• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    感受態(tài)

    • 銀杏胚乳不同發(fā)育時期生理代謝變化與其胚性感受態(tài)的相關(guān)性研究
      力稱為植物胚性感受態(tài),它的高低直接決定了能否成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚及難易程度[4]。胚性感受態(tài)受外植體的分化狀態(tài)及外植體類型的影響較大,分化程度越低的細(xì)胞去分化能力越強(qiáng),就越易形成胚性愈傷組織;外植體材料的基因型、發(fā)育階段以及生理狀態(tài)等決定了其胚性感受態(tài)的強(qiáng)弱[9-10]。研究表明,未成熟胚(合子胚的原胚)的胚性感受態(tài)明顯強(qiáng)于其他階段[11]。目前全世界已有多種高等植物通過離體培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚,落葉松(Larixgmelinii)、火炬松(Pinustaeda

      南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2022年4期2022-11-29

    • 高溫脅迫下匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫的構(gòu)建與鑒定
      菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000 倍,均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL,第2 天計數(shù),用于后續(xù)的結(jié)果分析,剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。1.2.5 制備Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞 取Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞在YPDA 培養(yǎng)基上劃線,30 ℃倒置培養(yǎng)3 ~5 d。挑取生長出來的單菌落于液體YDPA 培養(yǎng)基中震蕩,待OD600值到0.5 左右時,離心后傾析上清液,使用ddH2O 將其重懸,再次離心后使用TE

      河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2022年5期2022-11-21

    • 擬南芥ProWRKY12-GUS轉(zhuǎn)基因植株的 構(gòu)建及其染色分析
      桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕吹打混勻,冰上放置30 min,在42 ℃ 金屬浴中熱激60 s,再放置于冰上靜置 2 min。在熱激后的感受態(tài)中加入無抗性的600 μL LB 液體培養(yǎng)基,放在 37 ℃ 恒溫?fù)u床中低速振蕩培養(yǎng) 1.5 h。待培養(yǎng)完成后,涂布于添加了壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上。平板倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取培養(yǎng)基上的單菌落,接種于添加了壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中,

      合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2022年9期2022-10-10

    • 擬南芥LecRK Ⅳ.3胞內(nèi)激酶域的原核表達(dá)、純化及鑒定
      料大腸桿菌克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α,表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21,Rosetta,BL21(AI),Rosetta(DE3)pLysS,OverExpress C43(DE3)和pET-30a載體;BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10~170 ku)、化學(xué)發(fā)光的底物(Dura)(美國:Thermo Fisher Scientific);基因克隆Pfu高保真酶(中國:北京全式金生物);DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、PCR產(chǎn)物膠回收

      河北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2022年5期2022-09-20

    • 鼠傷寒沙門菌CVCC541 rhs 基因內(nèi)部元件缺失株的構(gòu)建及其功能
      VCC541 感受態(tài)的制備及 pKD46 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 將 CVCC541菌液37℃,200 r/min 搖至D600≈0.8,在冰中放置30 min后分裝至 50 mL 離心管,4℃、5 500 r/min 離心 5 min,棄掉上清后加入 20 mL 預(yù)冷的10%甘油,重懸后4℃、5 500 r/min 離心 5 min,重復(fù) 3 次后用 800 μL LB 重懸并分裝至預(yù)冷的 1.5 mL EP 管中,每支 100 μL。將 5 μL pKD46 加

      中國獸醫(yī)學(xué)報 2022年4期2022-06-17

    • 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化體系的建立
      培養(yǎng)階段、不同感受態(tài)細(xì)胞濃度、不同感受態(tài)細(xì)胞量、不同質(zhì)粒體積、不同轉(zhuǎn)化電壓等電擊轉(zhuǎn)化條件對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行探索,為建立該菌株的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系及后續(xù)分子遺傳學(xué)研究及工程菌株改造奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材 料1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2由北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)專業(yè)實驗室保存;帶有GFP標(biāo)記的穿梭質(zhì)粒pGFP78(四環(huán)素抗性)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系王琦教授惠贈。1.1.2 供試試劑及培養(yǎng)基 抗生素(10 μg/mL):四環(huán)

      北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 2022年1期2022-03-10

    • 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對乳酸乳球菌進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記
      L。乳酸乳球菌感受態(tài)洗滌緩沖液Ⅰ:體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、0.5 mol/L 蔗糖;洗滌緩沖液Ⅱ:體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、0.5 mol/L蔗糖和0.05 mol/L EDTA;洗滌緩沖液Ⅲ:100 mmol/L 乙酸鋰二水、10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、0.6 mol/L 蔗糖、1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)[19]。1.1.3 酶及試劑盒PremixTaqTM酶、DNA限制性內(nèi)切酶,大連寶生物

      食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年2期2022-02-22

    • 大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)*
      2)細(xì)胞與質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ、BL21購于上海生工生物工程有限公司;nNOS-pME18S質(zhì)粒由本室保存。1.2 方法(1)引物設(shè)計與合成,引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。表1 引物序列(2)CaM-nNOS重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以nNOS(全長)-pME18S重組子為模板,PCR擴(kuò)增CaM-nNOS cDNAs(2040bp~2400bp),用1.5%瓊脂糖凝膠純化目的基因。在連接酶的作用下與pGEM-T vector相連

      中國科技縱橫 2022年24期2022-02-10

    • 基于游離質(zhì)粒的木糖誘導(dǎo)型枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立及其應(yīng)用
      成轉(zhuǎn)化;②自然感受態(tài)法[5]。通過控制芽孢桿菌的培養(yǎng)條件,將枯草芽孢桿菌從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中,生長到特定的生長階段,形成感受態(tài);③電擊轉(zhuǎn)化法[6]。在瞬時的電脈沖下,菌體上形成小孔,使DNA分子進(jìn)入。這些方法普遍流程繁瑣,對操作技術(shù)要求極高,難以大面積推廣。芽孢桿菌的自然感受態(tài)是細(xì)胞易于吸收外源DNA的一個特定理化狀態(tài)[7],主要由ComX和CSF信息素組成的菌體密度感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)[8?10],其中ComK是一個全局調(diào)控因子,能激活晚

      生物技術(shù)進(jìn)展 2021年6期2021-12-01

    • 包涵體重組蛋白不同純化方法的比較
      菌株及質(zhì)粒 感受態(tài)E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)PLysS及E.coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL購自上海唯地生物技術(shù)有限公司;全長IL-1β與全長IL-1Ra重組質(zhì)粒[9](以下簡稱IL-1β-1Ra-2重組質(zhì)粒)、全長IL-1Ra重組質(zhì)粒由吉林大學(xué)人獸共患病細(xì)菌室保存。1.2 主要試劑 IPTG購自北京博奧拓科技有限公司;KCl、NaH2PO4及Na2HPO4購自北

