雙熒光素酶報告法驗證乳腺癌中l(wèi)ncRNA PVT1 為let-7c-5p的靶基因

張碩 沈泳 高秀飛 謝小紅

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼且以單鏈形式存在的RNA，通過互補配對至靶mRNA 的3′UTR，形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，可以降解靶標(biāo)mRNA 或者抑制mRNA 翻譯。Let-7 是發(fā)現(xiàn)最早的一種miRNA，家族基因在多種癌癥中扮演著抑癌基因的角色，如Let-7c-5p 能夠負(fù)調(diào)控Myc、HMGA2 以及BclxL 等具有致癌作用的基因，抑制前列腺癌細胞的生長[1]、肺癌細胞的遷移和侵襲以及結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移等[2-3]。Let-7c-5p 在乳腺癌患者血清中的表達水平明顯低于正常人，在乳腺癌組織中，也呈低表達[4]。并且在雌激素受體-α（estrogen receptor-α，ER-α）呈陽性的乳腺癌患者中，表達水平相對較高的患者預(yù)后更好[5]，這意味著let-7c-5p在乳腺癌中很可能也是作為腫瘤抑制因子而存在。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200 個核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，異常表達會擾亂基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損傷或神經(jīng)功能障礙[6]，還與許多疾病甚至腫瘤具有相關(guān)性[7]。漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于人類第8 號染色體上，已在多種癌癥中被證實扮演癌基因的角色[8]。TCGA 數(shù)據(jù)庫中近2500 例乳腺癌患者的基因芯片結(jié)果顯示，22%的患者PVT1 呈現(xiàn)基因拷貝數(shù)擴增趨勢，總生存率明顯低于基因拷貝數(shù)未發(fā)生改變者，表明在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的致癌作用[9-10]。競爭性內(nèi)源RNA 學(xué)說認(rèn)為lncRNA 上有miRNA 的結(jié)合位點，可以作為miRNA 的靶標(biāo)來吸收miRNA，從而減弱miRNA 對靶mRNA 的抑制作用。本研究探索在乳腺癌中l(wèi)ncRNA 漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）是否為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人乳腺癌細胞株MCF-7 購自于上海市中科院細胞庫。E.coli DH5α 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Takara 寶生物工程（大連）有限公司（批號：D9057、RR014A）；pRL-TK 載體質(zhì)粒、pGL3 對照質(zhì)粒以及雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega 公司（批號：E2241、E1751、E1910）；SanPrep 柱式DNA 割膠回收試劑盒購自美國Axygen 公司（批號：AP-GX-50）；細胞RNA 提取試劑盒DNA/RNA/Protein Isolation Kit 購自美國Omega Bio-tek 公司（批號：R6734-01）；胎牛血清購自美國Gibco 公司（批號：10100-147）；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：GNM12800）；細胞轉(zhuǎn)染試劑購自美國Biomiga 公司（批號：GT1211-02）；let-7c-5p mimics 以及對照miR-NC mimics 于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司定制。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌中PVT1 表達水平檢測 為明確PVT1 在乳腺癌中的作用，使用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫[9-10]對TCGA 數(shù)據(jù)庫中收錄的1097 例乳腺癌患者的1100 例標(biāo)本中l(wèi)ncRNA PVT1 表達情況進行檢測，發(fā)掘出PVT1 異常表達的患者數(shù)，進一步使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫[11]對患者癌變組織中PVT1 表達水平與正常組織中PVT1 的表達量進行比較。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測作用位點 利用RNAhybrid[12]和RegRNA[13]軟件預(yù)測PVT1 序列上let-7c-5p 的結(jié)合位點，綜合兩個軟件預(yù)測結(jié)果選取目的結(jié)合位點。

1.2.3 總RNA 的提取及目的產(chǎn)物擴增 MCF-7 細胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的細胞，使用DNA/RNA/Protein Isolation Kit 試劑盒提取總RNA，提取步驟參照說明書。PVT1 原序列PVT1（Pw）擴增引物如下：上游引物5′-GCTCTAGAATCTTCAGTGGTCTGGGGAATAACG-3′，下游引物5′- ATAAGAATGCGGCCGCCTCTCTCCAAATCTCAGTGTC-3′，其中上游引物5′端增加XbaⅠ酶切位點及其保護堿基，下游引物5′端增加NotⅠ酶切位點及其保護堿基。采用重疊延伸PCR 敲除結(jié)合位點序列，從而擴增得到PVT1 突變序列（Pm）。結(jié)合位點上游序列Pm1 的上游引物與Pw 相同，下游引物5′- CACCTCGGGACCTAGCTGAGCG-3′；結(jié)合位點下游序列Pm2 的上游引物5′-GCTCAGATGGGTCCCGAGGTGCG-3′，下游引物與Pw 相同。以Pm1 和Pm2為混合模板擴增Pm，引物與Pw 引物一致。

