枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化體系的建立

蔡 露，秦艷秋，高坦坦，王旭東，任爭光，趙曉燕

(北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

植物病害是影響中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，為保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障糧食和食品安全，生物防治是目前被優(yōu)先考慮的植物病害防治方法之一。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)被認(rèn)為是一種理想的生防細(xì)菌，廣泛分布于自然界中，抗逆性較強(qiáng)，耐熱、耐旱、抗紫外線，對人畜無毒無害，且具有廣譜抗菌活性[1-2]，能夠抑制植物根部、枝干、花葉及果實(shí)的病原菌，可用于防治水稻紋枯病、小麥紋枯病、棉花枯萎病、棉花立枯病、番茄葉霉病、豆類根腐病等多種病害[3-4]。同時(shí)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)也是繼大腸桿菌之后又一個(gè)在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)研究中廣泛使用的菌株，枯草芽孢桿菌菌株的遺傳改造可以有助于更好的研究其生防機(jī)理，或者建造工程菌株，進(jìn)一步提高其防治效果、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，從而更好的發(fā)揮其生防作用。通過轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等標(biāo)記基因?qū)莶菅挎邨U菌進(jìn)行熒光標(biāo)記以確定其定殖位點(diǎn)也是熱點(diǎn)研究的內(nèi)容[5]。

將目的基因引入細(xì)胞是遺傳改造的方法之一，其途徑主要有電擊轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化[6]。對于枯草芽孢桿菌而言，電擊轉(zhuǎn)化是三種轉(zhuǎn)化途徑中操作較為簡單、變量易控制且轉(zhuǎn)化效率較高的一種[7-8]，而化學(xué)轉(zhuǎn)化與原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化耗時(shí)長、影響因素較多且轉(zhuǎn)化效率較低[9]。電擊轉(zhuǎn)化即電穿孔，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)中，通過高強(qiáng)度的電場作用，在細(xì)胞膜上形成暫時(shí)性的可復(fù)性穿孔，將外源目的DNA導(dǎo)入細(xì)胞，插入細(xì)胞基因組內(nèi)，使DNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[10]。不同細(xì)菌、甚至不同菌株的電擊轉(zhuǎn)化條件有較大差別[11]，一些菌株甚至無法進(jìn)行轉(zhuǎn)化[12]。就枯草芽孢桿菌而言，枯草芽孢桿菌菌株NCD-2在37 ℃、150 r/min培養(yǎng) 3.5 h、電阻200 Ω和電場強(qiáng)度14.0 kV的條件下能達(dá)到較高的電擊轉(zhuǎn)化效率[9]；而枯草芽孢桿菌菌株WB600在OD600 nm=0.7、質(zhì)粒體積80 ng、電阻200 Ω和轉(zhuǎn)化電壓21 kV時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高[7]。

枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2是北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存的一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生防菌株[13]，該試驗(yàn)從菌株不同培養(yǎng)階段、不同感受態(tài)細(xì)胞濃度、不同感受態(tài)細(xì)胞量、不同質(zhì)粒體積、不同轉(zhuǎn)化電壓等電擊轉(zhuǎn)化條件對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行探索，為建立該菌株的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系及后續(xù)分子遺傳學(xué)研究及工程菌株改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2由北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存；帶有GFP標(biāo)記的穿梭質(zhì)粒pGFP78(四環(huán)素抗性)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系王琦教授惠贈(zèng)。

1.1.2 供試試劑及培養(yǎng)基 抗生素(10 μg/mL)：四環(huán)素(10 μg/mL)。LB液體培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基加入酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g。LB固體培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基加入酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g?？剐耘囵B(yǎng)基：使用時(shí)，在LB液體或固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入對應(yīng)濃度抗生素。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒pGFP78的提取及質(zhì)粒濃度測定 質(zhì)粒pGFP78的提取使用北京博邁德基因技術(shù)有限公司的高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，具體操作參考試劑盒所附說明書。質(zhì)粒濃度測定使用Thermo Fisher Scientific的超微量核酸蛋白測定儀。

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2感受態(tài)細(xì)胞的制備 依據(jù)參考文獻(xiàn)[14-17]進(jìn)行前期試驗(yàn)，最后確定制備感受態(tài)細(xì)胞的流程如下：將保存的枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(≤16 h)；在裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中加入1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，在搖床中37 ℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至指定OD600 nm值；冰浴菌液30 min使其停止生長，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清收集菌體；用預(yù)冷的超純水洗滌菌體5次，加入40% PEG6000懸浮沉淀，分裝備用。