      中國生物制品學(xué)雜志 2021年7期2021-07-20

    • 利用基因工程獲取紅色熒光大腸桿菌*
      理后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞能吸收周圍環(huán)境中的DNA 分子,利用熱激法可將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞。目的基因隨著重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞,并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化[3]。本實驗采用的質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因,轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌能在含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中存活,并且目的基因可表達(dá)出紅色熒光蛋白,以上2 點均為篩選轉(zhuǎn)化成功大腸桿菌的依據(jù)。2 實驗儀器和材料儀器與耗材:恒溫水浴鍋、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、電子秤、錐形瓶、酒精燈

      生物學(xué)通報 2021年8期2021-07-01

    • 唾液乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化研究
      .3唾液乳桿菌感受態(tài)制備唾液乳桿菌挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃過夜培養(yǎng)。按1%接種量接入50 mL SGMRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)一定時間后將菌液移入預(yù)冷的50 mL離心管,4 ℃ 6 000 g,離心10 min,收集菌體,棄上清。緩沖液Ⅰ洗滌菌體,4 ℃,6 000 g,離心10 min,棄上清。該步驟重復(fù)2次。用1 mL緩沖液Ⅱ重懸菌體,按每管100 μL分裝至1.5 mL EP管,-80 ℃凍存。接種于SGMRS培養(yǎng)基的菌液分別培養(yǎng)至O

      工業(yè)微生物 2021年3期2021-06-30

    • 噬菌體納米抗體展示庫構(gòu)建中電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
      環(huán)境的影響下,感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同,故轉(zhuǎn)化效率也存在差異,因此,應(yīng)該根據(jù)實際情況,對電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而探索最佳轉(zhuǎn)化條件,提高轉(zhuǎn)化效率。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素頗多,除了細(xì)菌的生長狀態(tài)及外源物質(zhì)的質(zhì)量外[6],電壓影響細(xì)胞膜的穿透性或外源分子與細(xì)胞膜的融合[7],T4 DNA連接酶也會降低轉(zhuǎn)化效率[8]。此外,電轉(zhuǎn)化結(jié)果受到眾多因素的綜合影響,實際上各個因素不是孤立存在的,而是相互聯(lián)系、相互作用的。為此,本研究旨在利用Bio-Rad公司的電

      寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2021年5期2021-06-22

    • 酵母雙雜交篩選與小麥黃花葉病毒P2互作的寄主因子
      iacoli)感受態(tài)Mac1-T1 Competent Cell、DH5α農(nóng)桿菌感受態(tài)。DH10B、Y187購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。1.2 試驗方法1.2.1 小麥cDNA構(gòu)建文庫是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法進(jìn)行構(gòu)建。并運用Trizol方法[19],提取總的小麥RNA并融解在RNase-free H2O中,用超微量分光光度計儀器測量RNA的純度與濃度。分離純化后,根據(jù)Fast Tra

      浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2021年3期2021-04-01

    • 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的建立及驗證
      liTop10感受態(tài)細(xì)胞中,小提質(zhì)粒,用測序引物pKD_Seq5測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pKDsgRNA-kan-DwaaL。1.5waaL基因同源修復(fù)供體DNA片段的擴(kuò)增以E.coliW3110基因組為模板,DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物,使用PrimerStar高保真酶PCR擴(kuò)增片段3和片段4。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后,以DwaaL-1F和DwaaL-2R為引物,使用PrimerStar高

      中國獸醫(yī)學(xué)報 2021年1期2021-03-10

    • 棉花角斑病菌V8高效電轉(zhuǎn)化條件的探索
      中期的V8制備感受態(tài)細(xì)胞;保證電壓2.1 kV、50 μg/mL質(zhì)粒7μL、4℃預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基SOC、振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)4-5 h時,V8的電轉(zhuǎn)化效率高達(dá)5×102/μg DNA。關(guān)鍵詞:棉花角斑病菌[Xanthmona scampestris pv.malvacearum (Xcm) ]V8;菌株馴化;電轉(zhuǎn)化條件;電轉(zhuǎn)化效率中圖分類號:Q78;S435.621.2+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114( 2020)12-0175-04D01:10.14

      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年12期2020-08-28

    • His-prescission蛋白酶基因在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化
      1菌種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,BL21(DE3)-T1R,北京天根生化科技有限公司;Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3),上海拜力生物科技有限公司。1.2 試劑及儀器核酸蛋白測定儀,賽默飛世爾科技公司;雙穩(wěn)定電泳儀,北京六一儀器廠;干浴微量恒溫器、脫色搖床,其林貝爾儀器制造有限公司;紫外分光光度計,上海優(yōu)尼柯有限公司;雙層試管搖床,上海智城分析儀器制造有限公司;生物潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。1.3質(zhì)粒的提取及菌種的轉(zhuǎn)化①含His-

      安徽化工 2020年3期2020-07-01

    • 產(chǎn)蛋主要基因?qū)ψ样Z產(chǎn)蛋性能的影響研究
      轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,擴(kuò)增培養(yǎng)后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,并將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對。將酶切后的FSH、PRL、INH基因進(jìn)行回收,將FSH基因與與pcDNA3.0載體相連接,PRL、INH基因與pET-32a載體連接,將重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中,將重組pcDNA3.0-FSH轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中,擴(kuò)增培養(yǎng)

      吉林畜牧獸醫(yī) 2020年4期2020-06-02

    • 基于退火緩沖液的SLiCE無縫克隆方法的改良
      于高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞,例如Zhang等[7]采用1×1010CFU/μg電轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞和1×109CFU/μg的化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞,Motohashi[13]則采用的是1×108CFU/μg化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞。商業(yè)化的高感受態(tài)細(xì)胞價格不菲,但自制高感受態(tài)細(xì)胞工序較為繁瑣,且轉(zhuǎn)化效率往往不穩(wěn)定,因此很多無縫克隆方法建立時都考慮到了感受態(tài)細(xì)胞效率這個因素[6,14]。對于無縫克隆的高感受態(tài)細(xì)胞依賴問題,Zhang等[7]將λ噬菌體Red

      生物技術(shù)通報 2020年2期2020-02-22

    • 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀
      5000)1 感受態(tài)細(xì)胞的起源、概念及原理1970年MANDEL和HIGE[1]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)CaCl2溶液處理時能夠吸收λ噬菌體DNA,細(xì)胞這種能夠吸收DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)。使用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞,改變細(xì)胞膜狀態(tài),增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,細(xì)胞膜表面性狀發(fā)生暫時性改變,方便外源基因或者載體進(jìn)入受體細(xì)胞,這種處于最適攝取和容納外來DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)。由于細(xì)胞膜具有流動特性,細(xì)胞膜通透性隨后會逐漸自動修復(fù)。轉(zhuǎn)化(tra

