感受態(tài)
- 銀杏胚乳不同發(fā)育時期生理代謝變化與其胚性感受態(tài)的相關(guān)性研究
力稱為植物胚性感受態(tài)，它的高低直接決定了能否成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚及難易程度[4]。胚性感受態(tài)受外植體的分化狀態(tài)及外植體類型的影響較大，分化程度越低的細(xì)胞去分化能力越強(qiáng)，就越易形成胚性愈傷組織；外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強(qiáng)弱[9-10]。研究表明，未成熟胚(合子胚的原胚)的胚性感受態(tài)明顯強(qiáng)于其他階段[11]。目前全世界已有多種高等植物通過離體培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚，落葉松(Larixgmelinii)、火炬松(Pinustaeda
- 高溫脅迫下匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫的構(gòu)建與鑒定
菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000 倍，均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL，第2 天計數(shù)，用于后續(xù)的結(jié)果分析，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。1.2.5 制備Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞 取Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞在YPDA 培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d。挑取生長出來的單菌落于液體YDPA 培養(yǎng)基中震蕩，待OD600值到0.5 左右時，離心后傾析上清液，使用ddH2O 將其重懸，再次離心后使用TE
河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2022年5期2022-11-21
- 擬南芥ProWRKY12-GUS轉(zhuǎn)基因植株的 構(gòu)建及其染色分析
桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕吹打混勻,冰上放置30 min,在42 ℃ 金屬浴中熱激60 s,再放置于冰上靜置 2 min。在熱激后的感受態(tài)中加入無抗性的600 μL LB 液體培養(yǎng)基,放在 37 ℃ 恒溫?fù)u床中低速振蕩培養(yǎng) 1.5 h。待培養(yǎng)完成后,涂布于添加了壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上。平板倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取培養(yǎng)基上的單菌落,接種于添加了壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中,
- 擬南芥LecRK Ⅳ.3胞內(nèi)激酶域的原核表達(dá)、純化及鑒定
料大腸桿菌克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α,表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21,Rosetta,BL21(AI),Rosetta(DE3)pLysS,OverExpress C43(DE3)和pET-30a載體；BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 ku)、化學(xué)發(fā)光的底物(Dura)(美國：Thermo Fisher Scientific)；基因克隆Pfu高保真酶(中國：北京全式金生物)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、PCR產(chǎn)物膠回收
河北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版） 2022年5期2022-09-20
- 鼠傷寒沙門菌CVCC541 rhs 基因內(nèi)部元件缺失株的構(gòu)建及其功能
VCC541 感受態(tài)的制備及 pKD46 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 將 CVCC541菌液37℃，200 r/min 搖至D600≈0.8，在冰中放置30 min后分裝至 50 mL 離心管，4℃、5 500 r/min 離心 5 min，棄掉上清后加入 20 mL 預(yù)冷的10%甘油，重懸后4℃、5 500 r/min 離心 5 min，重復(fù) 3 次后用 800 μL LB 重懸并分裝至預(yù)冷的 1.5 mL EP 管中，每支 100 μL。將 5 μL pKD46 加
中國獸醫(yī)學(xué)報 2022年4期2022-06-17
- 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化體系的建立
培養(yǎng)階段、不同感受態(tài)細(xì)胞濃度、不同感受態(tài)細(xì)胞量、不同質(zhì)粒體積、不同轉(zhuǎn)化電壓等電擊轉(zhuǎn)化條件對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行探索，為建立該菌株的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系及后續(xù)分子遺傳學(xué)研究及工程菌株改造奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材 料1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2由北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)專業(yè)實驗室保存；帶有GFP標(biāo)記的穿梭質(zhì)粒pGFP78(四環(huán)素抗性)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系王琦教授惠贈。1.1.2 供試試劑及培養(yǎng)基 抗生素(10 μg/mL)：四環(huán)
北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 2022年1期2022-03-10
- 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對乳酸乳球菌進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記
L。乳酸乳球菌感受態(tài)洗滌緩沖液Ⅰ：體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、0.5 mol/L 蔗糖；洗滌緩沖液Ⅱ：體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、0.5 mol/L蔗糖和0.05 mol/L EDTA；洗滌緩沖液Ⅲ：100 mmol/L 乙酸鋰二水、10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、0.6 mol/L 蔗糖、1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)[19]。1.1.3 酶及試劑盒PremixTaqTM酶、DNA限制性內(nèi)切酶，大連寶生物
食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年2期2022-02-22
- 大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)＊
