大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀

郭夢姚，吳靖芳,2

(1.河北北方學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

1 感受態(tài)細(xì)胞的起源、概念及原理

1970年MANDEL和HIGE[1]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)CaCl2溶液處理時能夠吸收λ噬菌體DNA，細(xì)胞這種能夠吸收DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)。使用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，改變細(xì)胞膜狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞膜表面性狀發(fā)生暫時性改變，方便外源基因或者載體進(jìn)入受體細(xì)胞，這種處于最適攝取和容納外來DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)。由于細(xì)胞膜具有流動特性，細(xì)胞膜通透性隨后會逐漸自動修復(fù)。轉(zhuǎn)化(transformation)是指同源或異源的“裸露”分子被感受態(tài)細(xì)胞攝取并使其基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象得到表達(dá)。

2 感受態(tài)細(xì)胞制備常用方法及優(yōu)化研究

2.1 化學(xué)法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及影響因素

2.1.1 CaCl2法

CaCl2法是制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞最常用的化學(xué)方法。此法操作簡單，重復(fù)性好，但影響因素較多，若不注意細(xì)節(jié)和條件容易導(dǎo)致實驗失敗。

培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速的影響：挑取新鮮平板大腸桿菌菌落置于Luria Bertani(LB，pH6.5)培養(yǎng)液中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值最佳生長密度。吳海燕等[2]報道不同轉(zhuǎn)速下大腸桿菌OD600值達(dá)到0.3～0.4所需的時間：200～220 r·min-1振蕩培養(yǎng)3～3.25 h；240～260 r·min-1振蕩培養(yǎng)2.75～3 h；280～300 r·min-1振蕩2.5～2.75 h培養(yǎng)的細(xì)菌制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率可達(dá)(6.45±0.05)×107CFU·μg-1質(zhì)粒DNA，可滿足大部分質(zhì)粒常規(guī)克隆的需要。宴國洪等[3]指出大腸桿菌DH5α菌種活化2次及以上OD600值為0.37～0.4時，細(xì)菌處于最理想的生長狀態(tài)，被誘導(dǎo)處于感受態(tài)的細(xì)菌最多，但OD600值過高會導(dǎo)致細(xì)菌大量老化，活力顯著減弱，轉(zhuǎn)化率下降。

Ca2+終濃度和熱激時間：經(jīng)CaCl2處理過的細(xì)胞處于膨脹狀態(tài)，過快過久的離心會損傷細(xì)胞。利用0 ℃低溫預(yù)冷的CaCl2溶液懸浮沉淀菌體，再冰浴、離心，大腸桿菌包膜表面被Ca2+覆蓋，可使重組體基因在不斷增殖分裂的菌體中得到表達(dá)。Ca2+終濃度是維持細(xì)胞膜通透性的關(guān)鍵因素，Ca2+濃度在100 mmol·L-1時，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率最高，而大腸桿菌攝取DNA的能力則不受轉(zhuǎn)化前是否經(jīng)過Ca2+處理的影響[4]。李文化等[5]認(rèn)為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率與Ca2+濃度呈正相關(guān)，在5 mmol·L-1的低濃度中也可以完成轉(zhuǎn)化。細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列被破壞并結(jié)合膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無機(jī)磷酸形成復(fù)合物，在低溫低滲的菌體表面膨脹成球形，非生理條件下，高濃度的Ca2+附著于細(xì)胞表面改變細(xì)胞壁通透性，外源DNA則更容易接近細(xì)胞膜。此外，少量的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)部的聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyrate，PHB)和磷酸基團(tuán)結(jié)合形成復(fù)合物，此體系的細(xì)胞在經(jīng)過42 ℃熱激后，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生擾動，隨后出現(xiàn)間隙，外源DNA被吸收，宿主細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變[6]。代軍等[7]在進(jìn)行DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化設(shè)置熱激時間梯度時發(fā)現(xiàn)，42 ℃熱激100 s可出現(xiàn)超過5×106CFU·μg-1質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率，隨后延長熱激時間，轉(zhuǎn)化效率降低。冷卻時間對感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率影響不大，許彤等[8]在制備JM109感受態(tài)細(xì)胞時，在OD600為0.705的條件下采用TB轉(zhuǎn)化液進(jìn)行制備，42 ℃熱激45 s后，使用SOC培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后得到的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率可達(dá)8.59×108CFU·μg-1質(zhì)粒，隨后延長熱激時間轉(zhuǎn)化效率降低，表明熱激時間過久不能提高轉(zhuǎn)化效率。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率受多種因素制約，其中一個因素是細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長早期，生長過度或發(fā)育不全的細(xì)菌制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較低。

