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    蘇云金芽胞桿菌高效電轉(zhuǎn)化方法的建立

    2013-10-11 11:22:38李宇晟胡曉鳳丁學(xué)知夏立秋胡勝標(biāo)
    關(guān)鍵詞:感受態(tài)緩沖液蛋白酶

    李宇晟,張 旭,胡曉鳳,丁學(xué)知,夏立秋,胡勝標(biāo)

    (湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖南省微生物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,中國(guó)長(zhǎng)沙 410081)

    蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌,廣泛分布于土壤中.由于Bt在芽胞形成期能產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白,現(xiàn)已被應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治[1].為了提高Bt的殺蟲毒力、拓寬殺蟲譜、延緩昆蟲抗性產(chǎn)生,利用外源基因?qū)隑t野生型菌株中以構(gòu)建具有更高殺蟲活力、殺蟲譜更廣的工程菌已成為國(guó)內(nèi)外微生物農(nóng)藥發(fā)展的重要方向[2].外源基因?qū)隑t野生型菌株中常用的方法有原生質(zhì)體融合、接合轉(zhuǎn)移、電穿孔等.其中,原生質(zhì)體融合和接合轉(zhuǎn)移存在操作繁鎖、難度較大、穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)[3-4],而電穿孔轉(zhuǎn)化所需設(shè)備簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高,被廣泛運(yùn)用于Bt工程菌的構(gòu)建工作中[5-6].

    由于Bt屬于革蘭氏陽(yáng)性菌,在生理狀態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)上與革蘭陰性菌,如大腸桿菌(Escherich coli,簡(jiǎn)稱E.coli),存在很大差異,電轉(zhuǎn)化方法在Bt中的使用并不十分完善,其電轉(zhuǎn)化效率和重復(fù)性都還有待進(jìn)一步提高[7].在以往相關(guān)Bt電轉(zhuǎn)化方法的報(bào)道,多集中在質(zhì)粒鹽離子濃度、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電轉(zhuǎn)化參數(shù)等方面,不同實(shí)驗(yàn)組、不同Bt菌株間的電轉(zhuǎn)化方法和效率存在較大的差異.本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒加入Bt感受態(tài)細(xì)胞中很容易被降解,低濃度的質(zhì)粒直接影響了電轉(zhuǎn)化效率,而經(jīng)蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的降解作用大大下降,顯著提高了轉(zhuǎn)化效率.研究還對(duì)電轉(zhuǎn)化相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化,包括培養(yǎng)基成分及滲透壓、培養(yǎng)時(shí)間、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電場(chǎng)壓、質(zhì)粒DNA的濃度等.利用該方法,在Bt中建立了一種穩(wěn)定高效的電轉(zhuǎn)化方法.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)為本研究室選育的野生型Bt菌株.Bt菌株培養(yǎng)溫度為30℃.質(zhì)粒pHT315為E.coli-Bt穿梭載體,含有氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因(E.coli中的篩選基因)和紅霉素(Erythromycin)抗性基因(Bt中的篩選基因).

    1.1.2 培養(yǎng)基、緩沖液和試劑 BHI培養(yǎng)基:腦心浸液(Brian Heart Infusion,BHI)20 g/mL;BHIS培養(yǎng)基:BHI培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L山梨醇;電轉(zhuǎn)化緩沖液A:0.5 mol/L山梨醇,0.5 mol/L甘露醇,體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油(下同);電轉(zhuǎn)化緩沖液B:275 mmol/L蔗糖,10%甘油;電轉(zhuǎn)化緩沖液C:272 mmol/L蔗糖,0.5 mmol/L MgCl2;蛋白酶K:10 g/L;紅霉素:25 mg/L.

    1.2 方法

    1.2.1 引物 根據(jù)pHT315質(zhì)粒上紅霉素抗性基因(erm)序列,設(shè)計(jì)引物對(duì):Erm-S:ATGCCCTTAGAAGCAAACTTAAG;Erm-A:CCGATACAAATTCCCCGTAGG.

