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    散葉生菜多酚的提取工藝優(yōu)化

    2022-03-10 08:05:02陳志迪張思寧鐘連全易欣欣高秀芝
    關(guān)鍵詞:散葉生菜乙醇

    陳志迪,張思寧,夏 凡,鐘連全,易欣欣,高秀芝*

    (1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.北京市昌平區(qū)種子管理站,北京 102200)

    植物多酚是一種小分子天然有機(jī)化合物,由植物生長發(fā)育代謝活動(dòng)而產(chǎn)生,廣泛存在于植物的表皮、根系、葉和果實(shí)中[1]。植物多酚屬于芳香族羥基化合物,根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為兩大類:一類是類黃酮,包括黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類等;另一類是非類黃酮,包括芪類、單寧、酚酸類等[2]。多酚具有抑菌[3]、預(yù)防糖尿病和心血管疾病[4-5]、促進(jìn)抗癌細(xì)胞增殖[6]等生物活性。以植物多酚為原料的天然防腐劑因其性能高效、安全性好,且具有一定營養(yǎng)價(jià)值,廣泛用于食品工業(yè)領(lǐng)域[7]。

    生菜(LactucasativaL.)又名葉用萵苣、鵝子菜、麥子菜、萵籽菜,為一年生或二年生草本植物[8]。食用方法多樣,因其口感清脆、營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富,作為生食蔬菜廣受大眾歡迎[9]。生菜起源于歐洲,從東南沿海地區(qū)引進(jìn)至中國[10]。PEPE等[11]研究表明,萵苣中含有羥基肉桂酸、鄰氧萘酮、黃烷醇等16種多酚類化合物,具有良好的抗氧化和抗炎活性。MARTíNEZ-SáNCHEZ等[12]研究發(fā)現(xiàn)綠葉萵苣主要含酚酸類物質(zhì),紫葉萵苣中含豐富的黃酮醇。

    多酚的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[13]。超聲輔助提取法操作過程簡單,成本低廉,是目前應(yīng)用最為廣泛的一種多酚提取方法。王佰靈等[14]利用Box-Behnken響應(yīng)面法對景天三七總多酚的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化因素包括液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度。

    該試驗(yàn)擬采用超聲輔助提取法,利用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度4個(gè)因素對散葉生菜中的多酚提取量的影響,優(yōu)化散葉生菜多酚的提取工藝,確定散葉生菜多酚提取的最佳工藝條件,比較5種散葉生菜多酚的含量。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    原料散葉生菜,其中提取條件優(yōu)化所用散葉生菜購自北京農(nóng)學(xué)院超市;北散生1號(hào)、北散生2號(hào)、北紫生1號(hào)、北紫生2號(hào)、北紫生3號(hào)來自昌平農(nóng)作物試驗(yàn)展示基地;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇,分析純:北京東方博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司。

    真空冷凍干燥機(jī)(CHRIST凍干機(jī)有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

    1.2 方 法

    1.2.1 提取工藝 新鮮散葉生菜葉片30 g,真空冷凍干燥24 h,粉碎后過250 μm篩,超聲輔助乙醇浸提,8 000 r/min離心15 min,得到多酚粗提液。

    1.2.2 多酚含量的測定 散葉生菜中多酚含量的測定采用福林酚法[15],按公式1計(jì)算多酚含量mg/kg(以沒食子酸計(jì)),X為散葉生菜中多酚含量,mg/kg;C為標(biāo)準(zhǔn)曲線多酚質(zhì)量濃度,mg/mL;V1為稀釋體積,mL;V2為乙醇溶液體積,mL;V3為量取的多酚粗提液體積,mL;M為散葉生菜鮮重,g。

    X=(C×V1×V2)/(M×V3)×1 000

    (公式1)

    1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)康超等[16]的研究方法略作修改,在OD765 nm下測量吸光度??v坐標(biāo)為吸光度,橫坐標(biāo)為沒食子酸質(zhì)量濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3 散葉生菜中多酚提取工藝

    1.3.1 單因素試驗(yàn) 在料液比1∶30,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間60 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、75%和80%的條件下提取散葉生菜多酚,在OD765 nm下測定吸光度并計(jì)算多酚含量。

    在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間60 min,料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30,提取散葉生菜多酚,在OD765 nm下測定吸光度并計(jì)算多酚含量。

    在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶30,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間分別為30、45、60、90和120 min的條件下提取散葉生菜多酚,在OD765 nm下測定吸光度并計(jì)算多酚含量。

    在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶30,超聲時(shí)間60 min,超聲溫度分別為30、40、45、50和60 ℃的條件下提取散葉生菜多酚,在OD765 nm下測定吸光度并計(jì)算多酚含量。

    1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度作為4個(gè)因素,每個(gè)因素分別選取3個(gè)水平,進(jìn)行L9(34)四因素三水平正交試驗(yàn),以確定散葉生菜中多酚的最優(yōu)提取條件。以正交表中最佳組合為優(yōu)化組、正交試驗(yàn)各因素最佳水平組為對照組,對最優(yōu)條件組合進(jìn)行驗(yàn)證。

    表1 試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Level of experimental factors

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    每個(gè)試驗(yàn)都有3組平行,并將得到的數(shù)據(jù)取平均值。使用Excel軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析并繪圖,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析選用Excel-2016和SPSS19.0,差異顯著性為P<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

    根據(jù)沒食子酸的質(zhì)量濃度與吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y= 25.831X-0.0005,其中Y為吸光度,X為沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL),線性回歸系數(shù)R2= 0.9992。

    圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

    2.2 單因素試驗(yàn)