培養(yǎng)基的選擇：SOC培養(yǎng)基中含多種營養(yǎng)物質(zhì)，可在外源DNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞時為菌體提供大量營養(yǎng)，供細(xì)菌快速生長繁殖[9]。雖然SOC培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)較LB培養(yǎng)基豐富，但對復(fù)蘇電擊后菌液細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率并無明顯影響[22]。

2.1.2 一步法

一步法也稱TSS法，較CaCl2法快捷簡便，不需要熱休克，更方便易行。1989年CHUNG等[10]研究報道，在原有的CaCl2法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：在LB培養(yǎng)液中加入1×TSS(10% PEG，5% DMSO，10%甘油，MgCl2，MgSO4)貯存溶液。冰浴后加入DMSO菌液可降低細(xì)胞毒性并延長感受狀態(tài)。代紅星等[11]認(rèn)為TSS法在常溫下離心1 min便可達(dá)到與CaCl2法相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化效率，短時離心也降低了細(xì)胞損傷。優(yōu)化后的培養(yǎng)液中含有聚乙二醇(PEG)和MgCl2,二者均可沉淀質(zhì)粒DNA，PEG使細(xì)胞壁具有方便DNA進(jìn)入的生物學(xué)性能。張跡等[12]發(fā)現(xiàn)TSS法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞時，分子量較小的質(zhì)粒(pUC19)獲得的轉(zhuǎn)化效率高于分子量大的質(zhì)粒(pET29a和pET29a-gfp)。研究發(fā)現(xiàn)使用TSS法制備大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)化體系冰水浴30 min，再取出樣品置于室溫中放置10 min，加入適量新鮮LB培養(yǎng)基后置于37 ℃、150 r·min-1搖床中振蕩復(fù)蘇40 min，涂布抗生素平板，最后37 ℃過夜培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。

2.1.3 甘油-聚乙二醇法

甘油-聚乙二醇法(Glycerin-PEG，G-PEG)屬于高效感受態(tài)細(xì)胞制備方法，利用化學(xué)試劑在低溫下與細(xì)菌質(zhì)膜的相互作用，增加膜表面通透性，降低外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部難度，在一定條件下使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞[13]。G-PEG法比CaCl2法更容易在0 ℃低溫下保存感受態(tài)細(xì)胞，相較于CaCl2法，G-PEG法存儲液中多了甘油、葡萄糖保護(hù)劑，-30 ℃以下也可使感受態(tài)細(xì)胞保存至少180 d，其機(jī)制可能為含有少量水分的結(jié)晶化合物和部分膠態(tài)物質(zhì)的結(jié)合可以對菌種產(chǎn)生更好的保護(hù)作用，PEG作為一種多糖類物質(zhì)在促進(jìn)細(xì)胞膜和質(zhì)粒DNA結(jié)合的過程中發(fā)揮重要作用[14]。黃學(xué)娟等[15]將高分子量的PEG應(yīng)用于感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中，在28 ℃培養(yǎng)細(xì)菌至OD600值為0.6時，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率隨PEG4000濃度的增加而提高，PEG4000濃度高于0.5%時，轉(zhuǎn)化效率下降，PEG4000的最適濃度為0.5%。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，黏合劑的使用有利于質(zhì)粒DNA貼附于感受態(tài)細(xì)胞，以便熱激時能夠進(jìn)入細(xì)胞，提高感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。此外，黃學(xué)娟等[15]首次將有機(jī)硅表面活性劑Silwet L-77用于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，SilwetL-77的加入可以顯著提高大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率。0.0015%的Silwet L-77為質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化的最佳條件，0.002%的Silwet L-77為質(zhì)粒pBI121轉(zhuǎn)化的最佳條件。楊坤等[16]研究發(fā)現(xiàn)DMSO的保存效果優(yōu)于甘油，以DMSO作為大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞凍存保護(hù)劑在-80 ℃超低溫條件下可以保存60 d,其轉(zhuǎn)化效率依然達(dá)到1.1×107CFU·μg-1。

