu)提取方法，并對最優(yōu)方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面優(yōu)化.試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為超聲波功率500 W，超聲時(shí)間120 min，堿性蛋白酶添加量為1%，木瓜蛋白酶添加量為2%，硫酸軟骨素得率可達(dá)到36.08%.超聲波輔助堿-雙酶法耗時(shí)短，操作簡單且得到的產(chǎn)品純度高.關(guān)鍵詞：雞軟骨；硫酸軟骨素；雙酶；超聲波硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)又稱?；擒浌撬?、康得寧，- 質(zhì)粒抽提策略對雙酶切鑒定的影響
@qq.com)雙酶切聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳是鑒定DNA重組成功與否的重要方法［1］，瓊脂糖凝膠電泳圖像質(zhì)量直接影響鑒定結(jié)果的判讀、論文發(fā)表。條帶彌散是圖像質(zhì)量不佳的主要表現(xiàn)之一，研究者多將其歸咎于不合理的酶切和不規(guī)范的電泳操作［2］，而很少報(bào)道質(zhì)粒抽提策略對彌散的影響。筆者在雙酶切鑒定葡萄糖6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)重組質(zhì)粒pET-28a-G6PD時(shí)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒抽提策略對雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2015年6期2015-12-16
- BikDD腫瘤靶向基因治療抑制淋巴瘤細(xì)胞生長研究＊
對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后純化回收，連入同樣用BgiⅡ/HindⅢ雙酶切的pGL3－Basic載體，構(gòu)建成pGL3－Bik載體。利用PCR及 HindⅢ/BgiⅡ雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司純化測序。1.2.2 pGL3－BikDD 載體的構(gòu)建 根據(jù) GenBank的Bik基因序列，為實(shí)現(xiàn)將Bik基因編碼蛋白第33位蘇氨酸殘基和第35位絲氨酸殘基替換為門冬氨酸，對其編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別將第33位蘇氨酸殘基編碼基因ACT突變?yōu)镚AC，第35位絲成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2015年1期2015-12-06
- 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
I和XhoI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢切出DNA條帶用膠回收試劑盒純化后合并，加入T4 DNA連接酶16℃連接過夜1.2.3轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌、細(xì)菌的擴(kuò)增及質(zhì)粒提取取上述連接后反應(yīng)液10ul，加感受態(tài)細(xì)菌JM109 100ul冰上放置20min，然后420C熱休克2min， 加1ml LB，37 0C震蕩培養(yǎng)30min， 取100ul涂布到卡那霉素培養(yǎng)平皿上，370C培養(yǎng)過夜。然后挑起單個(gè)克隆接種到5ml LB+Kana培養(yǎng)液中37醫(yī)學(xué)美學(xué)美容·中旬刊 2015年2期2015-10-21
- 高效PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的構(gòu)建與篩選
mHⅠ和XhoⅠ雙酶切并純化回收后，用T4 DNA連接酶將其骨架與兩端帶有BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA片段于16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，接種于2 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)10 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將構(gòu)建正確的轉(zhuǎn)西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） 2015年8期2015-07-02
- 聚能雙酶水溶肥
聚能雙酶水溶肥能提高作物對糖類物質(zhì)的合成率，能改良和活化土壤、改善作物品質(zhì)、提高作物抗逆力。聚能雙酶水溶肥水溶性好，富含活性蛋白雙酶，能大大提高農(nóng)作物對肥料中各種養(yǎng)分的吸收率和利用率，有效解決各元素之間的頡頏，促進(jìn)作物快速生長。在生產(chǎn)中使用聚能雙酶水溶肥，可提高作物的坐果率，促使果實(shí)著色均勻，提早作物上市10～15天，延長收獲期20～30天，減少腐爛畸形果，每畝還可節(jié)省化學(xué)肥料30%左右，增產(chǎn)增收效果明顯。（江西 綠洲）農(nóng)村百事通 2015年8期2015-05-19
- 不同肌肉特異性啟動(dòng)子IGF2表達(dá)載體構(gòu)建及對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響
T克隆載體連接，雙酶切鑒定正確后命名為pMD-18T-IGF2，送由北京英駿公司測序。1.2.2 表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-IGF2的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切獲得目的片段，用同樣的酶雙酶切pcDNA3.1(+)載體，回收純化后，用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-IGF2載體。1.2.3 pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-My畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2015年4期2015-03-22
