一種胸腺肽α1的原核表達(dá)方法

朱政斌

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽(yáng) 414006)

胸腺肽α1(Tα1)是動(dòng)物胸腺素組分5(TF5)的主要活性組分, 是其中活性最強(qiáng)的組分之一[1]. 它是一種新型免疫調(diào)節(jié)因子, 通過(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟淋巴細(xì)胞, 刺激淋巴系統(tǒng), 提高機(jī)體免疫功能. 臨床上應(yīng)用胸腺肽α1提高T細(xì)胞的免疫功能[2], 治療病毒性肝炎和延緩某些老年病的發(fā)生與發(fā)展. 胸腺肽α1還有抗感染、抗病毒和抗腫瘤的功效, 尤其對(duì)癌癥的免疫性治療也具有一定的作用[3～8]. 組織提取胸腺肽α1受材料來(lái)源限制, 工作量大、成本高, 難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn). 目前國(guó)外已將其肽合成產(chǎn)品應(yīng)用于臨床, 對(duì)腫瘤、乙肝、丙肝及免疫缺陷等的治療研究已取得了良好的效果. 但采用化學(xué)合成的方法成本較高, 并且存在消旋問(wèn)題. 采用基因工程表達(dá)的方法是一種可行的思路, 目前國(guó)內(nèi)外在表達(dá)方法的研究主要集中在融合表達(dá)[9]或者串聯(lián)表達(dá)[10], 而且大多沒(méi)有考慮胸腺肽α1的N端乙?；膯?wèn)題. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院方宏清[11]等通過(guò)構(gòu)建胸腺肽α1-內(nèi)含肽表達(dá)載體和Rim J表達(dá)載體, 將兩載體共轉(zhuǎn)BL21, 從而解決了N端乙?；瘑?wèn)題, 但該方法在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生C端部分修飾問(wèn)題, 導(dǎo)致產(chǎn)率下降. 而Roman S[12]等則通過(guò)表達(dá)與化學(xué)方法?；嘟Y(jié)合實(shí)現(xiàn)了胸腺肽α1的生產(chǎn).

彈性蛋白樣多肽(ELP, elastin-like polypeptide)是一種對(duì)環(huán)境溫度敏感的人造基因工程蛋白聚合物[13],其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成, 源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域. ELP具有一個(gè)相變溫度, 當(dāng)環(huán)境溫度低于相變溫度時(shí), ELP高度可溶, 而當(dāng)環(huán)境溫度高于相變溫度時(shí), ELP聚合沉淀. ELP的這一特性在生物醫(yī)學(xué)材料, 抗腫瘤藥物的靶向運(yùn)輸?shù)确矫骟w現(xiàn)了較好的優(yōu)勢(shì). David W Wood[14,15]工作組運(yùn)用ELP蛋白的特性以及內(nèi)含肽的酶切活性, 建立了一種可用于蛋白生產(chǎn)的方法, 該方法可以獲得不含任何序列標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白, 并且不需要色譜進(jìn)行分離純化, 大大降低了蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的生產(chǎn)成本.

考慮到方宏清等的方法在生產(chǎn)過(guò)程中能夠?qū)崿F(xiàn)胸腺肽α1的N端乙?；? David W Wood等的方法能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)無(wú)色譜分離純化, 本文在方宏清和David W Wood等工作的基礎(chǔ)上, 通過(guò)構(gòu)建Tα1-Gly-ELP蛋白表達(dá)載體和Rim J蛋白表達(dá)載體, 共轉(zhuǎn)BL21菌株, 建立了一種無(wú)需色譜和親和純化的胸腺肽α1的生產(chǎn)方法,實(shí)現(xiàn)了胸腺肽α1的低成本生產(chǎn).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種與試劑

E.coli DH5α, BL21, Top10等菌種為本室自行保持, pACYCDuet1, pET41a(+)為本室自行保存, 限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品, 生化試劑為Sigma公司產(chǎn)品.