      河北北方學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版) 2020年8期2020-01-18

    • 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除大腸桿菌tnaA基因
      oliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,小提質(zhì)粒,用測序引物gRNAP F/gRNAP R測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pTargetF-tnaA。本研究所用引物和gRNA寡核苷酸序列見表1。表1 gRNA和引物1.4 tnaA基因同源修復(fù)供體 DNA的構(gòu)建以E.coliw3110-Δ基因組DNA為模板,tnaA L F、tnaA L R為引物,PCR擴(kuò)增獲得片段1,以tnaA R F、tnaA R R為引物,PCR擴(kuò)增獲得片段2。以AmlF和AmlR為引物,將片段1

      生物學(xué)雜志 2019年6期2019-12-19

    • 細(xì)菌遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移有哪些方式
      態(tài)被稱為細(xì)菌的感受態(tài)。有些細(xì)菌自誕生的時候就處于感受態(tài)的環(huán)境中,而有一些則需要外界的特殊刺激才能轉(zhuǎn)變?yōu)?span id="j5i0abt0b" class="hl">感受態(tài),這也把細(xì)菌的感受態(tài)分成了自然感受態(tài)和人工感受態(tài)兩種。不同種類的細(xì)菌實現(xiàn)感受態(tài)的方式也不盡相同,例如本身就可以實現(xiàn)感受態(tài)轉(zhuǎn)變也就是自然感受態(tài)的細(xì)菌代表有枯草芽孢桿菌,而需要通過人工干擾才能實現(xiàn)感受態(tài)的細(xì)菌典型代表是大腸桿菌,一種在生活中尤其常見的細(xì)菌。細(xì)菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化方式的不同還取決于對外部環(huán)境的反應(yīng),在自然界的生態(tài)系統(tǒng)中,大部分細(xì)菌都是來源于土壤之

      學(xué)習(xí)與科普 2019年17期2019-09-10

    • 申克孢子絲菌STE20基因RNA干擾菌株的構(gòu)建方法
      活,冰上冷卻。感受態(tài)細(xì)胞的制備 將DH5α菌保接到LB液體培養(yǎng)基中,將接菌后的試管于溫度37℃,220 r/min,培養(yǎng)16 h。然后轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基中(按約1∶100的量轉(zhuǎn)接),220 r/min,37℃培養(yǎng)到OD6000.6。然后,將培養(yǎng)物加到50 mL離心管中冰上預(yù)冷10 min。4℃,4000 r/min離心5 min,棄去上清。用預(yù)冷30 mL的CaC12(0.l mol/L)重懸,冰上放置30 min,然后,4℃,4000 r/

      中國真菌學(xué)雜志 2019年3期2019-07-10

    • 枯草芽孢桿菌ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)及其潛在生防應(yīng)用
      體的群集運動、感受態(tài)的形成、抗生素的合成、γ-聚谷氨酸的合成、生物膜的形成和致病基因的表達(dá)等細(xì)胞行為。這種對群體密度刺激做出反應(yīng)的基因調(diào)控系統(tǒng)稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)系統(tǒng)[2-5]。對近年來枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中感受態(tài)調(diào)控系統(tǒng)ComQXPA(Com是compotence的縮寫)的組成、系統(tǒng)在菌體生長繁殖過程中的重要調(diào)控機(jī)制、枯草芽孢桿菌作為生防菌在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié),并針

      河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期2019-06-28

    • 肉葡萄球菌電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
      壁較厚且致密,感受態(tài)細(xì)胞接收外源載體困難,常規(guī)的熱激轉(zhuǎn)化法幾乎無法使外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞.目前,肉葡萄球菌的外源 DNA轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法和電轉(zhuǎn)化方法.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法操作復(fù)雜、花費時間較長且轉(zhuǎn)化效率較低,而電轉(zhuǎn)化法操作簡便、理論轉(zhuǎn)化效率高,因而得到廣泛的應(yīng)用[4].電轉(zhuǎn)化法的原理是使用瞬時電壓使得細(xì)胞膜被極化而產(chǎn)生瞬時孔洞,使 DNA等外源物質(zhì)快速進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[5].電場強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時間在一定范圍內(nèi)時,細(xì)胞的瞬時通透性是可逆的.隨著電場

      天津科技大學(xué)學(xué)報 2019年3期2019-06-21

    • 利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化條件
      桿菌AR497感受態(tài)制備方法MRS液體培養(yǎng)過夜,3%接種量接種至含質(zhì)量濃度20 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基至OD600為0.3~0.4。 4 ℃,4 000×g離心棄上清,體積分?jǐn)?shù)為10%甘油洗滌2次并重懸分裝[7]。每管分裝100 μL保藏-80 ℃,電轉(zhuǎn)化備用。1.3 發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)效率檢測及鑒定方法取一定量質(zhì)粒與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻,迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷無菌的電轉(zhuǎn)杯中,設(shè)置好電轉(zhuǎn)參數(shù)后電擊。電擊完畢后,立即加入900 μL液體復(fù)蘇培養(yǎng)基

      食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年7期2019-05-07

    • 嗜熱鏈球菌的電轉(zhuǎn)化條件
      ophilus感受態(tài)細(xì)胞的影響按1%的接種量將S.thermophilussp1.1接入含有不同濃度甘氨酸的培養(yǎng)基(甘氨酸質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 g/L)中進(jìn)行培養(yǎng),測定其12 h的生長曲線,以甘氨酸0 g/L的為對照。1.3.3 菌體生物量對電轉(zhuǎn)化率的影響按1%接種量將S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),收集OD600為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的菌體,制備S

      食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年6期2019-04-04

    • 副豬嗜血桿菌高自然轉(zhuǎn)化效率菌株的篩選及全基因組測序
      細(xì)菌被稱作自然感受態(tài)細(xì)菌(naturally competent bacteria)[11-12]。HPS同樣展現(xiàn)出了自然轉(zhuǎn)化的能力[5]。自2004年Bigas等[13]以該菌自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基礎(chǔ),創(chuàng)建了一套在HPS上的基因操作技術(shù),借此構(gòu)建該菌的基因缺失株來研究相關(guān)基因功能,HPS自然轉(zhuǎn)化的應(yīng)用便推廣開來。與接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)相比,自然轉(zhuǎn)化的發(fā)生很少受到外源DNA的影響及轉(zhuǎn)化方法的局限,如感受態(tài)細(xì)菌的制備。自然轉(zhuǎn)化只與受體菌的誘導(dǎo)相關(guān),且操作相對簡單[14]

      畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2018年11期2018-11-30

    • 藍(lán)桿藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脫羧酶的克隆與表達(dá)
      21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后得到表達(dá)菌株。搖瓶培養(yǎng)表達(dá)菌株經(jīng)阿拉伯糖和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后純化得到cce4227重組蛋白。本研究為進(jìn)一步闡明cce4227蛋白的催化功能及機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株和載體 試驗于2017年11月至2018年1月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院分子生物學(xué)實驗室完成。pTf16分子伴侶質(zhì)粒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET28a為筆者所在實驗室保存;藍(lán)桿藻AT

      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年19期2018-11-08

    • 電轉(zhuǎn)化條件對大腸桿菌TG1轉(zhuǎn)化效率的影響
      環(huán)境的影響下,感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化條件都有所不同。為提高平末端連接、轉(zhuǎn)化效率,進(jìn)而建立較高質(zhì)量的文庫,因此本研究通過比較不同電轉(zhuǎn)化條件下大腸桿菌TG1的轉(zhuǎn)化效率,為后續(xù)噬菌體展示基因文庫的建立奠定基礎(chǔ)。1 試驗材料與方法1.1 試驗材料與主要儀器大腸桿菌菌株TG1本室-80 ℃保存;pDJ01質(zhì)粒為梅西大學(xué)Jasna Rakonjac教授惠贈,-80 ℃保存;大腸桿菌TG1株購自廣州碧云天生物有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物有限公司。LB液體培

      吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報 2018年3期2018-10-10

    • 香榧幼胚發(fā)育與胚性感受態(tài)之間的相關(guān)性
      00)植物胚性感受態(tài)為植物細(xì)胞或組織脫分化能力或潛力,胚性感受態(tài)的高低直接決定了植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易程度[1]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)植物的組織或細(xì)胞維持高水平胚性感受態(tài)的時間極短[2-3]。胚性感受態(tài)水平的高低與基因型、外植體的取材部位、生理學(xué)年齡等密切相關(guān)[4]。在黑核桃Juglans nigra中,授粉后3~4周的幼胚開始具有體胚發(fā)生能力,授粉后6~7周時幼胚體胚發(fā)生頻率最高,此后,體胚發(fā)生能力逐漸下降[5]。在梨Pyrus中,具有胚性感受態(tài)的時間極短,

      浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報 2018年5期2018-09-28

    • 傳染性造血器官壞死癥重組腺病毒載體的構(gòu)建
      1.2 質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞 Pad-Track-CMV穿梭載體、pAd-easy-1骨架載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DH10B感受態(tài)細(xì)胞和BJ5183感受態(tài)細(xì)胞,均購自武漢金開瑞生物科技有限公司。1.1.3 試 劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Quick-Fusion快速克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶,均購自美國紐英倫生物技術(shù)(NEB);RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自德國羅氏公司(Roche);脂質(zhì)體2000,購自美國英杰生命技術(shù)有限

      西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2018年5期2018-05-24

    • 犬瘟熱病毒H、F和N基因的克隆及原核表達(dá)
      rans-T1感受態(tài)、Transetta (DE3)感受態(tài)購自北京全式金公司;Ni-NTA Sefinose(TM) Resin購自生工生物工程(上海)股份有限公司;SDS-PAGE凝膠試劑盒購自碧云天公司。(2)PCR引物。根據(jù)GenBank中發(fā)表的CDV Onderstepoort毒株基因序列,用Primer premier 5軟件設(shè)計了三對特異性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2,引物序列如表1所示,并在PCR產(chǎn)物上、下游分別引入酶切位點,引物由

      獸醫(yī)導(dǎo)刊 2018年7期2018-04-24

    • 人參3-O-UGT1基因RNAi表達(dá)載體工程菌的構(gòu)建
      本實驗室保存;感受態(tài)大腸桿菌JM109、pMD20-T載體、pBI121植物雙元表達(dá)載體、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶以及各種限制性內(nèi)切酶等,均購于寶生物工程(大連)有限公司;卡那霉素購自于北京鼎國生物制品有限公司。2 試驗方法2.1 RNA干擾元件核心片段的獲得由GenBank得到原人參二醇3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Pg3-O-UGT1;JX898529)序列,通過Clustal X軟件將其核

      吉林大學(xué)學(xué)報(工學(xué)版) 2018年1期2018-03-10

    • 響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化效率研究
      發(fā)掘乳酸乳球菌感受態(tài)潛力奠定基礎(chǔ),為提高乳酸乳球菌感受態(tài)效率提供新思路。1 材料與方法1.1 材料與試劑1.1.1 質(zhì)粒試驗所用的質(zhì)粒pNZ44 為乳桿菌穿梭質(zhì)粒。1.1.2 培養(yǎng)基GM17 培養(yǎng)基:用于乳酸乳球菌NZ9000 的活化、培養(yǎng)和活菌計數(shù)。配方為:胰蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母浸出粉2.5 g/L、β?磷酸甘油二鈉19 g/L、維生素C 0.5 g/L、MgSO40.25 g/L。固體培養(yǎng)基另

      上海理工大學(xué)學(xué)報 2018年6期2018-02-25

    • 松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析
      2.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備挑取NEAU-ST10-39T單菌落于5 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中,35℃,145 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h;按2%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中,160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2~3 h,期間注意監(jiān)測菌體OD600吸光度值;待OD600吸光度值達(dá)0.6~0.8后停止培養(yǎng),冰浴菌液20~30 min;離心收集菌體;去除培養(yǎng)基后用20 mL去離子水重懸菌體,離心,洗滌菌體1次,去除殘

      東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2017年12期2017-12-29

    • 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、提取及酶切分析
      腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選培養(yǎng)充分克隆,然后用堿裂解法分離提取重組質(zhì)粒DNA,最后用限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒DNA,并跑電泳鑒定。人Bcl-2基因;質(zhì)粒轉(zhuǎn)化;CaCl2法;質(zhì)粒提取;堿裂解法;酶切分析本研究介紹人Bcl-2重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、分離提取和內(nèi)切酶酶切鑒定。1 材料與方法1.1 試劑不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、100mg/ml氨芐氨基酸溶液、人Bcl-2重組質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、75%乙醇;堿裂解法試劑溶

      保健文匯 2017年6期2017-11-02

    • 枯草芽孢桿菌SCK6超級感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化
      菌SCK6超級感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化李信志,盧爭輝,周玉玲,李世宇,張桂敏湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430062枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性好氧細(xì)菌,因其安全性和高分泌特性,已被廣泛用作異源蛋白的表達(dá)宿主。然而,相比大腸桿菌,枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率低,限制了其作為宿主的異源蛋白的定向進(jìn)化。本文通過改變培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、質(zhì)粒類型等參數(shù)優(yōu)化感受態(tài)制備的條件,利用常規(guī)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明,用營養(yǎng)豐富的YN培養(yǎng)基替代