1.2.3 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2的電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 在分裝的感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒，混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷好的電擊杯中，擦干電擊杯表面的水，立即電擊；電擊完畢立刻加入800 μL的LB液體培養(yǎng)基，混勻后將其轉(zhuǎn)移至空試管中，37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)3 h；將孵化好的菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清，加入100 μL超純水重懸菌體，將重懸后的菌液涂布于相應(yīng)抗性平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；記錄菌落數(shù)，計(jì)算電擊轉(zhuǎn)化效率：電擊轉(zhuǎn)化效率(CFU/μg)=菌落數(shù)/質(zhì)粒質(zhì)量。隨機(jī)挑取單菌落，制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察，由于質(zhì)粒pGFP78均帶有熒光蛋白標(biāo)記，因此若菌體在熒光顯微鏡下能觀察到熒光，則說明電擊轉(zhuǎn)化成功。

1.2.4 不同轉(zhuǎn)化電壓對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響 電擊轉(zhuǎn)化時(shí)分別用1.8、2.2和2.5 kV的轉(zhuǎn)化電壓進(jìn)行電擊，測定轉(zhuǎn)化電壓大小對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。質(zhì)粒選擇pGFP78，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL，質(zhì)粒體積10 μL，電擊杯寬度0.2 cm，電擊轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算同“1.2.3”。

1.2.5 對數(shù)生長期不同階段對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響 按照“1.2.2”的方法，將枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2培養(yǎng)至OD600 nm值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0，參照“1.2.2”制備感受態(tài)細(xì)胞，測定菌株對數(shù)生長期不同階段對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。質(zhì)粒選擇pGFP78，質(zhì)粒體積10 μL，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL，電場強(qiáng)度2.5 kV，電擊杯寬度0.2 cm，電擊轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算同“1.2.3”。

1.2.6 不同感受態(tài)細(xì)胞濃度對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響 制作枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2感受態(tài)細(xì)胞步驟中最后懸浮沉淀時(shí)按起始菌液每100 mL分別加入600 μL或1 200 μL的40% PEG6000，測定不同感受態(tài)細(xì)胞濃度對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。質(zhì)粒選擇pGFP78，質(zhì)粒體積10 μL，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL，電場強(qiáng)度2.5 kV，電擊杯寬度0.2 cm，電擊轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算同“1.2.3”。

1.2.7 不同感受態(tài)細(xì)胞量對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響 電擊轉(zhuǎn)化時(shí)分別加入200 μL及100 μL的感受態(tài)細(xì)胞，以測定不同感受態(tài)細(xì)胞量對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。質(zhì)粒選擇pGFP78，質(zhì)粒體積10 μL，電場強(qiáng)度2.5 kV，電擊杯寬度0.2 cm，電擊轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算同“1.2.3”。

1.2.8 不同質(zhì)粒體積對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響 電擊轉(zhuǎn)化時(shí)分別加入10 μL及5 μL的質(zhì)粒，測定不同質(zhì)粒體積對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。質(zhì)粒選擇pGFP78，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL，電場強(qiáng)度2.5 kV，電擊杯寬度0.2 cm，電擊轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算同“1.2.3”。

1.3 顯著性差異分析

利用SPSS軟件進(jìn)行差異性分析。自變量為2個(gè)時(shí)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，自變量≥3時(shí)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)化電壓對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

采用電擊轉(zhuǎn)化方法測試不同轉(zhuǎn)化電壓對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化效率的影響,結(jié)果如圖1。當(dāng)轉(zhuǎn)化電壓2.5 kV時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率最高，為411.80 CFU/μg；轉(zhuǎn)化電壓2.2 kV時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率最低，僅有91.20 CFU/μg；轉(zhuǎn)化電壓1.8 kV時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率位于二者之間，為101.20 CFU/μg。利用SPSS進(jìn)行差異性分析，可知2.5 kV時(shí)的轉(zhuǎn)化效率與1.8 kV及2.2 kV時(shí)的電擊轉(zhuǎn)化效率有顯著性差異(P<0.05)。在后續(xù)試驗(yàn)中都采用轉(zhuǎn)化電壓2.5 kV進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.2 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2對數(shù)生長期不同階段對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