取500ng 總RNA，以Pw 的下游引物為特異引物進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)條件為42℃60min，70℃15min。取2μl cDNA 作為為模板，采用20μl 體系擴增Pm1、Pm2、Pm 和Pw。Pm1 和Pm2 擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃30s，65℃30s，72℃20s，34 個循環(huán)，72℃5min；Pw 和Pm 擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，34 個 循 環(huán)，72℃5min。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 對Pw、Pm 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收使用SanPrep 柱式DNA 割膠回收試劑盒。取割膠回收產(chǎn)物以及pRL-TK 載體質(zhì)粒進行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，將雙酶切產(chǎn)物進行電泳并回收。目的片段與載體質(zhì)粒摩爾比7∶1，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli DH5α 中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)12h，挑取單菌落進行搖床培養(yǎng)。12h 后收集菌體，提取質(zhì)粒，進行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切驗證，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染及檢測 MCF-7 細胞培養(yǎng)同1.2.3。提取對照質(zhì)粒pGL3、重組質(zhì)粒pRL-TK-Pw 和pRL-TKPm。分為3 組進行轉(zhuǎn)染，實驗組：pGL3、pRL-TK-Pw、let-7c-5p mimics；對照組1：pGL3、pRL-TK-Pw、miR-NC mimics；對照組2：pGL3、pRL-TK-Pm、let-7c-5p mimics。每組共轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒40ng，重組質(zhì)粒800ng，mimics終濃度為20nmol/L，每組設(shè)3 個復(fù)孔。48h 后裂解細胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒進行檢測?；瘜W(xué)發(fā)光儀測出各孔數(shù)據(jù)后減去空白孔的基底信號，以pGL3 質(zhì)粒所發(fā)的螢火蟲熒光信號為對照，重組質(zhì)粒pRL-TK-Pw 以及pRL-TK-Pm 所發(fā)的海腎熒光信號除以螢火蟲熒光信號為相對熒光活性，對各組數(shù)據(jù)進行歸一化分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中PVT1 表達水平檢測結(jié)果1097 例乳腺癌患者中，21%的患者檢測出了PVT1 異常高表達，而這1097 例患者中PVT1 表達水平顯著高于114 例對照組樣本中的表達量（P＜0.001），見圖1。

圖1 乳腺癌患者中PVT1 表達情況（a：PVT1 在21%的乳腺癌患者中高度表達；b：乳腺癌和正常樣本中PVT1 的表達）

2.2 結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果RNAhybrid 軟件預(yù)測顯示PVT1 上614～636nt 為let-7c-5p 結(jié)合位點，見圖2a；RegRNA 軟件預(yù)測顯示607～629nt 為結(jié)合位點，見圖2b。綜合兩個軟件預(yù)測結(jié)果，從原序列上敲除607～636nt 來構(gòu)建突變序列。

圖2 PVT1 序列上let-7c-5p 的潛在結(jié)合位點（a：RNAhybrid 預(yù)測的結(jié)合位點；b：RegRNA 預(yù)測的結(jié)合位點。）

2.3 目的產(chǎn)物PCR結(jié)果對Pm1、Pm2、Pm 和Pw 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3 所示。Pw 長度為493bp，Pm1 長度為310bp，Pm2 長度為174bp，Pm長度為463bp。對于條帶不單一的產(chǎn)物，利用割膠回收的方法獲得目的片段，再以此為模板進行二次PCR。

圖3 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果（a：Pw；b：Pm1；c：Pm2；d：Pm。M：DNA marker）

2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果對Pw、Pm 以及pRL-TK 載體質(zhì)粒進行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，再進行電泳并回收目的條帶，pRL-TK 載體雙酶切產(chǎn)物為4039bp，Pw 和Pm 雙酶切產(chǎn)物分別為469bp 和439bp，見圖4。連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素LB 固體培養(yǎng)基，12h 后挑取單菌落進行搖床培養(yǎng)。收集菌體，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證及測序驗證，驗證結(jié)果表明結(jié)合位點序列敲除成功。雙酶切驗證結(jié)果見圖5。

圖4 pRL-TK 雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果（a：pRL-TK 載體雙酶切電泳結(jié)果，M：1kb DNA ladder，1：pRL-TK 載體雙酶切產(chǎn)物；b：Pw 和Pm 雙酶切產(chǎn)物，M：DL500 DNA Marker，1：Pw 酶切產(chǎn)物；2：Pm 酶切產(chǎn)物）

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切驗證結(jié)果（M1：DL500 DNA Marker；M2：1kb DNAladder；1、2：pRL-TK-Pm 酶切產(chǎn)物；3、4：pRL-TK-Pw 酶切產(chǎn)物）

2.5 雙熒光素酶活性分析 分析結(jié)果顯示，對照組1中轉(zhuǎn)染對照基因miR-NC mimics 后，pRL-TK-Pw 的熒光活性正常，并未受到抑制；而實驗組中轉(zhuǎn)染let-7c-5p mimics 后，pRL-TK-Pw 的熒光活性受到了明顯的抑制，降至對照組1 的62%（P=0.002），表明PVT1 原序列上存在let-7c-5p 的結(jié)合位點。對照組2 中共轉(zhuǎn)染let-7c-5p mimics 和pRL-TK-Pm 后，pRL-TK-Pm 的活性未受到抑制，表明結(jié)合位點被成功敲除，也進一步說明PVT1為let-7c-5p 的靶基因，見圖6。