      生物工程學(xué)報 2017年4期2017-05-06

    • 大腸埃希菌TG1電穿孔法轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化研究
      態(tài)、電場強(qiáng)度、感受態(tài)細(xì)胞濃度和體積、外源基因的質(zhì)量、甘油/甘露醇緩沖液體積等條件進(jìn)行優(yōu)化,分析了各因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示:細(xì)菌培養(yǎng)溫度為16℃,細(xì)菌生長的OD600值為0.5,密度梯度離心洗滌法,感受態(tài)細(xì)胞濃度高于1×1011/mL,并設(shè)定電場強(qiáng)度14.25 kV/cm時進(jìn)行電穿孔,轉(zhuǎn)化效率最高,可達(dá)到9×109CFU/μg DNA。研究獲得的電轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件為高庫容文庫的構(gòu)建提供了一個重要的途徑。大腸埃希菌TG1;電穿孔轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化效率基因文庫(ge

      生物技術(shù)進(jìn)展 2017年1期2017-02-20

    • 格里菲斯肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的細(xì)胞機(jī)制
      力的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞。這個轉(zhuǎn)化的過程大致分為三步:首先,R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞,接著感受態(tài)細(xì)胞攝取外源DNA,最后外源DNA在該細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。2.1 R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞 成為感受態(tài)細(xì)胞是攝取外源DNA的前提。肺炎雙球菌感受態(tài)的調(diào)控主要涉及五個蛋白(ComABCDE),它們共同組成一個群體感應(yīng)系統(tǒng)。ComC編碼感受態(tài)信息素(CSP)前體,當(dāng)細(xì)胞外CSP積累到可以發(fā)生感受態(tài)臨階濃度時,與膜結(jié)合蛋白ComD結(jié)合使其磷酸化,當(dāng)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ComE上,它

      生物學(xué)教學(xué) 2017年10期2017-02-18

    • Ca2+和Sr2+誘導(dǎo)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)化的影響
      誘導(dǎo)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)化的影響王永剛1, 孫尚琛1, 馬雪青2, 秦健宇1, 冷非凡1(1.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730046)為研究金屬離子誘導(dǎo)下感受態(tài)細(xì)胞形成的機(jī)理及揭示轉(zhuǎn)化發(fā)生的機(jī)制,分別用Ca2+和Sr2+(0~140 mmol/L)制備大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明,不同濃度的Ca2+和Sr2+誘導(dǎo)的感受態(tài)細(xì)胞的效價不同,兩種金屬離子對大

      微生物學(xué)雜志 2016年2期2016-12-21

    • 芍藥ITS片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選
      菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)中,并利用質(zhì)粒載體上含有的β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的調(diào)控序列,使重組體在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下,β-半乳糖苷酶將底物半乳糖苷(X-Gal)水解,形成藍(lán)色菌落,而有外源DNA片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌則形成白色菌落的過程。芍藥(Paeonia lactiflora)為芍藥科芍藥屬多年生草本植物,有較高的觀賞和藥用價值[4,5],但品種變異豐富,表型性狀多樣[6],給芍藥的準(zhǔn)確分類

      三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報 2016年3期2016-11-30

    • 植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化
      中期的細(xì)胞制備感受態(tài),以1 g/100 mL甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑,分別用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗滌細(xì)胞,并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作為電擊液,加入20 μg穿梭質(zhì)粒,在1.5 kV和400 Ω條件下進(jìn)行電擊,可以獲得最高的電轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.18×103CFU/μg DNA,滿足后續(xù)遺傳學(xué)實驗要求。植物乳桿菌;電轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化效率乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是指

      食品科學(xué) 2016年3期2016-11-11

    • 腸出血性大腸桿菌z4832基因缺失突變株的構(gòu)建
      腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1 simple載體和大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司。1.1.2 引物設(shè)計 PCR引物由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成(表1),其中U1-HindⅢ、U2-SalⅠ用于擴(kuò)增z4832基因上游500 bp同源臂(z4832-up);D1-BamHⅠ、D2-EcoRⅠ用于擴(kuò)增z4832基因下游500 bp同源臂(z4832-down);kana-SalⅠ、kana-BamH

      安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2016年8期2016-11-11

    • 攜帶BARF1基因的重組巨細(xì)胞病毒的構(gòu)建
      1SW102電感受態(tài)細(xì)胞的制備常規(guī)方法制備SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,-80 ℃保存。2.2制備含有巨細(xì)胞病毒細(xì)菌人工染色體(T-BAC)的SW102細(xì)胞將T-BAC質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)到SW102電感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到1 mL LB培養(yǎng)液,32 ℃孵育1 h;離心,用1×M9液洗滌沉淀2次,涂布于含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基,32 ℃ 培養(yǎng)1 d后,有克隆形成,挑選4個克隆,提取質(zhì)粒DNA,PCR(用巨細(xì)胞病毒開放讀碼框UL57引物:Forward: 5′-agac

      中國人獸共患病學(xué)報 2016年7期2016-08-24

    • 載體濃度和感受態(tài)對大分子載體轉(zhuǎn)化效率的影響
      )?載體濃度和感受態(tài)對大分子載體轉(zhuǎn)化效率的影響覃鴻妮1, 張?zhí)m蘭2(1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院,江蘇蘇州 215123;2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司,江蘇蘇州 215123)[目的]研究載體量和感受態(tài)對陽性克隆率的影響。[方法]利用引物拼接PCR技術(shù),自行設(shè)計26條引物合成一個835 bp的目的基因,將該基因與約20 kb的大分子載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎(chǔ)上,設(shè)置50、100、150、200、250、300 n

      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年17期2016-08-11

    • 濫用抗生素的危害
      素還會誘導(dǎo)細(xì)菌感受態(tài)的產(chǎn)生。感受態(tài)是細(xì)菌的一種容易接受外源基因片段的狀態(tài)。例如,肉類制品上如果殘留有耐藥基因片段,很容易被體內(nèi)處于感受態(tài)的細(xì)菌接受,從而造成人體細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)。廠家、藥店、醫(yī)院,受利益驅(qū)動,熱衷于生產(chǎn)、銷售、使用抗生素藥品,這是根本原因。藥監(jiān)部門監(jiān)管不力,也難辭其咎。針對目前抗生素市場流通方面存在的問題,由于無法對藥店持有的藥方進(jìn)行核實,藥監(jiān)部門開展的清查整頓效果有限。更關(guān)鍵的是科學(xué)教育和普及工作不到位,許多患者缺乏合理使用抗生素的常識,