RAJAGOPAL等[17]對一步法進(jìn)行改進(jìn)，使用含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的緩沖液制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過程簡單易行，且重復(fù)性高，含CTAB的緩沖液可以更有效攝取質(zhì)粒DNA并連接反應(yīng)產(chǎn)物。將細(xì)胞與1～10 μg·mL-1CTAB混合，孵育，緩沖液洗滌，剩余未使用的感受態(tài)細(xì)胞可以冷凍在10%甘油中。轉(zhuǎn)化時，將質(zhì)粒DNA和細(xì)胞混合并在4 ℃下孵育5～60 min，此時孵育時間變化對后續(xù)過程影響不大，并且無需加熱脈沖。1 μg·mL-1的CTAB最適合轉(zhuǎn)化且具有抗性，5～10 μg·mL-1的CTAB會破壞大腸桿菌的細(xì)胞壁，細(xì)胞壁通透性越高，攝取DNA能力越強(qiáng)，該方法快速高效，可以產(chǎn)生105～109CFU·μg-1質(zhì)粒DNA。

2.2 物理法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

2.2.1 電轉(zhuǎn)化技術(shù)

電轉(zhuǎn)化技術(shù)(electrotransformation technology)也被稱為電穿孔技術(shù)，是利用電脈沖瞬時電擊細(xì)胞膜提高其通透性，促進(jìn)大分子或親水性分子進(jìn)入細(xì)胞的方法，最早用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞。該法效率高，結(jié)果穩(wěn)定。電轉(zhuǎn)化技術(shù)可以滿足構(gòu)建大容量基因文庫和抗體庫的需要，瞬間電擊脈沖可以使細(xì)胞表面出現(xiàn)暫時性小孔，電擊作用使孔隙通道變大，促進(jìn)細(xì)胞融合，方便外源DNA進(jìn)入。但電轉(zhuǎn)化技術(shù)受到諸多條件影響，如電場強(qiáng)度、脈沖時間、質(zhì)粒DNA生長狀態(tài)等。

感受態(tài)細(xì)胞生長狀態(tài)：早于或晚于對數(shù)生長期的細(xì)胞在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時轉(zhuǎn)化效率均不理想，增加供體細(xì)胞數(shù)量也可以提高轉(zhuǎn)化效率[18]。OD600值維持在細(xì)胞對數(shù)生長早中期時最宜制備感受態(tài)細(xì)胞[19-20]。對數(shù)生長晚期的細(xì)菌發(fā)生老化，隨OD600值增加轉(zhuǎn)化效率降低。電轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒DNA含量在一定程度上成正比，過量或體積過大的質(zhì)粒DNA不能提高轉(zhuǎn)化效率。

電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度對DNA和細(xì)胞影響較為復(fù)雜。在DNA和細(xì)胞接受電脈沖的早期，兩者由隨機(jī)分布轉(zhuǎn)為向陽極運(yùn)動，而晚期的DNA則分布于細(xì)胞外膜或胞質(zhì)間隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞胞漿則是在37 ℃孵育過程中，雖然高場強(qiáng)的電脈沖可以完成這個過程，但電荷累積到一定程度的低場強(qiáng)也可以使細(xì)胞膜表面形成孔道，但此狀態(tài)下的細(xì)胞由于內(nèi)含物質(zhì)外流極易死亡[21]，因此適當(dāng)?shù)拿}沖強(qiáng)度可以在保證細(xì)胞狀態(tài)良好的同時提高轉(zhuǎn)化效率，否則過高的電場強(qiáng)度會使部分細(xì)胞在大量外源生物大分子物質(zhì)涌入后由于不能承受過高的場強(qiáng)而破裂死亡，造成無效轉(zhuǎn)化。劉麒等[22]在研究大腸桿菌TG1對pDJ01質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化條件時摸索出最適電壓為1 800 V、電容25 μF、電阻200 Ω，此時對細(xì)胞損傷最小，轉(zhuǎn)化效率最高。4 ℃以下的低溫環(huán)境收集感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行電穿孔有助于獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，推測低溫轉(zhuǎn)化有助于維持細(xì)胞存活率，減少電擊對細(xì)胞造成的熱損傷。此外，低溫下的細(xì)胞活性降低，對外界刺激的敏感性也隨之降低，有利于細(xì)胞膜形成的孔隙開啟時間延長，使更多的外源DNA進(jìn)入[23]。

2.2.2 超聲波轉(zhuǎn)化

隨著功率超聲波設(shè)備的發(fā)展，依賴于聲孔效應(yīng)的超聲波轉(zhuǎn)化逐漸發(fā)展成為一種較理想的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。存在于液體中的微氣核空化泡在聲波的作用下振動，當(dāng)聲壓達(dá)到一定值時會發(fā)生急劇崩潰，在強(qiáng)大的拉應(yīng)力作用下將液體“撕開”成一空洞，這一過程稱之為“超聲波空化”。利用超聲波技術(shù)可以使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁表面產(chǎn)生許多可逆的空隙，瞬時破壞細(xì)胞膜后可以將藥物或基因整合到活細(xì)胞中[24]。