2）細(xì)胞與質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ、BL21購于上海生工生物工程有限公司；nNOS-pME18S質(zhì)粒由本室保存。1.2 方法（1）引物設(shè)計與合成，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。表1 引物序列（2）CaM-nNOS重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以nNOS（全長）-pME18S重組子為模板，PCR擴(kuò)增CaM-nNOS cDNAs（2040bp～2400bp），用1.5%瓊脂糖凝膠純化目的基因。在連接酶的作用下與pGEM-T vector相連
中國科技縱橫 2022年24期2022-02-10
- 基于游離質(zhì)粒的木糖誘導(dǎo)型枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立及其應(yīng)用
成轉(zhuǎn)化；②自然感受態(tài)法[5]。通過控制芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，將枯草芽孢桿菌從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，生長到特定的生長階段，形成感受態(tài)；③電擊轉(zhuǎn)化法[6]。在瞬時的電脈沖下，菌體上形成小孔，使DNA分子進(jìn)入。這些方法普遍流程繁瑣，對操作技術(shù)要求極高，難以大面積推廣。芽孢桿菌的自然感受態(tài)是細(xì)胞易于吸收外源DNA的一個特定理化狀態(tài)[7]，主要由ComX和CSF信息素組成的菌體密度感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)[8?10]，其中ComK是一個全局調(diào)控因子，能激活晚
生物技術(shù)進(jìn)展 2021年6期2021-12-01
- 包涵體重組蛋白不同純化方法的比較
菌株及質(zhì)粒 感受態(tài)E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；全長IL-1β與全長IL-1Ra重組質(zhì)粒［9］（以下簡稱IL-1β-1Ra-2重組質(zhì)粒）、全長IL-1Ra重組質(zhì)粒由吉林大學(xué)人獸共患病細(xì)菌室保存。1.2 主要試劑 IPTG購自北京博奧拓科技有限公司；KCl、NaH2PO4及Na2HPO4購自北
中國生物制品學(xué)雜志 2021年7期2021-07-20
- 利用基因工程獲取紅色熒光大腸桿菌*
理后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞能吸收周圍環(huán)境中的DNA 分子，利用熱激法可將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞。目的基因隨著重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化[3]。本實驗采用的質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌能在含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中存活，并且目的基因可表達(dá)出紅色熒光蛋白，以上2 點均為篩選轉(zhuǎn)化成功大腸桿菌的依據(jù)。2 實驗儀器和材料儀器與耗材：恒溫水浴鍋、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、電子秤、錐形瓶、酒精燈
生物學(xué)通報 2021年8期2021-07-01
- 唾液乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化研究
.3唾液乳桿菌感受態(tài)制備唾液乳桿菌挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。按1%接種量接入50 mL SGMRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)一定時間后將菌液移入預(yù)冷的50 mL離心管，4 ℃ 6 000 g，離心10 min，收集菌體，棄上清。緩沖液Ⅰ洗滌菌體，4 ℃，6 000 g，離心10 min，棄上清。該步驟重復(fù)2次。用1 mL緩沖液Ⅱ重懸菌體，按每管100 μL分裝至1.5 mL EP管，-80 ℃凍存。接種于SGMRS培養(yǎng)基的菌液分別培養(yǎng)至O
工業(yè)微生物 2021年3期2021-06-30
- 噬菌體納米抗體展示庫構(gòu)建中電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
環(huán)境的影響下，感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同，故轉(zhuǎn)化效率也存在差異，因此，應(yīng)該根據(jù)實際情況，對電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而探索最佳轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素頗多，除了細(xì)菌的生長狀態(tài)及外源物質(zhì)的質(zhì)量外[6]，電壓影響細(xì)胞膜的穿透性或外源分子與細(xì)胞膜的融合[7]，T4 DNA連接酶也會降低轉(zhuǎn)化效率[8]。此外，電轉(zhuǎn)化結(jié)果受到眾多因素的綜合影響，實際上各個因素不是孤立存在的，而是相互聯(lián)系、相互作用的。為此，本研究旨在利用Bio-Rad公司的電
寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2021年5期2021-06-22
- 酵母雙雜交篩選與小麥黃花葉病毒P2互作的寄主因子
iacoli)感受態(tài)Mac1-T1 Competent Cell、DH5α農(nóng)桿菌感受態(tài)。DH10B、Y187購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。1.2 試驗方法1.2.1 小麥cDNA構(gòu)建文庫是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法進(jìn)行構(gòu)建。并運用Trizol方法[19]，提取總的小麥RNA并融解在RNase-free H2O中，用超微量分光光度計儀器測量RNA的純度與濃度。分離純化后，根據(jù)Fast Tra
浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2021年3期2021-04-01
- 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的建立及驗證
liTop10感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒，用測序引物pKD_Seq5測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pKDsgRNA-kan-DwaaL。1.5waaL基因同源修復(fù)供體DNA片段的擴(kuò)增以E.coliW3110基因組為模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶PCR擴(kuò)增片段3和片段4。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后，以DwaaL-1F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高
中國獸醫(yī)學(xué)報 2021年1期2021-03-10
- 棉花角斑病菌V8高效電轉(zhuǎn)化條件的探索
中期的V8制備感受態(tài)細(xì)胞;保證電壓2.1 kV、50 μg/mL質(zhì)粒7μL、4℃預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基SOC、振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)4-5 h時，V8的電轉(zhuǎn)化效率高達(dá)5×102/μg DNA。關(guān)鍵詞：棉花角斑病菌[Xanthmona scampestris pv.malvacearum （Xcm） ]V8;菌株馴化;電轉(zhuǎn)化條件;電轉(zhuǎn)化效率中圖分類號：Q78;S435.621.2+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（ 2020）12-0175-04D01：10.14
湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年12期2020-08-28
- His-prescission蛋白酶基因在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化
1菌種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，BL21(DE3)-T1R，北京天根生化科技有限公司；Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，上海拜力生物科技有限公司。1.2 試劑及儀器核酸蛋白測定儀，賽默飛世爾科技公司；雙穩(wěn)定電泳儀，北京六一儀器廠；干浴微量恒溫器、脫色搖床，其林貝爾儀器制造有限公司；紫外分光光度計，上海優(yōu)尼柯有限公司；雙層試管搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。1.3質(zhì)粒的提取及菌種的轉(zhuǎn)化①含His-
安徽化工 2020年3期2020-07-01
- 產(chǎn)蛋主要基因?qū)ψ样Z產(chǎn)蛋性能的影響研究
轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，擴(kuò)增培養(yǎng)后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對。將酶切后的FSH、PRL、INH基因進(jìn)行回收，將FSH基因與與pcDNA3.0載體相連接，PRL、INH基因與pET-32a載體連接，將重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將重組pcDNA3.0-FSH轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，擴(kuò)增培養(yǎng)
吉林畜牧獸醫(yī) 2020年4期2020-06-02
- 基于退火緩沖液的SLiCE無縫克隆方法的改良
于高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞，例如Zhang等［7］采用1×1010CFU/μg電轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞和1×109CFU/μg的化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞，Motohashi［13］則采用的是1×108CFU/μg化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞。商業(yè)化的高感受態(tài)細(xì)胞價格不菲，但自制高感受態(tài)細(xì)胞工序較為繁瑣，且轉(zhuǎn)化效率往往不穩(wěn)定，因此很多無縫克隆方法建立時都考慮到了感受態(tài)細(xì)胞效率這個因素［6，14］。對于無縫克隆的高感受態(tài)細(xì)胞依賴問題，Zhang等［7］將λ噬菌體Red
生物技術(shù)通報 2020年2期2020-02-22
- 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀
5000)1 感受態(tài)細(xì)胞的起源、概念及原理1970年MANDEL和HIGE[1]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)CaCl2溶液處理時能夠吸收λ噬菌體DNA，細(xì)胞這種能夠吸收DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)。使用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，改變細(xì)胞膜狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞膜表面性狀發(fā)生暫時性改變，方便外源基因或者載體進(jìn)入受體細(xì)胞，這種處于最適攝取和容納外來DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)。由于細(xì)胞膜具有流動特性，細(xì)胞膜通透性隨后會逐漸自動修復(fù)。轉(zhuǎn)化(tra
河北北方學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版） 2020年8期2020-01-18
- 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除大腸桿菌tnaA基因
oliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒，用測序引物gRNAP F/gRNAP R測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pTargetF-tnaA。本研究所用引物和gRNA寡核苷酸序列見表1。表1 gRNA和引物1.4 tnaA基因同源修復(fù)供體 DNA的構(gòu)建以E.coliw3110-Δ基因組DNA為模板，tnaA L F、tnaA L R為引物，PCR擴(kuò)增獲得片段1，以tnaA R F、tnaA R R為引物，PCR擴(kuò)增獲得片段2。以AmlF和AmlR為引物，將片段1
生物學(xué)雜志 2019年6期2019-12-19
- 細(xì)菌遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移有哪些方式
態(tài)被稱為細(xì)菌的感受態(tài)。有些細(xì)菌自誕生的時候就處于感受態(tài)的環(huán)境中，而有一些則需要外界的特殊刺激才能轉(zhuǎn)變?yōu)?span id="j5i0abt0b" class="hl">感受態(tài)，這也把細(xì)菌的感受態(tài)分成了自然感受態(tài)和人工感受態(tài)兩種。不同種類的細(xì)菌實現(xiàn)感受態(tài)的方式也不盡相同，例如本身就可以實現(xiàn)感受態(tài)轉(zhuǎn)變也就是自然感受態(tài)的細(xì)菌代表有枯草芽孢桿菌，而需要通過人工干擾才能實現(xiàn)感受態(tài)的細(xì)菌典型代表是大腸桿菌，一種在生活中尤其常見的細(xì)菌。細(xì)菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化方式的不同還取決于對外部環(huán)境的反應(yīng)，在自然界的生態(tài)系統(tǒng)中，大部分細(xì)菌都是來源于土壤之
學(xué)習(xí)與科普 2019年17期2019-09-10
- 申克孢子絲菌STE20基因RNA干擾菌株的構(gòu)建方法
活，冰上冷卻。感受態(tài)細(xì)胞的制備 將DH5α菌保接到LB液體培養(yǎng)基中，將接菌后的試管于溫度37℃，220 r/min，培養(yǎng)16 h。然后轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基中(按約1∶100的量轉(zhuǎn)接)，220 r/min，37℃培養(yǎng)到OD6000.6。然后，將培養(yǎng)物加到50 mL離心管中冰上預(yù)冷10 min。4℃，4000 r/min離心5 min，棄去上清。用預(yù)冷30 mL的CaC12(0.l mol/L)重懸，冰上放置30 min，然后，4℃，4000 r/
中國真菌學(xué)雜志 2019年3期2019-07-10
- 枯草芽孢桿菌ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)及其潛在生防應(yīng)用
體的群集運動、感受態(tài)的形成、抗生素的合成、γ-聚谷氨酸的合成、生物膜的形成和致病基因的表達(dá)等細(xì)胞行為。這種對群體密度刺激做出反應(yīng)的基因調(diào)控系統(tǒng)稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)系統(tǒng)[2-5]。對近年來枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中感受態(tài)調(diào)控系統(tǒng)ComQXPA(Com是compotence的縮寫)的組成、系統(tǒng)在菌體生長繁殖過程中的重要調(diào)控機(jī)制、枯草芽孢桿菌作為生防菌在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并針