- 生殖支原體MG 427原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
1空載體的酶切 雙酶切總體積為40.0μL，均含: 10×NEB bu ffer 3 4.0μL；100×BSA 0.4μL；BamHI 1.0μL；NotI 1.0μL；其中PCR雙酶切體系中加mg427純化產(chǎn)物10.0μL；d d H2O 23.6μL； pGEX-6 p-1載體雙酶切體系中加PGEX-6P-1 15μL；ddH2O 18.6μL；然后分別置入37℃水浴箱中，保溫酶切12 h。取酶切后于1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察目的條帶并當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2015年22期2015-03-12
- 流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究*
位點(diǎn)分別進(jìn)行單、雙酶切鑒定，并回收雙酶切產(chǎn)物。1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2/CTB-Eg的構(gòu)建 pEGFP-C2質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切膠回收后，在T4 DNA連接酶的作用下，分別與目的片段CTB、Eg和CTB-Eg連接，載體與目的片段摩爾比為1∶10。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴(kuò)增，DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行單、雙酶切鑒定和基因測序鑒定。1.2.3 HEK西部醫(yī)學(xué) 2015年2期2015-02-25
- 聚焦酶肥產(chǎn)業(yè)共創(chuàng)綠色未來“肥料科技創(chuàng)新暨雙酶尿素推廣應(yīng)用營銷研討會(huì)”召開
“肥料科技創(chuàng)新暨雙酶尿素推廣應(yīng)用營銷研討會(huì)”在北京召開。會(huì)議探討了在肥料行業(yè)“減肥增效”的背景下，如何通過創(chuàng)新提高肥料利用率，生產(chǎn)綠色、環(huán)保的肥料。來自肥料企業(yè)的代表、經(jīng)銷商近150人參加了此次會(huì)議，并為在雙酶尿素推廣、應(yīng)用、銷售領(lǐng)域做出突出貢獻(xiàn)的經(jīng)銷商進(jìn)行了頒獎(jiǎng)。會(huì)上，中國石油與化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)副會(huì)長、中國氮肥工業(yè)協(xié)會(huì)理事長顧宗勤表示，我國作為世界上最大氮肥生產(chǎn)、消費(fèi)及貿(mào)易國，氮肥當(dāng)季利用率只有33%左右，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家。單一的化肥結(jié)構(gòu)已難以適應(yīng)農(nóng)業(yè)的新變中國農(nóng)資 2015年42期2015-01-31
- 聚焦酶肥產(chǎn)業(yè)共創(chuàng)綠色未來
“肥料科技創(chuàng)新暨雙酶尿素推廣應(yīng)用營銷研討會(huì)”召開10月28日，由北京中農(nóng)瑞利源高科技發(fā)展有限公司、山東禹城瑞利源科技有限公司舉辦的“肥料科技創(chuàng)新暨雙酶尿素推廣應(yīng)用營銷研討會(huì)”在北京召開。會(huì)議探討了在肥料行業(yè)“減肥增效”的背景下，如何通過創(chuàng)新提高肥料利用率，生產(chǎn)綠色、環(huán)保的肥料。來自肥料企業(yè)的代表、經(jīng)銷商近150人參加了此次會(huì)議，并為在雙酶尿素推廣、應(yīng)用、銷售領(lǐng)域做出突出貢獻(xiàn)的經(jīng)銷商進(jìn)行了頒獎(jiǎng)。會(huì)上，中國石油與化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)副會(huì)長、中國氮肥工業(yè)協(xié)會(huì)理事長顧宗中國農(nóng)資 2015年42期2015-01-31
- 新牧1號苜?？鼓嫦嚓P(guān)基因MvNHX1啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建
動(dòng)子的功能，采用雙酶切的方法，用核酸內(nèi)切酶S acⅠ和N c oⅠ分別雙酶切p C AM B IA1304質(zhì)粒和陽性重組質(zhì)粒p E A S Y-T1-simple-pMv N H X1，然后回收目的片段。通過T4DN A連接酶將目的片段和空載體相連后獲得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到宿主菌D H5α，通過畫板，卡那霉素篩選后挑單菌落搖菌。然后用菌液PC R及雙酶切鑒定該載體后，用凍融法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌E H A105。結(jié)果表明，成功培養(yǎng)出含有抗逆相關(guān)基因Mv N湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年1期2015-01-10
- 擬南芥AtMYB50和AtMYB61蛋白的原核表達(dá)研究
it抽提質(zhì)粒，用雙酶切切下目的條帶，電泳檢測，回收純化。測序并確認(rèn)序列無誤。1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建pET－32a＋和pGEX－4T－1用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行完全雙酶切，電泳檢測并回收載體片段，與回收好的目的基因片段相連，轉(zhuǎn)化至Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg／mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落，置于100μg／mL Amp－LB液體培養(yǎng)基，37℃、O／N培養(yǎng)。用 TIANprep Mini Plasmi- 限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切條件的優(yōu)化