      閱讀(科學(xué)探秘) 2016年9期2016-05-30

    • 對“肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗”的幾個疑難問題的解答
      的細(xì)菌必須處于感受態(tài)(最易于接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種狀態(tài)),調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異性蛋白稱感受態(tài)因子,主要包括膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶等,人工條件下可用環(huán)腺苷酸(cAMP)或Ca2+處理受體菌使其處于感受態(tài);③轉(zhuǎn)化還受到轉(zhuǎn)化因子的大小和濃度的影響。肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化(R型菌轉(zhuǎn)化為S型菌)是同種細(xì)菌不同品系間的轉(zhuǎn)化,具體過程如下:處于特定生長期的R型菌分泌感受態(tài)因子(細(xì)胞壁自溶素),細(xì)胞壁局部缺失,使細(xì)胞表面的膜連結(jié)合蛋白和核酸

      生物學(xué)教學(xué) 2016年11期2016-04-10

    • 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗難點剖析
      R型菌必須處于感受態(tài)。感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。它雖受遺傳控制,但表現(xiàn)卻差別很大。外界環(huán)境因子如環(huán)腺苷酸(cAMP)和Ca2+對感受態(tài)有重要影響。如cAMP可使嗜血桿菌屬的細(xì)菌感受態(tài)水平提高1萬倍。處于感受態(tài)的R型細(xì)菌分泌感受態(tài)因子,其中有細(xì)胞壁自溶素,使R型細(xì)菌的局部細(xì)胞壁溶解掉,從而使其細(xì)胞膜表面的膜連DNA結(jié)合蛋白和核酸酶暴露出來。轉(zhuǎn)化因子是離體的DNA片段。一般原核生物的擬核是由一個大型的環(huán)狀DNA分子反復(fù)折疊

      教學(xué)考試(高考生物) 2016年3期2016-04-09

    • pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對肺炎鏈球菌感受態(tài)菌株耐藥性的影響▲
      化對肺炎鏈球菌感受態(tài)菌株耐藥性的影響▲趙衛(wèi)東1忽勝和2楊新原2孔 山1(1 云南省大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗診斷學(xué)教研室,大理市 671000,E-mail:wdzhao1229@foxmail.com;2 云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科,大理市 671000)目的 探討pUC19-pbp2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對肺炎鏈球菌(SP)感受態(tài)菌株耐藥性的影響。方法 收集13株對青霉素不敏感的SP菌株,其中8株青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)編碼基因pbp2b未突變,5株pbp

      廣西醫(yī)學(xué) 2016年11期2016-02-17

    • DNA處理蛋白A在細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化中的作用
      作用,通過限制感受態(tài)刺激因子的早期基因表達(dá),參與細(xì)胞感受態(tài)的關(guān)閉過程。本文對DprA蛋白在細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化中的作用進(jìn)行綜述。DNA處理蛋白A;細(xì)菌;自然轉(zhuǎn)化自然轉(zhuǎn)化是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象,它是細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)化的一種基因程控機(jī)制。不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等其他機(jī)制,它利用DNA攝取泵導(dǎo)入DNA,不需要額外染色體或移動因子[1]。細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化的意義:抗藥性基因在病原菌之間快速水平轉(zhuǎn)移,以自然轉(zhuǎn)化過程中攝取的外源DNA為模板,通過同源重組方式修復(fù)受損染色體,是維持遺傳多樣性

      解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2015年10期2015-03-21

    • 小鼠性激素結(jié)合球蛋白條件基因打靶載體的構(gòu)建
      。1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備:1.2.3.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備 將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中,冰上放置10 min。4℃,4 000 r/min離心10 min。棄去上清,將管倒置1 min使培養(yǎng)液流盡,用冰上預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置30 min。0~4℃4 000 r/min離心10 min,棄去上清,加入2 mL預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置,即可獲得DH

      中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2015年3期2015-01-02

    • 一種電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌方法的優(yōu)化
      中,能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少,且感受態(tài)持續(xù)時間短暫,分子克隆效率低,從而限制了外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)[3]。目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡?span id="j5i0abt0b" class="hl">感受態(tài)法[4]、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[5]和電擊轉(zhuǎn)化法[6]。其中,電擊轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而,電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系,隨著電場強(qiáng)度的增加,外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的可能性越大,死亡率也隨之增加。陸雁等[7]以不同預(yù)培養(yǎng)時間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中,最高

      重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)) 2014年8期2014-06-27

    • PAI-1啟動子序列與熒光素酶報告基因擴(kuò)增及載體連接問題分析*
      濃度,膠回收,感受態(tài)質(zhì)量,LB平板質(zhì)量,內(nèi)切酶,連接時間及質(zhì)量比等問題都可增加連接成功概率。PAI-1;啟動子;熒光素酶報告基因;載體連接基因重組技術(shù)是我們在分子生物學(xué)研究中較常使用到的基本技術(shù),也是分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ),它在現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究中應(yīng)用越來越廣泛。載體構(gòu)建是將外源性DNA目的片段通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中繁殖及表達(dá),人工構(gòu)建為需要的目的質(zhì)粒,為進(jìn)一步實驗做基礎(chǔ)[1,2]。當(dāng)外源性DNA片段插入到相應(yīng)載體內(nèi)時,由于操作方法繁瑣,所需時間長,人為

      中國醫(yī)藥指南 2014年12期2014-04-13

    • 豬瘟病毒酵母雙雜交pGBKT7-NS3誘餌載體的構(gòu)建與鑒定
      接酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、YPDA培養(yǎng)基、SD各種缺陷性培養(yǎng)基、酵母菌株 Y2HGold、X-α-gal、Aureobasidin A、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、c-Myc抗體為Clontech公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品。1.1.2 引物合成和設(shè)計 根據(jù)GenBank上豬瘟病毒石門株(登錄號:AF

      動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2014年8期2014-03-06

    • 蘇云金芽胞桿菌高效電轉(zhuǎn)化方法的建立
      ,質(zhì)粒加入Bt感受態(tài)細(xì)胞中很容易被降解,低濃度的質(zhì)粒直接影響了電轉(zhuǎn)化效率,而經(jīng)蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對質(zhì)粒的降解作用大大下降,顯著提高了轉(zhuǎn)化效率.研究還對電轉(zhuǎn)化相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化,包括培養(yǎng)基成分及滲透壓、培養(yǎng)時間、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電場壓、質(zhì)粒DNA的濃度等.利用該方法,在Bt中建立了一種穩(wěn)定高效的電轉(zhuǎn)化方法.1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)為本研究室選育的野生型Bt菌株.Bt菌株

      湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報 2013年2期2013-10-11

    • 大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率變化的研究
      鑒別重組菌株。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)實驗室頻繁使用的一項重要的常規(guī)操作。對細(xì)菌而言,為達(dá)到高效轉(zhuǎn)化,活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108細(xì)胞/mL。對于大多數(shù)E.coli來說,相當(dāng)于 OD600為 0.4 左右,但由于轉(zhuǎn)化是一個很復(fù)雜的過程,具體的作用機(jī)理仍在探究中。有文獻(xiàn)指出[1],細(xì)菌的最佳感受態(tài)細(xì)胞制備期對于不同菌株是不同的,并不一定都是在活細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/mL的時候最適宜,有必要針對所使用的菌株確定其最佳轉(zhuǎn)化條件。1 材料與方法1.1 材料1.