1.1.2 基因合成與引物設(shè)計(jì)

委托上海生工生物工程有限公司合成基因和引物序列如下:

Tα1-Gly序列:

ELP序列:

Rim J引物:

RimJ-F: GGAATTC CATATG TTT GGC TAT CGC AGT AAC

RimJ-R: CGG GGTACC TTA GCG GCC GGG CGT CCA

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+)載體構(gòu)建. 將合成的ELP人工基因進(jìn)行退火, 載體和ELP人工基因進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 構(gòu)建ELP-pET41 a(+), 抽提質(zhì)粒部分進(jìn)行PflMI和BglI雙酶切, 部分PflMI單酶切,雙酶切收集的小片段插入單酶切線性化的質(zhì)粒, 構(gòu)建成(ELP)2-pET41 a(+), 如此重復(fù)構(gòu)建(ELP)n-pET41 a(+); 將人工合成的Tα1-Gly序列進(jìn)行退火, 并與構(gòu)建的(ELP)n-pET41 a(+)進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 連接反應(yīng)構(gòu)建Tα1-Gly-ELP[V5-10]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-20]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-30]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-40]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-50]-pET41 a(+), Tα1-Gly-ELP[V5-60]-pET41 a(+),Tα1-Gly-ELP[V5-70]-pET41 a(+)表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)入BL21菌株. RimJ-pACYCDuet載體構(gòu)建見(jiàn)文[11], 將構(gòu)建的RimJ-pACYCDuet轉(zhuǎn)入BL21.

1.2.2 目的基因的表達(dá)

將菌種接種到普通LB培養(yǎng)基中, 30℃, 210rpm培養(yǎng)約10h, 收集菌體作為種子, 將種子接種至200mL自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中, 37℃, 210rpm培養(yǎng)約12h后收集菌體, 將收集的菌體用緩沖液重懸, 冰浴條件下超聲破菌, 低溫離心收集上清, 將收集上清加熱至50℃, 離心收集沉淀, 收集沉淀用預(yù)冷的緩沖液溶解后離心收集上清, 收集上清加熱至50℃, 離心收集沉淀, 如此反復(fù)3～4次.

1.2.3 目標(biāo)蛋白羥胺裂解

目標(biāo)蛋白羥胺裂解方法根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行改進(jìn), 采用組氨酸緩沖液, pH9.0, 40℃裂解6h, 裂解完畢加熱至50℃后離心收集上清, 將收集的上清進(jìn)行色譜分析和質(zhì)譜檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 載體的構(gòu)建

將人工合成的ELP基因退火并進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 回收片段, 將pET41 a(+)進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切, 回收線性化載體片段, 進(jìn)行連接構(gòu)建ELP-pET41 a(+), 將ELP-pET41 a(+)載體進(jìn)行PflMI和BglI雙酶切, 回收小片段, 將ELP-pET41 a(+)載體進(jìn)行PflMI單酶切并脫磷, 回收線性化載體, 進(jìn)行連接,構(gòu)建(ELP)2-pET41 a(+), 如圖1所示構(gòu)建(ELP)n-pET41 a(+), 將構(gòu)建的一系列載體進(jìn)行PCR檢測(cè), 用1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如圖2所示(其中l(wèi)ane1: ELP[V5-10]; lane2: ELP[V5-20]; lane3: ELP[V5-30];lane4: ELP[V5-40]; lane5: ELP[V5-50]; lane6: ELP[V5-60]; lane7: ELP[V5-70]). 將上述構(gòu)建的一系列載體進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 切除載體的融合標(biāo)簽, 將人工合成的Tα1基因進(jìn)行退火并進(jìn)行NdeI和EcoRI雙酶切, 回收酶切片段并與線性化載體進(jìn)行連接構(gòu)建Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+). 抽提大腸桿菌DNA, PCR擴(kuò)增RimJ基因, PCR產(chǎn)物進(jìn)行NdeI和KpnI雙酶切, 同時(shí)將pACYCDuet載體進(jìn)行NdeI和KpnI雙酶切, 回收線性化載體與RimJ基因進(jìn)行連接構(gòu)建RimJ-pACYCDuet載體并測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建正確, 將RimJ-pACYCDuet載體和Tα1-Gly-(ELP)n-pET41 a(+)載體共轉(zhuǎn)BL21, 篩選陽(yáng)性克隆.

圖1 載體構(gòu)建示意圖

圖2 構(gòu)建載體PCR檢測(cè)

圖3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.2 重組融合蛋白表達(dá)