河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期2019-06-28
- 肉葡萄球菌電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
壁較厚且致密，感受態(tài)細(xì)胞接收外源載體困難，常規(guī)的熱激轉(zhuǎn)化法幾乎無法使外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞．目前，肉葡萄球菌的外源 DNA轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法和電轉(zhuǎn)化方法．原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法操作復(fù)雜、花費時間較長且轉(zhuǎn)化效率較低，而電轉(zhuǎn)化法操作簡便、理論轉(zhuǎn)化效率高，因而得到廣泛的應(yīng)用[4]．電轉(zhuǎn)化法的原理是使用瞬時電壓使得細(xì)胞膜被極化而產(chǎn)生瞬時孔洞，使 DNA等外源物質(zhì)快速進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[5]．電場強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時間在一定范圍內(nèi)時，細(xì)胞的瞬時通透性是可逆的．隨著電場
天津科技大學(xué)學(xué)報 2019年3期2019-06-21
- 利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化條件
桿菌AR497感受態(tài)制備方法MRS液體培養(yǎng)過夜，3%接種量接種至含質(zhì)量濃度20 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基至OD600為0.3～0.4。 4 ℃，4 000×g離心棄上清，體積分?jǐn)?shù)為10%甘油洗滌2次并重懸分裝[7]。每管分裝100 μL保藏-80 ℃，電轉(zhuǎn)化備用。1.3 發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)效率檢測及鑒定方法取一定量質(zhì)粒與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷無菌的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置好電轉(zhuǎn)參數(shù)后電擊。電擊完畢后，立即加入900 μL液體復(fù)蘇培養(yǎng)基
食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年7期2019-05-07
- 嗜熱鏈球菌的電轉(zhuǎn)化條件
ophilus感受態(tài)細(xì)胞的影響按1%的接種量將S.thermophilussp1.1接入含有不同濃度甘氨酸的培養(yǎng)基(甘氨酸質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 g/L)中進(jìn)行培養(yǎng)，測定其12 h的生長曲線，以甘氨酸0 g/L的為對照。1.3.3 菌體生物量對電轉(zhuǎn)化率的影響按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，收集OD600為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的菌體，制備S
食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年6期2019-04-04
- 副豬嗜血桿菌高自然轉(zhuǎn)化效率菌株的篩選及全基因組測序
細(xì)菌被稱作自然感受態(tài)細(xì)菌(naturally competent bacteria)[11-12]。HPS同樣展現(xiàn)出了自然轉(zhuǎn)化的能力[5]。自2004年Bigas等[13]以該菌自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基礎(chǔ)，創(chuàng)建了一套在HPS上的基因操作技術(shù)，借此構(gòu)建該菌的基因缺失株來研究相關(guān)基因功能，HPS自然轉(zhuǎn)化的應(yīng)用便推廣開來。與接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生很少受到外源DNA的影響及轉(zhuǎn)化方法的局限，如感受態(tài)細(xì)菌的制備。自然轉(zhuǎn)化只與受體菌的誘導(dǎo)相關(guān),且操作相對簡單[14]
畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2018年11期2018-11-30
- 藍(lán)桿藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脫羧酶的克隆與表達(dá)
21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后得到表達(dá)菌株。搖瓶培養(yǎng)表達(dá)菌株經(jīng)阿拉伯糖和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后純化得到cce4227重組蛋白。本研究為進(jìn)一步闡明cce4227蛋白的催化功能及機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株和載體 試驗于2017年11月至2018年1月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院分子生物學(xué)實驗室完成。pTf16分子伴侶質(zhì)粒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET28a為筆者所在實驗室保存；藍(lán)桿藻AT
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年19期2018-11-08
- 電轉(zhuǎn)化條件對大腸桿菌TG1轉(zhuǎn)化效率的影響
環(huán)境的影響下，感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同。為提高平末端連接、轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而建立較高質(zhì)量的文庫，因此本研究通過比較不同電轉(zhuǎn)化條件下大腸桿菌TG1的轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)噬菌體展示基因文庫的建立奠定基礎(chǔ)。1 試驗材料與方法1.1 試驗材料與主要儀器大腸桿菌菌株TG1本室-80 ℃保存；pDJ01質(zhì)粒為梅西大學(xué)Jasna Rakonjac教授惠贈，-80 ℃保存；大腸桿菌TG1株購自廣州碧云天生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物有限公司。LB液體培
吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報 2018年3期2018-10-10
- 香榧幼胚發(fā)育與胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性
00）植物胚性感受態(tài)為植物細(xì)胞或組織脫分化能力或潛力，胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易程度［1］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物的組織或細(xì)胞維持高水平胚性感受態(tài)的時間極短［2-3］。胚性感受態(tài)水平的高低與基因型、外植體的取材部位、生理學(xué)年齡等密切相關(guān)［4］。在黑核桃Juglans nigra中，授粉后3～4周的幼胚開始具有體胚發(fā)生能力，授粉后6～7周時幼胚體胚發(fā)生頻率最高，此后，體胚發(fā)生能力逐漸下降［5］。在梨Pyrus中，具有胚性感受態(tài)的時間極短，
浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報 2018年5期2018-09-28
- 傳染性造血器官壞死癥重組腺病毒載體的構(gòu)建
1.2 質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞 Pad-Track-CMV穿梭載體、pAd-easy-1骨架載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DH10B感受態(tài)細(xì)胞和BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，均購自武漢金開瑞生物科技有限公司。1.1.3 試 劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Quick-Fusion快速克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶，均購自美國紐英倫生物技術(shù)(NEB)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自德國羅氏公司(Roche)；脂質(zhì)體2000，購自美國英杰生命技術(shù)有限
- 犬瘟熱病毒H、F和N基因的克隆及原核表達(dá)
rans-T1感受態(tài)、Transetta (DE3)感受態(tài)購自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自碧云天公司。（2）PCR引物。根據(jù)GenBank中發(fā)表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5軟件設(shè)計了三對特異性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR產(chǎn)物上、下游分別引入酶切位點，引物由
獸醫(yī)導(dǎo)刊 2018年7期2018-04-24
- 人參3-O-UGT1基因RNAi表達(dá)載體工程菌的構(gòu)建
本實驗室保存;感受態(tài)大腸桿菌JM109、pMD20-T載體、pBI121植物雙元表達(dá)載體、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶以及各種限制性內(nèi)切酶等，均購于寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素購自于北京鼎國生物制品有限公司。2 試驗方法2.1 RNA干擾元件核心片段的獲得由GenBank得到原人參二醇3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Pg3-O-UGT1；JX898529)序列，通過Clustal X軟件將其核
吉林大學(xué)學(xué)報（工學(xué)版） 2018年1期2018-03-10
- 響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化效率研究
發(fā)掘乳酸乳球菌感受態(tài)潛力奠定基礎(chǔ)，為提高乳酸乳球菌感受態(tài)效率提供新思路。1 材料與方法1.1 材料與試劑1.1.1 質(zhì)粒試驗所用的質(zhì)粒pNZ44 為乳桿菌穿梭質(zhì)粒。1.1.2 培養(yǎng)基GM17 培養(yǎng)基：用于乳酸乳球菌NZ9000 的活化、培養(yǎng)和活菌計數(shù)。配方為：胰蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母浸出粉2.5 g/L、β?磷酸甘油二鈉19 g/L、維生素C 0.5 g/L、MgSO40.25 g/L。固體培養(yǎng)基另
上海理工大學(xué)學(xué)報 2018年6期2018-02-25
- 松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析
2.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備挑取NEAU-ST10-39T單菌落于5 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，35℃，145 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h；按2%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h，期間注意監(jiān)測菌體OD600吸光度值；待OD600吸光度值達(dá)0.6～0.8后停止培養(yǎng)，冰浴菌液20～30 min；離心收集菌體；去除培養(yǎng)基后用20 mL去離子水重懸菌體，離心，洗滌菌體1次，去除殘
東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2017年12期2017-12-29
- 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、提取及酶切分析
腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選培養(yǎng)充分克隆，然后用堿裂解法分離提取重組質(zhì)粒DNA，最后用限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒DNA，并跑電泳鑒定。人Bcl-2基因；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；CaCl2法；質(zhì)粒提取；堿裂解法；酶切分析本研究介紹人Bcl-2重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、分離提取和內(nèi)切酶酶切鑒定。1 材料與方法1.1 試劑不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、100mg/ml氨芐氨基酸溶液、人Bcl-2重組質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、75%乙醇；堿裂解法試劑溶
保健文匯 2017年6期2017-11-02
- 枯草芽孢桿菌SCK6超級感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化
菌SCK6超級感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化李信志，盧爭輝，周玉玲，李世宇，張桂敏湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430062枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，因其安全性和高分泌特性，已被廣泛用作異源蛋白的表達(dá)宿主。然而，相比大腸桿菌，枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率低，限制了其作為宿主的異源蛋白的定向進(jìn)化。本文通過改變培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、質(zhì)粒類型等參數(shù)優(yōu)化感受態(tài)制備的條件，利用常規(guī)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，用營養(yǎng)豐富的YN培養(yǎng)基替代
生物工程學(xué)報 2017年4期2017-05-06
- 大腸埃希菌TG1電穿孔法轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化研究