    1.2.2 Bt感受態(tài)細(xì)胞的制備 接種Bt菌株于10 mL培養(yǎng)基中(BHI培養(yǎng)基和BHIS培養(yǎng)基),30℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng).按體積2%的接種量轉(zhuǎn)接入50 mL新鮮BHIS培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣并在分光光度計(jì)(Bio-Rad SmartSpec plus,美國(guó))上測(cè)定OD600值.將菌體在冰上放置10 min,收集菌體.用500 μL電轉(zhuǎn)化緩沖液懸浮細(xì)胞,加入5 μL 10 g/L蛋白酶K(終濃度1 g/L),37℃孵育20 min.4℃,6 000 r/min離心5 min收集菌體,用預(yù)冷電轉(zhuǎn)化緩沖液洗滌細(xì)胞2次,用500 μL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液重懸細(xì)胞并分裝到無(wú)菌Ep管中(100 μL/管),-80 ℃冷凍保存待用.

    1.2.3 電轉(zhuǎn)化 取Bt感受態(tài)細(xì)胞1管(100 μL),手溫溶化,取100 ng pHT315質(zhì)粒與之重發(fā)混勻,轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中,設(shè)置電擊轉(zhuǎn)化儀(Eppendorf 2510,德國(guó))的電壓值,將轉(zhuǎn)化杯置于電擊槽中電擊一次.電擊完畢后立即冰上放置5 min,向杯中加入900 μL BHIS培養(yǎng)基,30℃ 1000 r/min培養(yǎng)2 h,涂布含有紅霉素(25 mg/L)的BHIS平板,培養(yǎng)12~24 h.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算轉(zhuǎn)化子平均數(shù)目.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

    Bt 4.0718菌株30℃震蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣并測(cè)定細(xì)胞量(OD600值),分別制備感受態(tài)細(xì)胞、電轉(zhuǎn)化pHT315質(zhì)粒,挑選轉(zhuǎn)化子用引物對(duì)(Erm-S/Erm-A)進(jìn)行菌落PCR鑒定,所獲得轉(zhuǎn)化子均為陽(yáng)性(圖1).當(dāng)Bt 4.0718 菌株細(xì)胞生長(zhǎng)到 OD600值0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 時(shí),在紅霉素平板分別獲得 35、107、294、321、126個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖2).這說(shuō)明,當(dāng)Bt 4.0718菌株細(xì)胞OD600值達(dá)0.6~0.8時(shí),最適合進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備,此時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高.

    圖1 菌落PCR檢測(cè)Bt轉(zhuǎn)化子Fig.1 Identification of Bt transformants by Colony PCR

    圖2 Bt細(xì)胞生長(zhǎng)量對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of Bt cell growth phase on transformation efficiency

    2.2 蛋白酶K對(duì)Bt轉(zhuǎn)化效率的影響

    將pHT315質(zhì)粒分別與未經(jīng)蛋白酶K處理和經(jīng)蛋白酶K處理的Bt感受態(tài)細(xì)胞孵育一段時(shí)間,觀察質(zhì)粒DNA量的變化.未處理的Bt感受態(tài)細(xì)胞與1 μg pHT315混合后孵育1 min,有將近50%(500 ng)的pHT315被降解;隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng),這種降解作用越來(lái)越大,當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到10 min,剩下的pHT315質(zhì)粒大約只有原來(lái)的20%(200 ng).而Bt感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K(終濃度為1 g/L)處理20 min后再與pHT315質(zhì)粒孵育,這種降解作用大大減弱:即使孵育10 min后,剩余的質(zhì)粒還有原來(lái)的80%(800 ng)左右(圖3).因?yàn)锽t感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)1 g/L的蛋白酶K處理后對(duì)質(zhì)粒DNA的降解作用減弱,最終獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量增加了近30倍.

    圖3 Bt感受態(tài)細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒pHT315的降解作用Fig.3 The degration effect of Bt competent cells to pHT315

    2.3 培養(yǎng)基中加入山梨醇對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響

    傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法中多使用BHI作為培養(yǎng)基,而電轉(zhuǎn)化緩沖液多為高滲環(huán)境,這樣細(xì)胞容易迅速死亡,從而影響電轉(zhuǎn)化效率.利用BHI培養(yǎng)Bt 4.0718菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行pHT315質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,最后獲得83個(gè)轉(zhuǎn)化子.當(dāng)在BHI中添加了0.5 mol/L山梨醇(BHIS培養(yǎng)基),相同條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目達(dá)到327個(gè),轉(zhuǎn)化率提高了近4倍.