在相同條件下表達(dá)Tα1-Gly-ELP[V5-10], Tα1-Gly-ELP[V5-20], Tα1-Gly-ELP[V5-30], Tα1-Gly-ELP[V5-40], Tα1-Gly-ELP[V5-50], Tα1-Gly-ELP[V5-60], Tα1-Gly-ELP[V5-70], 對(duì)這一系列表達(dá)載體表達(dá)蛋白進(jìn)行純化, 收集融合蛋白, 測(cè)定蛋白量, 結(jié)果如圖3B所示. (圖3A為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果: lane1: Tα1-Gly-ELP[V5-40]誘導(dǎo)表達(dá); lane2: Gly-ELP[V5-40]非誘導(dǎo)表達(dá). 圖3B為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化結(jié)果: lane1:Tα1-Gly-ELP[V5-10]; lane2: Tα1-Gly-ELP[V5-20]; lane3: Tα1-Gly-ELP[V5-30]; lane4: Tα1-Gly-ELP[V5-40];lane5 Tα1-Gly-ELP[V5-50]; lane6 Tα1-Gly-ELP[V5-60]; lane7: Tα1-Gly-ELP[V5-70]). 通過(guò)計(jì)算Tα1的含量,表明Tα1-Gly-ELP[V5-40]表達(dá)獲得的Tα1含量最高. Tα1-Gly-ELP[V5-40]表達(dá)可以獲得240mg/L的融合蛋白表達(dá)量.

2.3 目的蛋白羥胺裂解

文[16]顯示羥胺裂解可能導(dǎo)致谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺被修飾, 采用組氨酸緩沖液可以有效抑制酰胺修飾. 本試驗(yàn)通過(guò)采用組氨酸緩沖液進(jìn)行羥胺裂解, 裂解完成后升溫至50℃, 離心收集上清, 上清液進(jìn)行反相高效液相色譜分析與質(zhì)譜檢測(cè), 結(jié)果如圖4、5所示. 從圖4可知, 上清液基本只含目的肽, 從圖5可知, 目的肽為分子量3108的多肽, 與預(yù)期一致. 1L發(fā)酵液經(jīng)過(guò)細(xì)菌破碎, 變溫沉淀, 羥胺裂解, 變溫沉淀, 上清液脫鹽等步驟獲得目標(biāo)多肽29.5mg. 采用羧肽酶Y結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)測(cè)定純化多肽的羧基端氨基酸序列, 測(cè)定了12個(gè)氨基酸殘基, 氨基酸序列為-K-E-K-K-E-V-V-E-E-A-E-N, 結(jié)果如圖6所示,與預(yù)期結(jié)果一致.

圖4 裂解上清的RP-HPLC圖

圖5 胸腺肽α1的質(zhì)譜分析

圖6 羧肽酶Y結(jié)合質(zhì)譜對(duì)胸腺肽α1的C端測(cè)序圖

3 討論

Tα1作為一種免疫增強(qiáng)劑, 在臨床上應(yīng)用廣泛. 目前市場(chǎng)上提供的Tα1產(chǎn)品無(wú)論是進(jìn)口產(chǎn)品還是國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品均是通過(guò)化學(xué)合成, 價(jià)格昂貴. 國(guó)內(nèi)外對(duì)用基因工程方法生產(chǎn)Tα1進(jìn)行了大量的研究. Tα1是小肽, 采用基因工程方法生產(chǎn)小肽主要采用串聯(lián)表達(dá)方法或者融合表達(dá)方法, 采用串聯(lián)表達(dá)方法主要問(wèn)題是表達(dá)獲得串聯(lián)蛋白后的處理較困難, 而采用融合蛋白表達(dá)方法的主要問(wèn)題是目標(biāo)蛋白在融合蛋白中的含量較低. 由于第一種方法不能生產(chǎn)N端乙酰化肽, 所以只能采用第二種方法.

在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí), 我們選擇了人工合成基因, 選擇大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子, 以提高表達(dá)效率. 由于要進(jìn)行N端乙?；揎? 所以將Tα1構(gòu)建在N端. ELP融合蛋白主要是利用了ELP在較低溫度時(shí)為可溶狀態(tài),在較高溫度時(shí)形成納米的特點(diǎn), 這樣可以很簡(jiǎn)便地把融合蛋白從蛋白混合物中分離純化出來(lái)而不需要使用親和純化. 從圖4反相HPLC分析圖譜結(jié)果可知, 變溫沉淀上清液中基本只含目標(biāo)產(chǎn)物, 說(shuō)明基本不需要使用色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化, 是一種低成本的生產(chǎn)蛋白的方法. 運(yùn)用基因工程表達(dá)蛋白, 其主要生產(chǎn)成本在蛋白純化, 所以選擇ELP融合蛋白生產(chǎn)Tα1是一種可行的策略.