采用電擊轉(zhuǎn)化方法測試枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2培養(yǎng)時(shí)對數(shù)生長期不同階段對菌株電擊轉(zhuǎn)化效率的影響(圖2)。隨著培養(yǎng)液OD600 nm值的升高，電擊轉(zhuǎn)化效率逐漸升高。當(dāng)OD600 nm=1.0時(shí)電擊轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)到6 823.67 CFU/μg；其次是OD600 nm=0.8時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率達(dá)到4 884.67 CFU/μg；OD600 nm=0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化效率大幅下降，平均電擊轉(zhuǎn)化效率僅411.77 CFU/μg；當(dāng)OD600 nm<0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化效率明顯過低。利用SPSS進(jìn)行差異性分析，可知OD600 nm=1.0與其他OD600 nm值時(shí)的電擊轉(zhuǎn)化效率均存在著顯著性差異(P<0.05)，因此在后續(xù)試驗(yàn)中采用培養(yǎng)到OD600 nm=1.0的細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

圖1 轉(zhuǎn)化電壓對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 The effect of electric shock voltage on transformation efficiency

圖2 對數(shù)生長期不同階段對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 The effect of logarithmic growth periods on transformation efficiency

2.3 不同感受態(tài)細(xì)胞濃度對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

在制作感受態(tài)細(xì)胞的最后階段加入的40%PEG6000的量會(huì)影響感受態(tài)細(xì)胞的濃度，測試兩種不同感受態(tài)細(xì)胞濃度(每100 mL起始菌液加入600 μL的40% PEG6000或1 200 μL 的40% PEG6000)對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化效率的影響見圖3。40% PEG6000加入量600 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率達(dá)到656.00 CFU/μg；40% PEG6000加入量1 200 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率為186.10 CFU/μg。40% PEG6000加入量600 μL時(shí)的電擊轉(zhuǎn)化效率顯著高于40% PEG6000加入量1 200 μL時(shí)的轉(zhuǎn)化效率(P<0.05)，因此在制作感受態(tài)細(xì)胞的最后階段加入600 μL 40% PEG6000得到的感受態(tài)濃度更利于電擊轉(zhuǎn)化效率的提高。

圖3 感受態(tài)細(xì)胞濃度對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 The effect of competent cell concentration on transformation efficiency

2.4 不同感受態(tài)細(xì)胞量對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

采用電擊轉(zhuǎn)化方法測試不同感受態(tài)細(xì)胞量對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果如圖4。在一個(gè)轉(zhuǎn)化體系中，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率186.10 CFU/μg；感受態(tài)細(xì)胞100 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率42.60 CFU/μg。利用SPSS進(jìn)行差異性分析，可知感受態(tài)細(xì)胞量200 μL與感受態(tài)細(xì)胞量100 μL時(shí)的轉(zhuǎn)化效率存在顯著性差異(P<0.05)。感受態(tài)細(xì)胞量200 μL時(shí)的平均電擊轉(zhuǎn)化效率是感受態(tài)細(xì)胞量100 μL時(shí)的3倍多，因此電擊轉(zhuǎn)化時(shí)感受態(tài)細(xì)胞量200 μL會(huì)獲得更好的電擊轉(zhuǎn)化效率。

圖4 感受態(tài)細(xì)胞量對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 The effect of competent cell amount on transformation efficiency

2.5 不同質(zhì)粒體積對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

采用電擊轉(zhuǎn)化方法測試電擊轉(zhuǎn)化體系中加入不同質(zhì)粒體積對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2電擊轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果如圖5。當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞濃度較高(40% PEG6000加入600 μL)時(shí)：質(zhì)粒體積10 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率785.90 CFU/μg；質(zhì)粒體積5 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率656.00 CFU/μg，二者之間不存在顯著性差異。當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞濃度較低(40% PEG6000加入1 200 μL)時(shí)：質(zhì)粒體積10 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率242.30 CFU/μg；質(zhì)粒體積5 μL時(shí)，平均電擊轉(zhuǎn)化效率142.60 CFU/μg，二者之間存在顯著性差異(P<0.05)。此現(xiàn)象可能表明，在感受態(tài)細(xì)胞濃度較低的情況下電擊轉(zhuǎn)化效率與加入的質(zhì)粒體積成正比，但在感受態(tài)細(xì)胞濃度較大的情況下加入不同的質(zhì)粒體積對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響較小。

圖5 質(zhì)粒體積對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 The effect of plasmid volume on transformation efficiency

2.6 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

挑取“2.2”的抗生素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光標(biāo)記的檢查，陽性轉(zhuǎn)化子的菌體在熒光顯微鏡下能產(chǎn)生熒光，說明電擊轉(zhuǎn)化成功(圖6)。

