格里菲斯肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞機(jī)制

王 妍 沈 帆

(南京師范大學(xué)教師教育學(xué)院 210009)

李建宏*

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 210046)

1 肺炎雙球菌

肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)是革蘭氏陽(yáng)性菌，屬鏈球菌科鏈球菌屬，是兼性厭氧鏈球菌。在19世紀(jì)末期，肺炎雙球菌被認(rèn)定為是導(dǎo)致肺炎的一大原因，是許多體液免疫研究的主題。肺炎雙球菌可無(wú)癥狀駐留在健康帶菌者的鼻咽部、呼吸道，鼻竇和鼻腔是通常被感染的部分。然而，對(duì)于易感人群(如免疫力低下的老年人和兒童)，它們有可能成為致病性因素[1]。它們擁有的多糖莢膜充當(dāng)著生物體毒力因子，根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，可將其分為90多種不同的血清型，不同的類型毒力、發(fā)病率和耐藥性的程度不同[2]。

根據(jù)肺炎雙球菌的菌落特征，肺炎雙球菌分為兩種類型：光滑型(S)和粗糙型(R)。S型細(xì)菌的菌體是有莢膜的，通常有毒性，而R型細(xì)菌無(wú)莢膜，無(wú)毒性。這里所說的毒性并不是說莢膜有毒性，莢膜只是細(xì)菌細(xì)胞壁外的一層較松厚且較固定的粘性物質(zhì)，主要由水、多糖或多肽組成[3]。這層莢膜，可作為S型菌的保護(hù)層，在侵染的生物體內(nèi)，可以抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬和消化作用，從而能夠迅速繁殖、擴(kuò)散，引起機(jī)體發(fā)生疾病。而R型菌無(wú)莢膜，可被吞噬細(xì)胞吞噬，不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體患病。所以細(xì)菌是否致病，關(guān)鍵是看有無(wú)莢膜。

2 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化過程

1928年格里菲斯用肺炎雙球菌在小鼠身上進(jìn)行了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的現(xiàn)象，格里菲斯認(rèn)為：S型死菌細(xì)胞中有某種物質(zhì)進(jìn)入R型活菌細(xì)胞，從而使R型菌轉(zhuǎn)化為S型菌。后來(lái)艾弗里等人用生物化學(xué)方法明確這種物質(zhì)是DNA。

那么S型菌的哪段DNA進(jìn)入R型菌了呢？盡管肺炎雙球菌的種類很多，但經(jīng)過測(cè)序發(fā)現(xiàn)莢膜基因的位點(diǎn)幾乎都位于染色體上的dexB基因與aliA基因之間[4]。在dexB和aliA基因之間，包含編碼莢膜合成的相關(guān)基因，包括多糖的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、與脂質(zhì)載體連接等過程所需要酶的基因，形成的莢膜可以保護(hù)肺炎鏈球菌逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的吞噬作用，有助于細(xì)菌在宿主中存活。由此可以確定，格里菲斯實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)入R型菌的是S型菌染色體上的帶有莢膜基因的DNA片段。

在肺炎球菌轉(zhuǎn)化過程中，外部的DNA片段是怎么進(jìn)入R型菌的呢？這其實(shí)是一個(gè)細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化過程——具備自然轉(zhuǎn)化能力的細(xì)胞可以自發(fā)地從外界獲取DNA，其中具備攝取外源DNA能力的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞。這個(gè)轉(zhuǎn)化的過程大致分為三步：首先，R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞，接著感受態(tài)細(xì)胞攝取外源DNA，最后外源DNA在該細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。

2.1 R型菌成為感受態(tài)細(xì)胞 成為感受態(tài)細(xì)胞是攝取外源DNA的前提。肺炎雙球菌感受態(tài)的調(diào)控主要涉及五個(gè)蛋白(ComABCDE)，它們共同組成一個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)。ComC編碼感受態(tài)信息素(CSP)前體，當(dāng)細(xì)胞外CSP積累到可以發(fā)生感受態(tài)臨階濃度時(shí)，與膜結(jié)合蛋白ComD結(jié)合使其磷酸化，當(dāng)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ComE上，它被激活并刺激大約20個(gè)早期感受基因轉(zhuǎn)錄，包括編碼ComABCDE的基因、sigma因子ComX和免疫蛋白ComM。ComABCDE表達(dá)的增加，形成了一個(gè)自動(dòng)催化回路，使細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)[5]。