子生物學(xué)等領(lǐng)域。雙酶切更為廣泛應(yīng)用于載體構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閱蚊盖泻筮B接目的基因理論上會(huì)出現(xiàn)50%可能的錯(cuò)誤性，而雙酶切后的不同黏性末端在一定程度上避免單酶切的不足[3]。KpnⅠ和EcoRⅠ是目前常用的限制性內(nèi)切酶，屬第Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，來源方便、價(jià)格便宜，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[4]。試劑公司會(huì)給出這兩種酶的適合緩沖液，但這兩種限制性內(nèi)切酶的最適緩沖液離子濃度相差較大，給這兩種酶的應(yīng)用帶來一定不便。本研究選取KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切體系，吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào) 2014年4期2014-08-17
- 肥料有了酶，作物好吸收——訪雙酶系列肥料發(fā)明人孫立文
，記者專程采訪了雙酶系列肥料發(fā)明人孫立文。通過他全方位的介紹和闡述，記者對于“雙酶技術(shù)”這項(xiàng)即將應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)資產(chǎn)業(yè)的新型技術(shù)有了更加全面的了解。孫立文向記者介紹說，雙酶尿素就是尿素與尿激酶的混合產(chǎn)物，它的物質(zhì)結(jié)構(gòu)與人尿類似，是一種新型有機(jī)肥料。與雙酶尿素共同出現(xiàn)在市場上的產(chǎn)品是雙酶復(fù)合肥，對于農(nóng)作物而言，雙酶復(fù)合肥真正地做到了有酶好吸收。說到這里，孫立文用一段形象的順口溜來概括雙酶肥料的特征：葉子是肺、根是嘴，消化吸收全靠酶，雙酶肥是肥、卻又含酶，是農(nóng)民增中國農(nóng)資 2014年30期2014-08-15
- 谷朊粉酶解條件優(yōu)化及其抗氧化活性
（堿性蛋白酶）和雙酶（堿性蛋白酶＋風(fēng)味酶）2種方法對谷朊粉進(jìn)行酶解，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了酶解條件，并對比分析了2種水解物的抗氧化活性、分子質(zhì)量及氨基酸組成的差異，從而為谷朊粉酶解物制備抗氧化活性肽提供一定的理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料與儀器谷朊粉（粗蛋白80.2%）：河南省蓮花味精有限公司。堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，酶活力2.4 AU／g）、風(fēng)味酶（Flavourzyme 500 MG，酶活力500 LAPU／g）：丹麥諾維信酶制劑公中國糧油學(xué)報(bào) 2014年11期2014-03-13
- IDO啟動(dòng)序列GAS和ISRE熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建及其活性檢測
luⅠ和XhoⅠ雙酶切,同時(shí)質(zhì)粒小提試劑盒小提質(zhì)粒pGL3-Enhancer,并經(jīng)MluⅠ和XhoⅠ雙酶切,利用凝膠回收試劑盒回收并純化酶切產(chǎn)物。將上述制備的IDO啟動(dòng)序列GAS7和ISRE4片段與線性化雙粘性末端的pGL3-Enhancer載體片段以3∶1摩爾比的比例用T4 DNA連接酶于16℃循環(huán)水浴連接反應(yīng)過夜,連接產(chǎn)物于60℃滅活10 min后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α,經(jīng)氨芐霉素抗性篩選,分別取陽性克隆提取重組質(zhì)粒pGL3-Enhancer-中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志 2014年2期2014-03-13
- 大鼠Akt1基因合成及載體構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究
膠回收試劑盒回收雙酶切的大鼠Akt1基因片段和載體pGCMV/MCS/RFP/Neo；4）用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的大鼠Akt1基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時(shí)；5）取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)細(xì)胞Top10，均勻涂布于50μg/ml Ampicillin平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時(shí)；6）挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，用酶切法驗(yàn)證。2 結(jié)果大鼠Akt1 PCR電泳圖片如圖1所示。大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RF山東工業(yè)技術(shù) 2013年12期2013-11-30
- MSTN RNAi雙元表達(dá)載體構(gòu)建及效果試驗(yàn)