態(tài)、電場強(qiáng)度、感受態(tài)細(xì)胞濃度和體積、外源基因的質(zhì)量、甘油/甘露醇緩沖液體積等條件進(jìn)行優(yōu)化，分析了各因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示：細(xì)菌培養(yǎng)溫度為16℃，細(xì)菌生長的OD600值為0.5，密度梯度離心洗滌法，感受態(tài)細(xì)胞濃度高于1×1011/mL，并設(shè)定電場強(qiáng)度14.25 kV/cm時進(jìn)行電穿孔，轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)到9×109CFU/μg DNA。研究獲得的電轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件為高庫容文庫的構(gòu)建提供了一個重要的途徑。大腸埃希菌TG1;電穿孔轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化效率基因文庫(ge
生物技術(shù)進(jìn)展 2017年1期2017-02-20
- 格里菲斯肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的細(xì)胞機(jī)制
力的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞。這個轉(zhuǎn)化的過程大致分為三步：首先，R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞，接著感受態(tài)細(xì)胞攝取外源DNA，最后外源DNA在該細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。2.1 R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞 成為感受態(tài)細(xì)胞是攝取外源DNA的前提。肺炎雙球菌感受態(tài)的調(diào)控主要涉及五個蛋白(ComABCDE)，它們共同組成一個群體感應(yīng)系統(tǒng)。ComC編碼感受態(tài)信息素(CSP)前體，當(dāng)細(xì)胞外CSP積累到可以發(fā)生感受態(tài)臨階濃度時，與膜結(jié)合蛋白ComD結(jié)合使其磷酸化，當(dāng)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ComE上，它
生物學(xué)教學(xué) 2017年10期2017-02-18
- Ca2+和Sr2+誘導(dǎo)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)化的影響
誘導(dǎo)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)化的影響王永剛1, 孫尚琛1, 馬雪青2, 秦健宇1, 冷非凡1(1.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)為研究金屬離子誘導(dǎo)下感受態(tài)細(xì)胞形成的機(jī)理及揭示轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制，分別用Ca2+和Sr2+(0～140 mmol/L)制備大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明，不同濃度的Ca2+和Sr2+誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞的效價不同，兩種金屬離子對大
微生物學(xué)雜志 2016年2期2016-12-21
- 芍藥ITS片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選
菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）中，并利用質(zhì)粒載體上含有的β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列，使重組體在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，β-半乳糖苷酶將底物半乳糖苷（X-Gal）水解，形成藍(lán)色菌落，而有外源DNA片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌則形成白色菌落的過程。芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，有較高的觀賞和藥用價值[4,5]，但品種變異豐富，表型性狀多樣[6]，給芍藥的準(zhǔn)確分類
三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報 2016年3期2016-11-30
- 植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化
中期的細(xì)胞制備感受態(tài)，以1 g/100 mL甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑，分別用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗滌細(xì)胞，并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作為電擊液，加入20 μg穿梭質(zhì)粒，在1.5 kV和400 Ω條件下進(jìn)行電擊，可以獲得最高的電轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.18×103CFU/μg DNA，滿足后續(xù)遺傳學(xué)實驗要求。植物乳桿菌；電轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指
食品科學(xué) 2016年3期2016-11-11
- 腸出血性大腸桿菌z4832基因缺失突變株的構(gòu)建
腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1 simple載體和大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司。1.1.2 引物設(shè)計 PCR引物由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成（表1），其中U1-HindⅢ、U2-SalⅠ用于擴(kuò)增z4832基因上游500 bp同源臂（z4832-up）；D1-BamHⅠ、D2-EcoRⅠ用于擴(kuò)增z4832基因下游500 bp同源臂（z4832-down）；kana-SalⅠ、kana-BamH
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2016年8期2016-11-11
- 攜帶BARF1基因的重組巨細(xì)胞病毒的構(gòu)建
1SW102電感受態(tài)細(xì)胞的制備常規(guī)方法制備SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃保存。2.2制備含有巨細(xì)胞病毒細(xì)菌人工染色體(T-BAC)的SW102細(xì)胞將T-BAC質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)到SW102電感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1 mL LB培養(yǎng)液，32 ℃孵育1 h；離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，涂布于含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，32 ℃ 培養(yǎng)1 d后，有克隆形成，挑選4個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(用巨細(xì)胞病毒開放讀碼框UL57引物：Forward: 5′-agac
中國人獸共患病學(xué)報 2016年7期2016-08-24
- 載體濃度和感受態(tài)對大分子載體轉(zhuǎn)化效率的影響
)?載體濃度和感受態(tài)對大分子載體轉(zhuǎn)化效率的影響覃鴻妮1， 張?zhí)m蘭2(1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院,江蘇蘇州 215123；2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123)[目的]研究載體量和感受態(tài)對陽性克隆率的影響。[方法]利用引物拼接PCR技術(shù)，自行設(shè)計26條引物合成一個835 bp的目的基因，將該基因與約20 kb的大分子載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎(chǔ)上，設(shè)置50、100、150、200、250、300 n