2.2 攝取外源DNA 由于高溫加熱S菌，使其死亡，所以細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的DNA被釋放出來(lái)。此時(shí)，R型菌感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化菌毛，它可以結(jié)合雙鏈DNA，從而使其穿過R菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜[6]。當(dāng)然這只是一種假設(shè)，還需要更多的證據(jù)來(lái)證明。在細(xì)胞膜上相關(guān)的核酸內(nèi)切酶降解雙鏈中非轉(zhuǎn)化的一條DNA單鏈，同時(shí)，那條互補(bǔ)鏈進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[7]。單鏈DNA進(jìn)入與降解的過程幾乎是同步進(jìn)行的。

2.3 外源DNA進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行同源重組 進(jìn)入R菌細(xì)胞質(zhì)的單鏈DNA片段被SsbB(單鏈DNA結(jié)合蛋白)包裹，以防其被核酸酶降解，并為重組做好準(zhǔn)備[5]。因?yàn)镽菌的基因組與轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的S菌單鏈DNA有很多同源的區(qū)域，所以被轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的單鏈DNA可以整合到R菌的染色體上，從而使R菌的基因組發(fā)生改變，由于重組的這段DNA片段攜帶莢膜基因，所以使R型菌恢復(fù)了產(chǎn)生莢膜的能力，這樣經(jīng)過細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子代細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生莢膜，成為S菌。

3 外源DNA進(jìn)入受體細(xì)菌細(xì)胞的方式

細(xì)菌攝入外源DNA主要有三個(gè)方式：轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。格里菲斯的實(shí)驗(yàn)就是轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在自然情況下，某些細(xì)菌溶解以后釋放的DNA不通過其他媒介被其他細(xì)菌吸收而發(fā)生轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在我們說到的轉(zhuǎn)化，經(jīng)常是指基因工程實(shí)驗(yàn)過程中，從細(xì)菌里面純化的 DNA 分子直接導(dǎo)入遺傳性狀相異的細(xì)菌，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用的是純化的質(zhì)粒 DNA 本身，沒有任何媒介幫助。從這個(gè)概念的內(nèi)涵來(lái)說，只要 DNA 進(jìn)入細(xì)菌，就完成了轉(zhuǎn)化過程，這里不涉及轉(zhuǎn)化的 DNA 是否復(fù)制，也不涉及是否改變細(xì)菌的遺傳性狀，以及外源基因是否表達(dá)等。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA要通過復(fù)制、基因表達(dá)、或者整合進(jìn)受體菌的染色體，才最終完成轉(zhuǎn)基因的過程。

接合是在細(xì)胞與細(xì)胞接觸時(shí)發(fā)生的，兩個(gè)細(xì)胞接觸處形成結(jié)合通道，單鏈DNA可以通過這個(gè)通道從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。最先被發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌接合作用時(shí)被轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒是大腸桿菌Escherichiacoli的F因子，一種微小的質(zhì)粒，不是每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中都含有這種游離的F因子，只有供體細(xì)胞才有F因子，這種菌株被稱為F+，受體細(xì)胞沒有F因子，這種菌株稱為F-。F+細(xì)胞利用性菌毛識(shí)別F-細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞膜的融合，形成細(xì)胞質(zhì)橋。F因子是環(huán)狀雙鏈DNA，在轉(zhuǎn)入之前，其中的一條單鏈被切開，以切口為起點(diǎn)，將此單鏈傳到F-細(xì)胞，然后以單鏈為模板合成完整的F因子。通過接合作用受體細(xì)胞可以得到不同的抗性基因或新的代謝基因組，從而在不同的環(huán)境下生存。

轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過病毒將一個(gè)細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞中而引起的基因重組現(xiàn)象。轉(zhuǎn)導(dǎo)這個(gè)概念涉及三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：病毒、宿主DNA、整合。轉(zhuǎn)導(dǎo)通常以噬菌體為媒介，用噬菌體的外殼將外源DNA包裹進(jìn)去，成為有活力的噬菌體，然后以感染的方式將DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，從而使目的基因在該菌中復(fù)制繁衍。噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)提高了外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌的效率，經(jīng)常被用于DNA文庫(kù)的建立。

4 總結(jié)

對(duì)于格里菲斯的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確揭示進(jìn)入到R型菌并與染色體發(fā)生重組的是S型菌的染色體DNA片段。S菌的DNA進(jìn)入R型菌的前提是R型菌為感受態(tài)細(xì)胞，在此情況下，R菌可以攝取S菌的DNA片段，并通過各種調(diào)控機(jī)制使S菌的DNA以單鏈的形式進(jìn)入，進(jìn)入R菌細(xì)胞的DNA片段最終與R菌的染色體發(fā)生同源重組，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂挟a(chǎn)莢膜能力的S菌。

(*通信作者)