的片段的亞克隆 雙酶切pHANNIBAL、p－M1和p－M2，電泳回收、酶切鑒定、連接，將已插入正向和反向目的片段的中間載體命名為pHA－M1－M2。1.2.4 MSTN RNAi雙元表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pHA－M1－M2和pEGFPN1，電泳回收相應(yīng)的目的片段，連接，轉(zhuǎn)化，卡那抗性篩選、提取質(zhì)粒，單、雙酶切鑒定。1.2.5 成肌細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)14日齡鴨胚成肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染1h后，再加入完全培養(yǎng)基至5mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。1中國獸醫(yī)雜志 2013年7期2013-11-22
- 杜氏鹽藻糖原合成酶激酶3 cDNA片段的克隆及其在鞭毛再生中的功能*
RⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，取插入片段大小正確的單克隆菌液送測序，進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。1.3.3 3’RACE法擴(kuò)增GSK3 3’端序列 根據(jù)已擴(kuò)增的GSK3片段設(shè)計(jì)3’RACE上游引物：外側(cè)5’-CCTGGTGCTGGAGTTCGT-3’(18 bp)，內(nèi)側(cè)5’-ACTACACTGCTGCCATTGAT-3’(20 bp)。下游引物為3’RACE試劑盒自帶的引物：外側(cè) 5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’(23 bp)和內(nèi)側(cè) 5’-CG- 含翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin杜氏鹽藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建*
-T/Can進(jìn)行雙酶切，分別回收載體片段和目的片段。利用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。2 結(jié)果2.1未添加及添加翻譯增強(qiáng)序列的人canstatin基因片段的擴(kuò)增結(jié)果RT-PCR所得片段約為700 bp，與預(yù)期片段大小基本一致(圖1)。圖1 人canstatin RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果2.2PMD18-T/Can的酶切鑒定PMD18-T/Can經(jīng)PaeR7Ⅰ、SphⅠ雙酶切，得到一條載體片段和一條- 東方山羊豆Go MIPS雙元表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定＊
coI／SpeI雙酶切，37℃16 h，經(jīng)凝膠電泳檢測，利用凝膠電泳DNA回收試劑盒分別回收目的片段。在T4連接酶的作用下，將回收的目的片段連接，連接體系為10μL，37℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性菌落植菌，提取陽性克隆質(zhì)粒pCAMBIA1302-MIPS。1.3.6 雙酶切鑒定 對p CAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒進(jìn)行NcoI／SpeI雙酶切鑒定，取10μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。1.3.7 序列測定與分析 將重組載體pCAMBIA1302-MIPS送Inv家畜生態(tài)學(xué)報(bào) 2013年1期2013-01-07
- 血管內(nèi)皮生長因子逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
.1-VEGF的雙酶切及目的基因片段膠回收pcDNA3.1-VEGF質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增后測序鑒定,無堿基突變及序列缺失。根據(jù)酶切位點(diǎn)選擇EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF和質(zhì)粒pLXSN,然后進(jìn)行瓊脂糖電泳,用膠回收試劑盒回收570bp目的基因片段。1.2.2 pLXSN雙酶切根據(jù)pLXSN的多克隆位點(diǎn),選擇EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶雙酶切。瓊脂糖電泳后,用膠回收試劑盒回收6kbp片段。1.2.3 pcDNA3.1-VEGF重周口師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2012年2期2012-12-12
- 庫爾勒香梨蘋果褪綠葉斑病毒RNAi載體構(gòu)建及煙草遺傳轉(zhuǎn)化
I／Spe I雙酶切，回收并連接到piRDG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成piRD＿CLA－r；將CLA－f重組質(zhì)粒和piRD＿CLA－r分別用 BamH I／Kpn I雙酶切，回收并連接，構(gòu)成中間載體piRD＿CLA。最后，將piRD＿CLA上Xba I／Sac I雙酶切片段連接到pBi35SG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成植物表達(dá)載體pBi35S＿CLA。將CLB－r質(zhì)粒用Sac I／Spe I雙酶切，收并連接到piRDG12相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成piRD＿CLB－r；將CLA－f- 日本血吸蟲角化不良蛋白（DKC1）基因克隆與表達(dá)＊