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年17期2016-08-11
- 濫用抗生素的危害
素還會誘導(dǎo)細(xì)菌感受態(tài)的產(chǎn)生。感受態(tài)是細(xì)菌的一種容易接受外源基因片段的狀態(tài)。例如，肉類制品上如果殘留有耐藥基因片段，很容易被體內(nèi)處于感受態(tài)的細(xì)菌接受，從而造成人體細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)。廠家、藥店、醫(yī)院，受利益驅(qū)動，熱衷于生產(chǎn)、銷售、使用抗生素藥品，這是根本原因。藥監(jiān)部門監(jiān)管不力，也難辭其咎。針對目前抗生素市場流通方面存在的問題，由于無法對藥店持有的藥方進(jìn)行核實，藥監(jiān)部門開展的清查整頓效果有限。更關(guān)鍵的是科學(xué)教育和普及工作不到位，許多患者缺乏合理使用抗生素的常識，
閱讀（科學(xué)探秘） 2016年9期2016-05-30
- 對“肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗”的幾個疑難問題的解答
的細(xì)菌必須處于感受態(tài)(最易于接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種狀態(tài))，調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異性蛋白稱感受態(tài)因子，主要包括膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶等，人工條件下可用環(huán)腺苷酸(cAMP)或Ca2+處理受體菌使其處于感受態(tài)；③轉(zhuǎn)化還受到轉(zhuǎn)化因子的大小和濃度的影響。肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化(R型菌轉(zhuǎn)化為S型菌)是同種細(xì)菌不同品系間的轉(zhuǎn)化，具體過程如下：處于特定生長期的R型菌分泌感受態(tài)因子(細(xì)胞壁自溶素)，細(xì)胞壁局部缺失，使細(xì)胞表面的膜連結(jié)合蛋白和核酸
生物學(xué)教學(xué) 2016年11期2016-04-10
- 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗難點剖析
R型菌必須處于感受態(tài)。感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。它雖受遺傳控制，但表現(xiàn)卻差別很大。外界環(huán)境因子如環(huán)腺苷酸（cAMP）和Ca2＋對感受態(tài)有重要影響。如cAMP可使嗜血桿菌屬的細(xì)菌感受態(tài)水平提高1萬倍。處于感受態(tài)的R型細(xì)菌分泌感受態(tài)因子，其中有細(xì)胞壁自溶素，使R型細(xì)菌的局部細(xì)胞壁溶解掉，從而使其細(xì)胞膜表面的膜連DNA結(jié)合蛋白和核酸酶暴露出來。轉(zhuǎn)化因子是離體的DNA片段。一般原核生物的擬核是由一個大型的環(huán)狀DNA分子反復(fù)折疊
教學(xué)考試(高考生物) 2016年3期2016-04-09
- pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對肺炎鏈球菌感受態(tài)菌株耐藥性的影響▲
化對肺炎鏈球菌感受態(tài)菌株耐藥性的影響▲趙衛(wèi)東1忽勝和2楊新原2孔 山1(1 云南省大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗診斷學(xué)教研室，大理市 671000，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com；2 云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，大理市 671000)目的 探討pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對肺炎鏈球菌(SP)感受態(tài)菌株耐藥性的影響。方法 收集13株對青霉素不敏感的SP菌株，其中8株青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)編碼基因pbp2b未突變，5株pbp
廣西醫(yī)學(xué) 2016年11期2016-02-17
- DNA處理蛋白A在細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化中的作用
作用，通過限制感受態(tài)刺激因子的早期基因表達(dá)，參與細(xì)胞感受態(tài)的關(guān)閉過程。本文對DprA蛋白在細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化中的作用進(jìn)行綜述。DNA處理蛋白A；細(xì)菌；自然轉(zhuǎn)化自然轉(zhuǎn)化是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，它是細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)化的一種基因程控機(jī)制。不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等其他機(jī)制，它利用DNA攝取泵導(dǎo)入DNA，不需要額外染色體或移動因子[1]。細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化的意義：抗藥性基因在病原菌之間快速水平轉(zhuǎn)移，以自然轉(zhuǎn)化過程中攝取的外源DNA為模板，通過同源重組方式修復(fù)受損染色體，是維持遺傳多樣性
解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2015年10期2015-03-21
- 小鼠性激素結(jié)合球蛋白條件基因打靶載體的構(gòu)建
。1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備：1.2.3.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備 將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，冰上放置10 min。4℃，4 000 r/min離心10 min。棄去上清，將管倒置1 min使培養(yǎng)液流盡，用冰上預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30 min。0～4℃4 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入2 mL預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置，即可獲得DH
中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2015年3期2015-01-02
- 一種電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌方法的優(yōu)化
中，能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少，且感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低，從而限制了外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)［3］。目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡?span id="j5i0abt0b" class="hl">感受態(tài)法［4］、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法［5］和電擊轉(zhuǎn)化法［6］。其中，電擊轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而，電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系，隨著電場強(qiáng)度的增加，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等［7］以不同預(yù)培養(yǎng)時間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高