      微生物學(xué)雜志 2013年1期2013-09-12

    • 采用Red重組系統(tǒng)敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因
      重懸,制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。取1μg p UCP-Red質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化PAO1感受態(tài)細(xì)胞,電擊條件25μF、200Ω、2.5 k V。電擊后菌液立即轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中,180 r/min振搖2 h后,涂布含有羧芐青霉素(300μg/m L)的LB平板,37℃培養(yǎng)24 h~48 h挑取單菌落,采用PCR鑒定質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化(引物見表1)。1.4.2 PAO1lasB基因敲除株的構(gòu)建1.4.2.1 線性打靶片段的制備 線性打靶片段的構(gòu)建參照文獻(xiàn)進(jìn)行[7]。打靶片段前

      中國人獸共患病學(xué)報 2013年2期2013-08-21

    • 質(zhì)粒pBV220-PTD-tCNTF轉(zhuǎn)化BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞的高效制備方法
      改造菌株制作為感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBV220-PTD-tCNTF,并探索其高效轉(zhuǎn)化方法。感受態(tài)細(xì)胞的制備有很多方法,通常包括物理法和化學(xué)法。物理法即電轉(zhuǎn)化法[7-8],此種方法快速高效,但設(shè)備昂貴,技術(shù)要求高?;瘜W(xué)法中最早也最為經(jīng)典的是氯化鈣法,這種方法由Mendel[9]建立于1970年,成為實驗室制備感受細(xì)胞的一種常規(guī)技術(shù),其后在此基礎(chǔ)上有很多改進(jìn)方法。一般認(rèn)為緩沖液中的Ca2+、Mg2+等二價陽離子可提高轉(zhuǎn)化效率,PEG在濃度為10 g·L-1分子

      中國藥理學(xué)通報 2012年4期2012-02-10

    • COX-2誘餌載體的構(gòu)建及其在酵母雙雜交系統(tǒng)中自激活作用的檢測
      粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆作為 PCR反應(yīng)模板,用PCR的方法擴(kuò)增出目的基因。引物設(shè)計如下:COX-2 F 5′-GG A ATT CAT GCT CGC CCG CGC CCT-3′;COX-2 R 5′-CGG G AT CCC TAC AGT TCA GTC GAA CGT TCT TTTAGT AGT ACT G-3′,分別在 5′端引入酶切位點EcoRⅠ和 BamHⅠ。反應(yīng)總體積為 50μL,其中包括:COX-2 F 0.5μL,COX