增目的基因片段，雙酶切，并將其與PET-28a（+）載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌，經(jīng)PCR擴(kuò)增并測序鑒定后，抽提重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21大腸桿菌中。PCR鑒定陽性重組克隆后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE方法檢測表達(dá)結(jié)果，收集、純化重組蛋白。結(jié)果：通過設(shè)計(jì)上下游引物經(jīng)PCR法擴(kuò)增出約1 400bp的DNA片段；將DKC1與PET-28a（+）質(zhì)粒分別作BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，二者經(jīng)粘性末端連接并轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，PCR篩選陽性微循環(huán)學(xué)雜志 2012年4期2012-03-19
- EB病毒BARF1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
oRI和XbaI雙酶切與測序鑒定，證實(shí)BARF1基因已克隆到pUM－T載體。凝膠回收雙酶切產(chǎn)物BARF1片段，再將其連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)－h(huán)is，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并用EcoRI和XbaI雙酶切分析，確認(rèn)插入方向。③結(jié)果 以B95－8細(xì)胞提取RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增的cDNA為模板擴(kuò)增BARF1，得到與預(yù)期片段大小相符的666bp的片段;對所提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，證實(shí)目的基因BARF1片段- 重組木聚糖酶的安全高效表達(dá)與應(yīng)用研究
、EcoT221雙酶切 pPIC9-xyn2和T-GAP載體，分別回收約 8000bp的大片段和約500bp的GAP啟動(dòng)子片段，連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成畢赤酵母表達(dá)載體pGAPHα-xyn2。圖1 畢赤酵母表達(dá)載體pGAPHα-xyn2的構(gòu)建1.2.2.2 畢赤酵母表達(dá)載體pGAPHINU-xyn2的構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pGAPHINU-xyn2的構(gòu)建過程如圖2所示。以BamHI、SnaBI雙酶切 pGAPHαxyn2，回收約8000bp的大片段，與經(jīng)密碼子優(yōu)化食品工業(yè)科技 2011年1期2011-11-10
- 重組真核質(zhì)粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的構(gòu)建和表達(dá)*
和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。表1 Tudor-SN的SN(1～4)功能片段引物序列1.2.2 線性pERFP-C1的獲取 采用pERFP-C1質(zhì)粒載體，見圖1。以質(zhì)粒快速小提試劑盒提取pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒DNA，采用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒，完整切下線性pERFP-C1質(zhì)粒載體，瓊脂糖電泳。凝膠回收試劑盒回收得到約4 700 bp線性pERFP-C1。1.2.3 重天津醫(yī)藥 2011年2期2011-02-28
- 一種胸腺肽α1的原核表達(dá)方法
和HindIII雙酶切, 構(gòu)建ELP-pET41 a(+), 抽提質(zhì)粒部分進(jìn)行PflMI和BglI雙酶切, 部分PflMI單酶切,雙酶切收集的小片段插入單酶切線性化的質(zhì)粒, 構(gòu)建成(ELP)2-pET41 a(+), 如此重復(fù)構(gòu)建(ELP)n-pET41 a(+); 將人工合成的Tα1-Gly序列進(jìn)行退火, 并與構(gòu)建的(ELP)n-pET41 a(+)進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 連接反應(yīng)構(gòu)建Tα1-Gly-ELP[V5-10]-pET41 a(+),- 煙草Bax inhibitor-1基因植物沉默表達(dá)載體的構(gòu)建及對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
Ⅰ與Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pFGC5941，回收約1.3 kb的CHSA Intron基因片段；用AscⅠ與Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pGSA1285，回收約9.5 kb的載體片段。將兩個(gè)片段連接，獲得重組質(zhì)粒。這樣，首先向載體中引入了ihpRNA沉默所需的Intron片段。用AscⅠ與Bam HⅠ雙酶切鑒定，切出了1.3 kb的片段，證明是所需的含intron片段的重組質(zhì)粒，命名為pGSA2285（見圖1、2）。2.1.2 煙草BI－1基因反向插入載體pGS- MHCⅡ類轉(zhuǎn)激活因子基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建
oRⅠ和XhoⅠ雙酶切，U-Gene凝膠回收純化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA連接酶將上述目的基因片段與pShuttle-GFP-CMV片段連接，得到穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，并經(jīng)KpnⅠ單酶切及測序鑒定。Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ雙酶切處理，回收目的片段，將pAdxsi載體片段和插入片段進(jìn)行酶連接，得到腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-CⅡTA，經(jīng)Xho中華胰腺病雜志 2009年6期2009-11-27
- 香菇柄雙酶同步糖化工藝優(yōu)化