超聲波頻率：2007年SONG等[25]首次在低頻波段超聲波40 kHz，超聲暴露時間10 s，50 mmol·L-1CaCl2，22 ℃，質(zhì)粒濃度0.8 ng·mL-1的條件下將質(zhì)粒pBBR1MCS2轉(zhuǎn)入革蘭氏陰性菌DH5α、惡臭假單胞菌UWC1以及熒光假單胞菌SBW25，這一研究初步證實超聲波介導(dǎo)的原核生物轉(zhuǎn)化是可行的。YANG等[26]在申報專利中報道多種革蘭氏陽性菌混合菌群的轉(zhuǎn)化實驗，發(fā)現(xiàn)化合物的直徑應(yīng)小于75 nm，且化合物越小轉(zhuǎn)化越容易；超聲波最適轉(zhuǎn)化頻率為40 kHz，這與SONG等的研究結(jié)果一致；最適電能值為0.05～0.20 W/cm2；超聲波轉(zhuǎn)化過程持續(xù)時間至少5 s，不能超過1 min。孫尚琛[27]在利用超聲波介導(dǎo)質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化DH5α感受細(xì)胞時將超聲條件設(shè)置為35 ℃、40 W、OD600值為0.4～0.6、25 s，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1.006×107CFU·μg-1質(zhì)粒DNA，超出一般化學(xué)轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化率。

細(xì)胞膜通透性與DNA質(zhì)粒濃度：細(xì)胞壁成分肽聚糖(PG)與二價金屬離子結(jié)合可以為外源DNA進(jìn)入菌體開辟通道，但PG與二價金屬離子(Ca2+、Mg2+)并非特異性吸附，一價金屬離子(Na+、K+)也具有類似的吸附作用，這與之前報道的PG只與二價金屬離子吸附并不完全符合[28]。經(jīng)超聲波處理過的感受態(tài)細(xì)胞表面出現(xiàn)凹凸不平的褶皺，大小不均一，雖然細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，但轉(zhuǎn)化效率的改變與細(xì)胞膜通透性變化并不成正比，超聲波介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并非完全是細(xì)胞膜通透性改變的結(jié)果，細(xì)胞膜通透性改變只是解除外源物質(zhì)進(jìn)入胞體的通道屏障。張慧等[29]在研究大腸桿菌BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化條件時發(fā)現(xiàn)，OD600值為0.6、超聲場強(qiáng)設(shè)置為400 W、質(zhì)粒濃度在0.01～0.20 g·L-1，轉(zhuǎn)化效率隨DNA量的增加而呈明顯上升趨勢；DNA質(zhì)粒濃度達(dá)到0.2 g·L-1以后，轉(zhuǎn)化效率的上升趨勢趨于平緩，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)1.3×103CFU·μg-1質(zhì)粒DNA。

3 影響大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化的不利因素

為提高大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，除不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)化參數(shù)和實驗條件外，還需避免影響制備和轉(zhuǎn)化的不利因素。宴國洪[3]在對大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)，過久過快的離心易造成部分細(xì)胞損傷，從而降低轉(zhuǎn)化效率，所以不能一味追求沉淀效果而過快過久的離心。使用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞時需注意CaCl2溶液的處理方式，高溫滅菌的CaCl2溶液并不能有效去除溶液中的雜質(zhì)，反而容易導(dǎo)致溶劑減少，形成沉淀物，影響溶液pH值；過濾后的CaCl2溶液可避免上述缺點，所以保持液體的穩(wěn)定性、防止污染對提升轉(zhuǎn)化效果十分重要。為減少分裝過程中產(chǎn)生的污染，將常規(guī)50 mL大容量的離心管改成1.5 mL的EP管，可在防止污染的同時提高轉(zhuǎn)化效率，節(jié)約成本[7]。低溫可以延長感受態(tài)細(xì)胞的保存時間，溫度越低保存時間越久，但長期低溫凍存會明顯降低菌體細(xì)胞后期使用時的轉(zhuǎn)化效率，所以在制備感受態(tài)細(xì)胞時應(yīng)盡量避免過久凍存而影響轉(zhuǎn)化效果[16]。

4 結(jié) 語

外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞已成為基因工程及DNA克隆技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)與核心，是現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室常用的技術(shù)手段，以上是實驗室制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的常用方法，此外還有RbCl(氯化銣)法、Inoue法等。各種方法都有各自的優(yōu)缺點，各實驗室在制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞時應(yīng)根據(jù)自己實驗室情況和實驗?zāi)康倪x擇低耗高效的方法，以最低成本制備出符合要求的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。