    2.4 電轉(zhuǎn)緩沖液對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響

    為了獲得最佳Bt電轉(zhuǎn)緩沖液,對(duì)3種電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行了比較.在相同的條件下,電轉(zhuǎn)化緩沖液A(0.5 mol/L山梨醇,0.5 mol/L甘露醇,10%甘油);電轉(zhuǎn)化緩沖液B(275 mmol/L蔗糖,10% 甘油);電轉(zhuǎn)化緩沖液C(272 mmol/L蔗糖,0.5 mmol/L MgCl2)分別獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)目分別為297、314、308個(gè),表明3種電轉(zhuǎn)緩沖液對(duì)Bt電轉(zhuǎn)化效率影響差別不大.

    2.5 電轉(zhuǎn)化參數(shù)對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響

    電轉(zhuǎn)化參數(shù)中,電壓對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響最大.在1.5~2.5 kV的電壓范圍內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化.當(dāng)電壓為1 500、1 800、2 000、2 300、2 500 V 時(shí),分別獲得204、329、281、203、183 個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖4).電壓從1 500 V增加到1 800 V,轉(zhuǎn)化子數(shù)目增加了125個(gè),當(dāng)電壓繼續(xù)增加時(shí)電擊常數(shù)下降,2 500 V時(shí)的電擊常數(shù)只有3.6 ms.電壓增加導(dǎo)致電擊常數(shù)下降,令轉(zhuǎn)化子數(shù)量反而減少.因此,對(duì)Bt 4.071 8菌株進(jìn)行電轉(zhuǎn)時(shí)電壓為1 800 V為最佳.

    圖4 電壓對(duì)Bt電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系Fig.4 The effect of voltage on Bt electroporation efficiency

    3 討論

    文獻(xiàn)報(bào)道,許多細(xì)菌能合成核酸酶[8],這些核酸酶大多分泌到胞外,能迅速降解環(huán)境中的DNA.在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中,這些胞外核酸酶對(duì)質(zhì)粒DNA的降解作用大大降低電轉(zhuǎn)化效率.本研究發(fā)現(xiàn),將Bt感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒DNA孵育后,短時(shí)間內(nèi)大量的DNA被降解,而經(jīng)過(guò)終濃度為1 g/L的蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的降解作用就變得很小.由此推測(cè):Bt細(xì)胞能表達(dá)分泌核酸酶,它們對(duì)質(zhì)粒的降解作用對(duì)電轉(zhuǎn)化效率具有負(fù)面影響.蛋白酶K處理Bt細(xì)胞時(shí)間以20 min為最佳,時(shí)間太短則核酸酶不能充分消化,時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致Bt細(xì)胞死亡.

    Bt細(xì)胞的培養(yǎng)是影響電轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)關(guān)鍵因素.當(dāng)OD600在0.6~0.8時(shí),Bt細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定期細(xì)胞相對(duì)疏松,有利于孔洞的形成和外源DNA通過(guò)孔洞進(jìn)入細(xì)胞[9],從而提高電轉(zhuǎn)化效率.而培養(yǎng)基的成分也將影響到Bt電轉(zhuǎn)化效率.以往在制備Bt感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程中,直接將菌體轉(zhuǎn)移到高滲電轉(zhuǎn)化緩沖液當(dāng)中,而滲透壓的突然改變會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害作用,導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡,獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目非常少.當(dāng)在BHI培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L山梨醇后,細(xì)胞有了適應(yīng)高滲電轉(zhuǎn)化緩沖液的能力,細(xì)胞存活率大大提高,而且復(fù)蘇培養(yǎng)基中山梨醇的加入,使得Bt感受態(tài)細(xì)胞電擊以后,細(xì)胞得到了高滲溶液的有效保護(hù),細(xì)胞死亡率大大降低,也有利于提高電轉(zhuǎn)效率[10-11].