圖6 雙熒光素酶活性分析（注：與對照組1 比較，**P＜0.01）

3 討論

2011 年Salmena 等[14]提出競爭性內(nèi)源RNA 假說，表明lncRNA 上存在miRNA 結(jié)合位點，可以與mRNA競爭miRNA，從而形成一個大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在一定穩(wěn)定性，穩(wěn)定性被破壞則會引起疾病甚至腫瘤的發(fā)生。近年來，大量研究證實了競爭性內(nèi)源RNA 的調(diào)控機制，如癌基因lncRNA H19 在結(jié)直腸癌中過度表達能夠促進結(jié)直腸上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有活動能力的間質(zhì)細胞，并獲得侵襲和遷移能力，進一步研究發(fā)現(xiàn)H19 可以通過其序列中的miRNA 結(jié)合位點來結(jié)合miR-200a，從而減弱miR-200a 對其靶基因E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）和ZEB2 的抑制作用，而ZEB1 和ZEB2 是上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，可見H19 可以以競爭性內(nèi)源RNA 形式發(fā)揮致癌作用[15]。競爭性內(nèi)源RNA 的提出更加全面地闡明了疾病或者癌癥發(fā)生發(fā)展過程中基因間的相互作用，也證明非編碼RNA 的存在并不是無意義的，它們可以通過多種方式影響mRNA的表達或翻譯，從而調(diào)控生物學(xué)行為。

研究表明，lncRNA PVT1 具有致癌作用，其在胃癌組織中的表達量顯著高于對應(yīng)的癌旁組織，其高表達與患者的腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，PVT1 的高表達常常意味著較差的預(yù)后，在胃癌細胞中干擾其表達能夠有效地抑制胃癌細胞增殖并且能夠誘導(dǎo)細胞凋亡[16]。Zhang 等[17]還發(fā)現(xiàn)，PVT1 在胃癌中高表達會導(dǎo)致順鉑耐藥的產(chǎn)生，明顯干擾治療效果。在非小細胞肺癌中也發(fā)現(xiàn)PVT1 表達呈上調(diào)趨勢，且其表達與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，在非小細胞肺癌細胞中干擾PVT1的表達，則細胞增殖、侵襲以及遷移能力均受到抑制[18]。另外，PVT1 高表達的胰腺癌患者具有更短的總生存期[19]。Ergun 等[20]研究還證實，PVT1 可以通過抑制細胞正常凋亡來促進乳腺癌的發(fā)生。在本研究中通過cBio-Portal 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫探索大量乳腺癌樣本中PVT1的表達情況，發(fā)現(xiàn)超過20%的乳腺癌患者中PVT1 呈異常高表達，且乳腺癌組織中PVT1 的表達量明顯高于對照的正常組織，意味著在乳腺癌中PVT1 很可能也扮演著致癌基因的角色，且其具有成為乳腺癌診斷的生物標(biāo)志物的潛力。

既往研究表明，抑癌基因let-7 家族成員let-7c-5p在乳腺癌患者血清和乳腺癌組織中的表達量均低于正常對照樣本中，且提高let-7c-5p 的表達量會抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，表明let-7c-5p 在乳腺癌中具有抑癌作用[4，21]。結(jié)合競爭性內(nèi)源RNA 假說，筆者推測致癌基因PVT1 可能為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因，通過軟件預(yù)測出PVT1 序列上let-7c-5p 的結(jié)合位點，并應(yīng)用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對其進行了驗證，結(jié)果顯示let-7c-5p 能夠抑制含PVT1 原序列的熒光素酶載體活性，但對含PVT1 突變序列的熒光素酶載體活性則無抑制作用，該結(jié)果證實了PVT1 為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因。筆者由此推論出PVT1 可以與let-7c-5p 的靶mRNA 競爭，從而保護靶mRNA 免受降解或抑制，所以PVT1 的高表達能夠造成let-7c-5p 抑癌能力的下降，該研究結(jié)果表明在乳腺癌中l(wèi)ncRNA PVT1 可以以競爭性內(nèi)源RNA 的角色發(fā)揮作用。

本實驗中采用了最典型的MCF-7 細胞作為模式細胞進行研究，進一步研究還需要在更多乳腺癌細胞中對該機制進行驗證。此外，每個lncRNA 都能夠結(jié)合多個miRNA，每個miRNA 也能被多個lncRNA 結(jié)合，本研究只是探究了其中的一小部分，乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)基因間的相互作用機制仍然需要被繼續(xù)深入探索，才能為乳腺癌的早期診斷、靶點治療、基因治療以及更好的預(yù)后等提供更加有力的基礎(chǔ)依據(jù)。