注；A是明場；B是暗場。Note: A is bright field; B is dark field.圖6 枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證Fig.6 Verification of transformants of Bacillus subtilis ZT4-2 strain

3 討 論

通過該試驗(yàn)建立了枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2的電擊轉(zhuǎn)化體系。相關(guān)重要環(huán)節(jié)的條件：制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，菌液培養(yǎng)至OD600 nm值為1.0；最后重懸菌體時(shí)加入40% PEG6000的體積600 μL/100 mL 起始菌液；電擊轉(zhuǎn)化體系中，感受態(tài)細(xì)胞量200 μL，質(zhì)粒體積10 μL，轉(zhuǎn)化電壓2.5 kV。在該體系中，電擊轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)6 823.67 CFU/μg。

電擊轉(zhuǎn)化是一種簡單高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，但對于不同的菌株電擊轉(zhuǎn)化的條件及效率差別較大，枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁較厚且致密，其電擊轉(zhuǎn)化效率比革蘭氏陰性菌低[18]，因此探索不同電擊轉(zhuǎn)化條件對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響，建立枯草芽孢桿菌的高效電擊轉(zhuǎn)化體系，就能更好利用目的基因?qū)莶菅挎邨U菌進(jìn)行遺傳改造，從而進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。利用PEG6000的電轉(zhuǎn)化方法鮮有報(bào)道，在經(jīng)過不斷試驗(yàn)和方法改善后，選擇該方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2的電擊轉(zhuǎn)化體系的建立，轉(zhuǎn)化效率較為穩(wěn)定，為今后對枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2進(jìn)行基因工程研究提供支持。

一般來說，菌株對電擊轉(zhuǎn)化時(shí)的電場強(qiáng)度非常敏感，提高轉(zhuǎn)化電壓可以增加目的基因進(jìn)入細(xì)胞的幾率，同時(shí)也會(huì)增加細(xì)胞的死亡概率，為了獲得更高的電擊轉(zhuǎn)化效率，必須同時(shí)兼顧細(xì)胞的死亡率和轉(zhuǎn)化率來選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓。不同菌株對電場強(qiáng)度的敏感性不同，如貝萊斯芽孢桿菌菌株3A3-15在電擊轉(zhuǎn)化電壓1.75 kV時(shí)效率最高[18]，枯草芽孢桿菌菌株WB600在電擊轉(zhuǎn)化電壓21 kv時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高[7]，枯草芽孢桿菌菌株NCD-2的最優(yōu)電擊轉(zhuǎn)化電壓14.0 kV[9]。該試驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)化電壓2.5 kV時(shí)枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2的電擊轉(zhuǎn)化效率最高。

通常認(rèn)為對數(shù)生長初期進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率高于對數(shù)生長中后期的效率[19]，并且不同菌株想要達(dá)到較高電擊轉(zhuǎn)化效率所需的階段不一定相同，如枯草芽孢桿菌菌株WB600在菌液培養(yǎng)至OD600 nm=0.7時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高[7]，而枯草芽孢桿菌菌株NCD-2在菌液培養(yǎng)至OD600 nm=1.2時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高[9]。該試驗(yàn)探究枯草芽孢桿菌菌株ZT4-2處于對數(shù)生長初期最適合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化的OD600 nm值， OD600 nm值在0.3～1.0時(shí)隨著OD600 nm值的升高，電擊轉(zhuǎn)化效率逐漸升高，當(dāng)OD600 nm=1.0時(shí)，電擊轉(zhuǎn)化效率最高。

PEG是用于細(xì)胞融合的最常用的化學(xué)融合劑，最后一次重懸細(xì)胞沉淀選擇加入40% PEG6000是為了促進(jìn)細(xì)胞膜的變化[20]，從而獲得更好的電擊轉(zhuǎn)化效率。PEG6000的促進(jìn)作用取決于其濃度、加入量及作用時(shí)間，但增加其加入量也相當(dāng)于對感受態(tài)細(xì)胞濃度進(jìn)行稀釋。每100 mL起始菌液加入600 μL 40% PEG6000時(shí)的電擊轉(zhuǎn)化效率顯著高于加入1 200 μL 40%PEG6000時(shí)的電擊轉(zhuǎn)化效率，并且不受轉(zhuǎn)化時(shí)質(zhì)粒體積的影響，而在低濃度下，質(zhì)粒體積加入較多時(shí)電擊轉(zhuǎn)化效率會(huì)高于質(zhì)粒體積較少時(shí)的轉(zhuǎn)化效率。