    影響電轉(zhuǎn)效率的另一個(gè)因素是電擊參數(shù)中的電壓值.電穿孔轉(zhuǎn)化的主要原理是利用瞬時(shí)的高強(qiáng)度電場(chǎng)使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變,從而使DNA順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).電擊過(guò)程中,電壓過(guò)低,細(xì)胞難以極化產(chǎn)生孔洞,DNA不能進(jìn)入;電壓過(guò)高,則會(huì)因細(xì)胞膜損傷過(guò)大而死亡,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低[12].對(duì)于不同的細(xì)菌細(xì)胞,電壓值存在較大差異.作者的研究表明,在1 800 V時(shí),Bt 4.071 8菌株能獲得最多的轉(zhuǎn)化子.

    此外,還存在其他一些影響B(tài)t電轉(zhuǎn)化效率的因素:不同Bt菌株轉(zhuǎn)化效率存在差異;大分子量質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率要低于小分子量質(zhì)粒;同一質(zhì)粒的超螺旋型電轉(zhuǎn)化效率要高于開環(huán)狀和線性質(zhì)粒;使用低濃度抗生素篩選轉(zhuǎn)化子比高濃度抗生素能獲得更多轉(zhuǎn)化子.

    本研究通過(guò)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵因素,獲得了適用Bt的高效電轉(zhuǎn)化條件:Bt生長(zhǎng)在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)OD600至0.6~0.8,感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)1 g/L蛋白酶K處理20 min,電壓為1 800 V時(shí),可以獲得最高轉(zhuǎn)化效率.

    [1]HU S B,LIU P,DING X Z,et al.Efficient constitutive expression of chitinase in the mother cell of Bacillus thuringiensis and its potential to enhance the toxicity of Cry1Ac protoxin [J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,82(6):1157-1167.

    [2]GUAN P,AI P,DAI X,et al.Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis serovar sichuansis strain MC28[J].J Bacteriol,2012,194(24):6975.

    [3]XIAO M H,BJARNE M H,JORGEN E.Conjugative transfer,stability and expression of a plasmid encoding a cry1Ac gene in Bacillus cereus group strains[J].FEMS Microbiol Lett,2004,231(4):45-52.

    [4]YU J,PANG Y,TANG M,et al.Highly toxic and broad-spectrum insecticidal Bacillus thuringiensis engineered by using the transposon Tn917 and protoplast fusion [J].Curr Microbiol,2001,43(6):112-119.

    [5]PENG D,LUO Y,GUO S,et al.Elaboration of an electroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis[J].J Appl Microbiol,2009,106(6):1849-1858.

    [6]MONTHES H C,RUIZ M R,MAGANA P I.Efficient transformation of Cellulomonas flavigena by electroporation and conjugation with Bacillus thuringiensis[J].Curr Microbiol,2004,49(8):428-432.

    [7]MESRATI L A,KARRAY M D,TOUNSI S,et al.Construction of a new high-copy number shuttle vector of Bacillus thuringiensis[J].Lett Appl Microbiol,2005,41(4):361-366.

    [8]PEDIADITAKIS M,KAUFENSTEIN M,GRAUMANN P L.Bacillus subtilis hlpB encodes a conserved stand-alone HNH nuclease-like protein that is essential for viability unless the hlpB deletion is accompanied by the deletion of genes encoding the Add-AB DNA repair complex[J].J Bacteriol,2012,194(22):6184-6194.

    [9]TROND E V A,F(xiàn)INN L A.Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed [J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,85(5):1301-1313.

    [10]FATMA M M,CARLOS D,MARC B.High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant[J].Anal Biochem,2012,424(2):127-129.

    [11]ZHANG H L,LI Y T,CHEN X M,et al.Optimization of electroporation conditions for Arthrobacter with plasmid PART2[J].J Microbiol Meth,2011,84(1):114-120.

    [12]LANCKRIET A,TIIMBERMONT L,HAPPONEN L J,et al.Generation of single-copy transposon insertions in clostridium perfringens by electroporation of phage Mu DNA transposition complexes[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(9):2638-2642.

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