采用羥胺裂解則由于羥胺本身毒性比較低, 裂解效率較高, 通過(guò)控制反應(yīng)條件可以完全克服副反應(yīng),而且裂解時(shí)間較酶解時(shí)間大大縮短, 并且成本遠(yuǎn)比酶成本低. 本方法也沒(méi)有采用文[15]方法, 該文采用內(nèi)肽酶的方法, 但本實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的是小肽, 如果增加一個(gè)內(nèi)肽酶, 則小肽在融合蛋白質(zhì)中所占的比重更小, 不利于提高產(chǎn)量, 而且C端會(huì)出現(xiàn)部分修飾現(xiàn)象. 通過(guò)實(shí)驗(yàn), 我們發(fā)現(xiàn)采用本方法生產(chǎn)Tα1, 1L培養(yǎng)基可以生產(chǎn)純度為98%的目標(biāo)多肽29.5mg.

采用ELP融合蛋白方法生產(chǎn)Tα1, 表達(dá)量較高, 并且下游純化簡(jiǎn)便易行, 為基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)Tα1打下了基礎(chǔ).

[1]Low TL, Goldstein A. The chemistry and biology of thymosin II: Amino acid sequence of thymosin alpha 1 and polypeptide beta[J]. J Biol Chem, 1979,254(3): 987～995

[2]Hadden J W. Aspects of the immunopharmacology of thymosin αl [J]. Clinical and Applied Immunology Reviews, 2001, 1: 187～191

[3]Amarapurkar D, Das H S. Thymosin alpha in the treatment of chronic hepatitis B: an uncontrolled open-label trial [J]. Indian J Gastroenterol, 2002, 21(2):59～61

[4]Lau G K, Nanji A, Hou J, et al. Thymosin-alpha1 and famciclovir combination therapy activates T-cell response in patients with chronic hepatitis B virus infection in immune-tolerant phase [J]. Viral Hepat, 2002, 9(4): 280～287

[5]Anfreone P, Cursaro C, Gramenzi A, et al. In vitro effect of thymosin alpha1 and interferon alpha on Th1 and Th2 cytokine synthesis in patients with chronic hepatitis C [J]. J Viral Hepat, 2001, 8:194～201

[6]Moscarella S, Buzzelli G, Romanelli RG, et al. Interferon and thymosin combination therapy in navie patients with chronic hepatitis C: preliminary results[J]. Liver, 1998, 18:366～369

[7]Rasi G, Terzoli E, Izzo F, et al. Combined trement with thymosinα1 and low-dose interferon-alpha after dacarbazine in advanced melanoma[J]. Melanoma Res, 2000, 10 (1):1～4

[8]Enrico G, Francesca P, Paola S V, et a1. Thymosin RI in combination with cytokines and chemotherapy for the treatment of cancer [J]. International Immunopharmacology, 2003, 3(8): 1145～1150

[9]Sun Z Y, Zhu ZH H, Chen J Y, et a1. Express, purification and Characterization of Recombinant Human Thymosin α1[J]. Journal of Nanjing University(Natural Sciences), 2004, 40 (1): 49～57

[10]JIN Ming-fei, XU Wei-don, HUANG Jin, et a1. High Level Prokaryotic Expression of Thymosin od by Gene Repeats [J]. China Biotechnology, 2007, 27(1): 11～15

[11]Hongqing Fang , Xu Zhang, Lin Shen. RimJ is responsible for Nα-acetylation of thymosin α1 in Escherichia coli [J]. Appl Microbiol Biotechnol (2009)84: 99～104

[12]Roman S. Esipov1, Vasily N. Stepanenko, Ksenia A. Beyrakhova, et a1. Production of thymosin α1 via non-enzymatic acetylation of the recombinant precursor [J]. Biotechnol. Appl. Biochem. (2010)56:17～25

[13]Ashutosh Chilkoti, Matthew R. Dreher, Dan E. Meyer. Design of thermally responsive, recombinant polypeptide carriers for targeted drug delivery [J].Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002): 1093～1111

[14]Mahmoud Reza Banki, Liang Feng, David W Wood. Simple bioseparations using self-cleaving elastin-like polypeptide tags[J]. Nature Methods. (2005)9:659～661

[15]Wan-Yi Wu, Courtney Mee, Filomena Califano. Recombinant protein purification by self-cleaving aggregation tag[J]. Nature Protocols. (2009)1:2257～2262

[16]ZHANG Ying, LIU Yu-le , TIAN Bo. The Change of Fusion hIL -11 Cutting Site and Purification of rh IL -11 [J]. Chin. J. Biochem. Mol. Biol. 2000, l(16): 6～9