      首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2011年1期2011-01-25

    日本黄色视频三级网站网址| 久久人妻熟女aⅴ| 无遮挡黄片免费观看| 麻豆成人av在线观看| 久久青草综合色| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一级毛片女人18水好多| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲免费av在线视频| 麻豆国产av国片精品| 丝袜人妻中文字幕| 大型av网站在线播放| 91成年电影在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 九色亚洲精品在线播放| 国产免费男女视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产三级在线视频| 亚洲全国av大片| 国产精品亚洲一级av第二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黑人操中国人逼视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲中文av在线| 啦啦啦免费观看视频1| 日本五十路高清| 丝袜在线中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 黄色 视频免费看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品电影一区二区三区| 人人澡人人妻人| 亚洲第一电影网av| 精品无人区乱码1区二区| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精华国产精华精| 亚洲九九香蕉| 国产精品影院久久| 91成人精品电影| 大型黄色视频在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲美女黄片视频| 午夜免费成人在线视频| 大型黄色视频在线免费观看| 久久香蕉精品热| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 亚洲国产欧美网| 精品高清国产在线一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 91麻豆av在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 人人妻人人澡人人看| 性少妇av在线| 亚洲欧美激情综合另类| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲av电影不卡..在线观看| 多毛熟女@视频| 伦理电影免费视频| 我的亚洲天堂| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 午夜日韩欧美国产| netflix在线观看网站| 成人欧美大片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品第一国产精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本三级黄在线观看| 国产精品永久免费网站| 午夜免费鲁丝| netflix在线观看网站| 国产熟女xx| 91九色精品人成在线观看| 亚洲国产欧美网| 久久人人精品亚洲av| 12—13女人毛片做爰片一| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品一区av在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 激情在线观看视频在线高清| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲五月色婷婷综合| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久人人97超碰香蕉20202| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 亚洲人成电影观看| 国产精华一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 中文字幕人妻熟女乱码| 极品人妻少妇av视频| e午夜精品久久久久久久| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲情色 制服丝袜| 成人欧美大片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品免费视频内射| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成年版毛片免费区| 成人特级黄色片久久久久久久| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜激情av网站| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲欧美激情在线| 嫩草影视91久久| 精品人妻1区二区| 国产单亲对白刺激| 中出人妻视频一区二区| 一级作爱视频免费观看| 国产区一区二久久| www.熟女人妻精品国产| 啦啦啦韩国在线观看视频| 窝窝影院91人妻| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 91大片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 精品人妻1区二区| 免费看a级黄色片| 日本五十路高清| 精品人妻在线不人妻| 天堂√8在线中文| 18禁美女被吸乳视频| 一区在线观看完整版| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看免费午夜福利视频| 国产麻豆69| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美一级a爱片免费观看看 | 90打野战视频偷拍视频| 日韩av在线大香蕉| 一本久久中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产av在哪里看| 国产一区二区三区视频了| 啦啦啦免费观看视频1| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 69精品国产乱码久久久| 亚洲色图综合在线观看| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产av在哪里看| 一进一出好大好爽视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 极品人妻少妇av视频| 91大片在线观看| 一本综合久久免费| 免费在线观看影片大全网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 很黄的视频免费| 久久久久久久久免费视频了| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲av成人av| 人成视频在线观看免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 看免费av毛片| 一级a爱视频在线免费观看| 国产av在哪里看| 欧美日本中文国产一区发布| 一夜夜www| 久久久国产成人免费| 欧美中文综合在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 欧美精品亚洲一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美日韩乱码在线| 99在线视频只有这里精品首页| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 9色porny在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜福利18| 国产精品二区激情视频| 电影成人av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 91麻豆av在线| 真人做人爱边吃奶动态| 在线观看66精品国产| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成年人精品一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 久久这里只有精品19| 一级毛片高清免费大全| 黄色成人免费大全| 美女免费视频网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精华一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 制服人妻中文乱码| 成人国产综合亚洲| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久久大精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产国语露脸激情在线看| 午夜久久久在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 老司机靠b影院| 国产一卡二卡三卡精品| 人成视频在线观看免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 伦理电影免费视频| www日本在线高清视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 老汉色av国产亚洲站长工具| 这个男人来自地球电影免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人免费电影在线观看| av欧美777| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品欧美一区二区三区在线| 国产免费男女视频| 亚洲精品一区av在线观看| 91成年电影在线观看| 久99久视频精品免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 岛国在线观看网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品人妻在线不人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久国产成人免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产欧美网| 亚洲五月色婷婷综合| 美女免费视频网站| av视频免费观看在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲成av人片免费观看| 岛国在线观看网站| 99精品久久久久人妻精品| 手机成人av网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产不卡一卡二| а√天堂www在线а√下载| 国产单亲对白刺激| 香蕉久久夜色| 精品久久久久久,| 成人免费观看视频高清| 一级作爱视频免费观看| 在线国产一区二区在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 最新美女视频免费是黄的| 成年版毛片免费区| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 免费高清在线观看日韩| 无人区码免费观看不卡| 午夜日韩欧美国产| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av电影在线进入| 久久这里只有精品19| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久热在线av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日日干狠狠操夜夜爽| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色女人牲交| 十八禁人妻一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 欧美黑人欧美精品刺激| 好男人在线观看高清免费视频 | 99久久综合精品五月天人人| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜精品国产一区二区电影| 淫秽高清视频在线观看| 久9热在线精品视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人影院久久av| 最近最新中文字幕大全电影3 | x7x7x7水蜜桃| 91精品国产国语对白视频| 国产精品影院久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人精品一区二区免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 一夜夜www| 最近最新中文字幕大全电影3 | 制服人妻中文乱码| 午夜精品国产一区二区电影| 国产一区二区激情短视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99re在线观看精品视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日本欧美视频一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机福利观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久热这里只有精品99| 国产精品久久视频播放| 欧美一级a爱片免费观看看 | 成人国语在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品一区二区在线不卡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品久久蜜臀av无| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 黄色丝袜av网址大全| 亚洲欧美激情在线| 88av欧美| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 久久人妻熟女aⅴ| 在线播放国产精品三级| 丝袜在线中文字幕| 成在线人永久免费视频| 色尼玛亚洲综合影院| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日日夜夜操网爽| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人影院久久av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美三级三区| 国产成人欧美在线观看| 岛国在线观看网站| 变态另类丝袜制服| 中文字幕色久视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 精品久久久久久,| 久久久久国内视频| 9191精品国产免费久久| 久久天堂一区二区三区四区| 好男人在线观看高清免费视频 | 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 日本 av在线| 一进一出抽搐动态| 岛国在线观看网站| 88av欧美| 欧美中文日本在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 桃色一区二区三区在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 性欧美人与动物交配| 一级a爱视频在线免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 久久热在线av| 久久婷婷成人综合色麻豆| cao死你这个sao货| 精品国产乱子伦一区二区三区| 嫩草影视91久久| 中国美女看黄片| 色综合婷婷激情| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色a级毛片大全视频| 美女免费视频网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 69精品国产乱码久久久| 香蕉久久夜色| 亚洲男人天堂网一区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 此物有八面人人有两片| www.www免费av| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品九九99| 黄色丝袜av网址大全| 人人妻,人人澡人人爽秒播| a在线观看视频网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久香蕉激情| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| www.www免费av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲男人的天堂狠狠| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女下面插进去视频免费观看| xxx96com| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人影院久久av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 99香蕉大伊视频| av免费在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品永久免费网站| 波多野结衣高清无吗| 欧美乱妇无乱码| 曰老女人黄片| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 美女国产高潮福利片在线看| 啦啦啦 在线观看视频| 久久伊人香网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩精品中文字幕看吧| 91成年电影在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜a级毛片| 在线av久久热| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产伦人伦偷精品视频| 国产激情欧美一区二区| 久久亚洲精品不卡| 女人被狂操c到高潮| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精华国产精华精| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美黄色淫秽网站| 18禁观看日本| 色精品久久人妻99蜜桃| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲第一青青草原| 99久久精品国产亚洲精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久九九精品影院| 香蕉久久夜色| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲情色 制服丝袜| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品久久视频播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 精品久久久久久成人av| 久久人人精品亚洲av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美激情久久久久久爽电影 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 极品教师在线免费播放| 一级毛片女人18水好多| 午夜免费观看网址| av片东京热男人的天堂| 久久香蕉精品热| 国产成人精品无人区| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91麻豆av在线| 久久人人精品亚洲av| 美女 人体艺术 gogo| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精华国产精华精| 欧美乱码精品一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 老司机午夜十八禁免费视频| 男人舔女人的私密视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区激情短视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲av五月六月丁香网| 制服丝袜大香蕉在线| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美日本中文国产一区发布| 久久影院123| av视频免费观看在线观看| 日本三级黄在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 久久草成人影院| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产麻豆成人av免费视频| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩一级在线毛片| 一区二区三区高清视频在线| 国产色视频综合| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 欧美一级毛片孕妇| 美女免费视频网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲欧美激情在线| 午夜免费激情av| 动漫黄色视频在线观看| 午夜福利视频1000在线观看 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 99国产综合亚洲精品| 看黄色毛片网站| 淫秽高清视频在线观看| 看黄色毛片网站| 国产成人精品在线电影| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av电影在线进入| 99久久99久久久精品蜜桃| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成年人精品一区二区| xxx96com| 免费高清视频大片| 国产成人av激情在线播放| 深夜精品福利| 国产精品电影一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩视频一区二区在线观看| 色播在线永久视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 99国产综合亚洲精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久国产精品麻豆| 久久精品国产综合久久久| 久久中文字幕人妻熟女| 香蕉久久夜色| 亚洲无线在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 露出奶头的视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产成人欧美| av福利片在线| www.自偷自拍.com| 女人精品久久久久毛片| 国产一区在线观看成人免费| 成人18禁在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 久久亚洲精品不卡| 国产片内射在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 看免费av毛片| 亚洲av电影在线进入| 一本大道久久a久久精品| 黄频高清免费视频| www日本在线高清视频| av网站免费在线观看视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲三区欧美一区| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久香蕉激情| 久久人人精品亚洲av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 黄色女人牲交| 日韩大尺度精品在线看网址 | 99精品在免费线老司机午夜| or卡值多少钱| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产精品成人综合色| 中文亚洲av片在线观看爽| 可以在线观看的亚洲视频| 国产男靠女视频免费网站| 欧美一级毛片孕妇| 国产91精品成人一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品国产清高在天天线| 可以在线观看毛片的网站| 欧美激情高清一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av超薄肉色丝袜交足视频| 妹子高潮喷水视频| 国产成人av教育| 国产真人三级小视频在线观看|