    2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對散葉生菜多酚提取量的影響 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)散葉生菜多酚的提取量達(dá)到最大值,為522.16 mg/kg(圖2)。出現(xiàn)這種情況可能由于多酚的結(jié)構(gòu)中帶有羥基具有一定極性,乙醇與多酚的極性越接近,各物質(zhì)之間的化學(xué)鍵越容易被破壞,則多酚提取量越高[17]。乙醇體積分?jǐn)?shù)選取60%~75%這個(gè)區(qū)間繼續(xù)后續(xù)正交試驗(yàn)。

    圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

    2.2.2 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響如圖3所示。在料液比1∶15時(shí)散葉生菜中多酚提取量達(dá)到最大值,之后隨料液比的增大,散葉生菜多酚提取量下降??赡苁怯捎谠?∶15時(shí)多酚的溶解達(dá)到飽和,繼續(xù)增大料液比增大其他雜質(zhì)的溶出率,從而導(dǎo)致多酚提取量降低[18]。選取1∶10~1∶20這個(gè)區(qū)間的料液比進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

    圖3 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from leaf lettuce

    2.2.3 超聲時(shí)間對散葉生菜多酚提取量的影響 當(dāng)超聲時(shí)間60 min時(shí),散葉生菜中的多酚提取量達(dá)到最大值。隨著超聲時(shí)間的增大散葉生菜多酚提取量反而減少(圖4)。如果超聲時(shí)間太短,則多酚將無法充分溶解,提取率會(huì)偏低,如果超聲時(shí)間太長,會(huì)使提取溫度升高導(dǎo)致多酚受熱氧化分解,而且隨著提取溫度升高,細(xì)胞通透性增大,其他物質(zhì)的溶出也會(huì)影響提取率[19]。超聲時(shí)間選取45~90 min這個(gè)區(qū)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

    圖4 超聲時(shí)間對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

    2.2.4 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響 隨著超聲溫度的增加,散葉生菜多酚提取量先略有下降后上升至頂峰最后又下降(圖5)。在50 ℃時(shí)多酚提取量最高。超聲溫度的升高促進(jìn)多酚的溶解,但如果超聲溫度過高,則散葉生菜的多酚會(huì)熱分解,破壞已提取出多酚的結(jié)構(gòu),使多酚得率降低[20]。后續(xù)正交試驗(yàn)選擇45~60 ℃這個(gè)范圍內(nèi)的超聲溫度。

    圖5 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

    2.3 正交試驗(yàn)

    表2為正交試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)R值大小可以看出各因素對散葉生菜多酚提取量的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比;正交試驗(yàn)得出最優(yōu)工藝組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶20、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃。

    方差分析見表3。乙醇體積分?jǐn)?shù)F值6.461,料液比F值0.194,超聲時(shí)間F值1.519,超聲溫度F值3.940。從而可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01),超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05),而料液比和超聲時(shí)間對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)。

    表2 散葉生菜多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果表(L934)Tab.2 Orthogonal test results (L934) of leaf lettuce polyphenols

    乙醇體積分?jǐn)?shù)對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01),可選擇75%;超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05),可選擇60 ℃;而料液比和超聲時(shí)間均對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05),且根據(jù)k值的大小發(fā)現(xiàn)料液比1∶10與1∶20的均值相差不大,故從成本方面考慮,可選最佳料液比為1∶10,而超聲時(shí)間60 min值最大,故超聲時(shí)間60 min為最佳可取值。

    超聲提取工藝的最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶10、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃,這是理論上超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件。

    表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab.3 Orthogonal experiment results analysis of variance table

    2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

    驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。多酚提取量分別為(1 233.5±49.7)mg/kg、(1 152.6±25.5)mg/kg和(1 128±12.53)mg/kg,超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶10、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃。

    表4 散葉生菜多酚提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表Tab.4 Validation test result table of polyphenol extraction technology from leaf lettuce

    2.5 不同品種散葉生菜多酚含量

    選用最佳提取工藝對5種散葉生菜的多酚進(jìn)行提取,測定含量見圖6。不同品種散葉生菜之間多酚含量存在差異,其中北紫生1號(hào)多酚含量顯著高于其他品種(P<0.05),含量為(1 176±48.5) mg/kg;北散生2號(hào)的含量最低為(622.3±65.2) mg/kg。

    注:ab表示差異顯著(P<0.05)。Note:ab means significant difference (P<0.05).圖6 不同品種散葉生菜多酚含量Fig.6 Contents of polyphenols in different varieties of leaf lettuce

    3 討 論

    該試驗(yàn)通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化散葉生菜多酚超聲輔助提取的最佳工藝,多酚可以溶于水和醇類、醚類、酮類等有機(jī)溶劑[21],常用的有機(jī)溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮等,乙醇毒性小、回收率高,所以該試驗(yàn)選用乙醇作為提取溶劑。楊文娟等[22]對花生多酚的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,各因素對提取量的影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間。在該試驗(yàn)中,4種因素對散葉生菜多酚提取量的影響程度與楊文娟等[22]研究結(jié)果大致相同,乙醇體積分?jǐn)?shù)影響是最大的,其次是超聲溫度,雖然超聲時(shí)間和料液比的結(jié)果不一致,但是這兩種因素影響較小。用最優(yōu)提取工藝提取5種不同的散葉生菜多酚,不同品種散葉生菜多酚含量存在差異,楊曉等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)不同品種生菜酚類物質(zhì)含量存在差異,即使相同品種,由于光照和采收時(shí)間不同,總酚含量也有差異。

    該試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度對散葉生菜中多酚提取量的影響,各因素的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比;最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶10、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃;北紫生1號(hào)的多酚含量顯著高于其他品種,為(1 176±48.5)mg/kg。

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