重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)) 2014年8期2014-06-27
- PAI-1啟動子序列與熒光素酶報告基因擴(kuò)增及載體連接問題分析*
濃度，膠回收，感受態(tài)質(zhì)量，LB平板質(zhì)量，內(nèi)切酶，連接時間及質(zhì)量比等問題都可增加連接成功概率。PAI-1；啟動子；熒光素酶報告基因；載體連接基因重組技術(shù)是我們在分子生物學(xué)研究中較常使用到的基本技術(shù)，也是分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)，它在現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究中應(yīng)用越來越廣泛。載體構(gòu)建是將外源性DNA目的片段通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中繁殖及表達(dá)，人工構(gòu)建為需要的目的質(zhì)粒，為進(jìn)一步實驗做基礎(chǔ)[1，2]。當(dāng)外源性DNA片段插入到相應(yīng)載體內(nèi)時，由于操作方法繁瑣，所需時間長，人為
中國醫(yī)藥指南 2014年12期2014-04-13
- 豬瘟病毒酵母雙雜交pGBKT7-NS3誘餌載體的構(gòu)建與鑒定
接酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、YPDA培養(yǎng)基、SD各種缺陷性培養(yǎng)基、酵母菌株 Y2HGold、X-α-gal、Aureobasidin A、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、c-Myc抗體為Clontech公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品。1.1.2 引物合成和設(shè)計 根據(jù)GenBank上豬瘟病毒石門株（登錄號：AF
動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2014年8期2014-03-06
- 蘇云金芽胞桿菌高效電轉(zhuǎn)化方法的建立
，質(zhì)粒加入Bt感受態(tài)細(xì)胞中很容易被降解，低濃度的質(zhì)粒直接影響了電轉(zhuǎn)化效率，而經(jīng)蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對質(zhì)粒的降解作用大大下降，顯著提高了轉(zhuǎn)化效率.研究還對電轉(zhuǎn)化相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化，包括培養(yǎng)基成分及滲透壓、培養(yǎng)時間、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電場壓、質(zhì)粒DNA的濃度等.利用該方法，在Bt中建立了一種穩(wěn)定高效的電轉(zhuǎn)化方法.1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)為本研究室選育的野生型Bt菌株.Bt菌株
湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報 2013年2期2013-10-11
- 大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率變化的研究
鑒別重組菌株。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)實驗室頻繁使用的一項重要的常規(guī)操作。對細(xì)菌而言，為達(dá)到高效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108細(xì)胞/mL。對于大多數(shù)E.coli來說，相當(dāng)于 OD600為 0.4 左右，但由于轉(zhuǎn)化是一個很復(fù)雜的過程，具體的作用機(jī)理仍在探究中。有文獻(xiàn)指出［1］，細(xì)菌的最佳感受態(tài)細(xì)胞制備期對于不同菌株是不同的，并不一定都是在活細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/mL的時候最適宜，有必要針對所使用的菌株確定其最佳轉(zhuǎn)化條件。1 材料與方法1.1 材料1.
微生物學(xué)雜志 2013年1期2013-09-12
- 采用Red重組系統(tǒng)敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因
重懸，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。取1μg p UCP－Red質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化PAO1感受態(tài)細(xì)胞，電擊條件25μF、200Ω、2.5 k V。電擊后菌液立即轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，180 r/min振搖2 h后，涂布含有羧芐青霉素（300μg/m L）的LB平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h挑取單菌落，采用PCR鑒定質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化（引物見表1）。1.4.2 PAO1lasB基因敲除株的構(gòu)建1.4.2.1 線性打靶片段的制備 線性打靶片段的構(gòu)建參照文獻(xiàn)進(jìn)行［7］。打靶片段前
中國人獸共患病學(xué)報 2013年2期2013-08-21
- 質(zhì)粒pBV220-PTD-tCNTF轉(zhuǎn)化BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞的高效制備方法
改造菌株制作為感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBV220-PTD-tCNTF，并探索其高效轉(zhuǎn)化方法。感受態(tài)細(xì)胞的制備有很多方法，通常包括物理法和化學(xué)法。物理法即電轉(zhuǎn)化法［7－8］，此種方法快速高效，但設(shè)備昂貴，技術(shù)要求高?；瘜W(xué)法中最早也最為經(jīng)典的是氯化鈣法，這種方法由Mendel［9］建立于1970年，成為實驗室制備感受細(xì)胞的一種常規(guī)技術(shù)，其后在此基礎(chǔ)上有很多改進(jìn)方法。一般認(rèn)為緩沖液中的Ca2+、Mg2+等二價陽離子可提高轉(zhuǎn)化效率，PEG在濃度為10 g·L－1分子
中國藥理學(xué)通報 2012年4期2012-02-10
- COX-2誘餌載體的構(gòu)建及其在酵母雙雜交系統(tǒng)中自激活作用的檢測
粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆作為 PCR反應(yīng)模板,用PCR的方法擴(kuò)增出目的基因。引物設(shè)計如下：COX-2 F 5′-GG A ATT CAT GCT CGC CCG CGC CCT-3′;COX-2 R 5′-CGG G AT CCC TAC AGT TCA GTC GAA CGT TCT TTTAGT AGT ACT G-3′,分別在 5′端引入酶切位點EcoRⅠ和 BamHⅠ。反應(yīng)總體積為 50μL,其中包括：COX-2 F 0.5μL,COX
首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2011年1期2011-01-25