松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析

姜巨全，孫開福，楊立娜，陳 金，張正來

松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析

姜巨全，孫開福，楊立娜，陳 金，張正來

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為分析編碼多亞基鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Group 2型mrp（mrp2）操縱子耐鹽堿能力，首先構(gòu)建mrp2自殺質(zhì)粒pK18mobsacB-mrp2-NcoI，電轉(zhuǎn)化野生型菌株-松嫩鹽單胞菌（Halomonassongnenensis）NEAU-ST10-39T，基于以上基因敲除原理獲得mrp2敲除菌株。PCR驗(yàn)證及測(cè)序結(jié)果表明，成功獲得mrp2敲除菌株，并將其命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2。為進(jìn)一步驗(yàn)證突變株正確性，構(gòu)建重組穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2，轉(zhuǎn)化敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2，獲得轉(zhuǎn)化子命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。耐鹽堿測(cè)試顯示，NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2表現(xiàn)出與野生型菌株類似耐鹽堿能力，進(jìn)一步證實(shí)敲除菌株NEAUST10-39T-△mrp2構(gòu)建正確；隨NaCl濃度和pH升高，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長(zhǎng)受到抑制，表明mrp2對(duì)宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件下生長(zhǎng)具有重要作用。電轉(zhuǎn)化方法可避免pK18mobsacB在三親本接合過程中受體菌抗性篩選、突變株純化弊端，簡(jiǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入宿主程序；NEAU-ST10-39T-△mrp2成功構(gòu)建為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和揭示該基因耐鹽堿機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

松嫩鹽單胞菌；Group 2型Mrp；基因敲除；耐鹽堿

中度嗜鹽菌（Moderate halophile）是在3%～15%NaCl條件下最適合生長(zhǎng)微生物類群[1]。中度嗜鹽菌因其豐富耐鹽堿基因種類及復(fù)雜耐鹽堿機(jī)制，作為研究耐鹽堿分子機(jī)制重要對(duì)象備受關(guān)注[2-3]，在醫(yī)療環(huán)境改造、生物環(huán)保、污水處理等方面應(yīng)用廣泛[4-6]。Mrp系統(tǒng)是廣泛存在于包括中度嗜鹽菌在內(nèi)原核生物中一類單價(jià)陽離子/氫離子多亞基逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在維持胞內(nèi)Na+，K+和Li+等陽離子及pH平衡等方面起關(guān)鍵作用[7-8]。根據(jù)編碼基因數(shù)量差異，Mrp系統(tǒng)主要分兩大類：①Group 1型Mrp由7個(gè)基因（mrpABCDEFG）編碼，其中mrpA僅含1個(gè)mrpB結(jié)構(gòu)域，該類Mrp系統(tǒng)主要分布于金黃色葡萄球菌[9]、芽胞桿菌[10-12]和鹽單胞菌[13-14]；②Group 2型Mrp由6個(gè)基因（mrpA′CDEFG）編碼，與Group 1型Mrp主要差異是mrpA′除含mrpA結(jié)構(gòu)域外，還含2個(gè)mrpB結(jié)構(gòu)域，該類型Mrp系統(tǒng)主要分布于苜蓿中華根瘤菌[15]和霍亂弧菌[16]。

松嫩鹽單胞菌（Halomonassongnenensis）NEAUST10-39T是可在16%NaCl及pH 8堿性環(huán)境中生長(zhǎng)的中度嗜鹽菌[17]。從該菌中克隆出的mrp2是Group 2型Mrp系統(tǒng)操縱子，在異源宿主大腸桿菌（Esche?richia coli）中表現(xiàn)高效耐鹽堿能力。為進(jìn)一步探究mrp2在宿主菌中生理功能，本研究構(gòu)建mrp2敲除菌株并分析其耐鹽堿能力，結(jié)果顯示mrp2對(duì)宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件中生長(zhǎng)具有重要作用。本研究首次應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法，可避免pK18mob?sacB在三親本接合過程中受體菌抗性篩選、突變株純化弊端，簡(jiǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入宿主程序；同時(shí)為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和深入揭示其耐鹽堿機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和引物

主要菌株、質(zhì)粒及引物如表1所示。

1.1.2 主要儀器及試劑

高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo Scientific公司，超低溫冰箱購(gòu)自Thermo Scientific公司，培養(yǎng)箱購(gòu)自上海志成生物公司，水浴鍋購(gòu)自北京市永光明醫(yī)療儀器廠，電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)SIM公司，pH計(jì)購(gòu)自METTLER TOLEDO公司，高壓滅菌鍋購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Eppendorf公司，PCR儀購(gòu)自Eppendorf公司，紫外-可見光分光光度計(jì)購(gòu)自天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；核酸和蛋白Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs均購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Eco RI（15 U·μL-1）、SalⅠ（15 U·μL-1）、NcoⅠ（15 U·μL-1）等限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Takara生物公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

HLB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，制備固體平板時(shí)加入1.5%瓊脂；NaCl濃度按試驗(yàn)要求加入；pH調(diào)制：pH 5～6，醋酸和醋酸鈉緩沖液（100 mmol·L-1）；pH 7～9，BTP-H2SO4緩沖液（100 mmol·L-1）；pH 10，碳酸鈉和碳酸氫鈉緩沖液（100 mmol·L-1）；松嫩鹽單胞菌（H.songnen?ensis）NEAU-ST10-39T及突變株及其轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中145 r·min-1、35 ℃培養(yǎng)24 h。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 7。大腸桿菌（E.coli）DH5α轉(zhuǎn)化子在含50μg·mL-1氨芐青霉素LBK平板上37℃培養(yǎng)，在LBK液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、37℃培養(yǎng)24 h。

LBK培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，KCl 6.48 g，pH 7，部分試驗(yàn)中添加NaCl至所需濃度或用BTP-H2SO4緩沖液（pH 7～8.5，100 mmol·L-1）調(diào)至所需pH；大腸桿菌（E.coli）KNabc轉(zhuǎn)化子在含50μg·mL-1氨芐青霉素的LBK平板上37℃培養(yǎng)，在LBK液體培養(yǎng)基中160 r·min-1、37℃培養(yǎng)24 h。

1.2 方法

1.2.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備

挑取NEAU-ST10-39T單菌落于5 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，35℃，145 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h；按2%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL含3%NaCl HLB液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h，期間注意監(jiān)測(cè)菌體OD600吸光度值；待OD600吸光度值達(dá)0.6～0.8后停止培養(yǎng)，冰浴菌液20～30 min；離心收集菌體；去除培養(yǎng)基后用20 mL去離子水重懸菌體，離心，洗滌菌體1次，去除殘留培養(yǎng)基；用20 mL冰預(yù)冷10%甘油緩慢將菌體懸浮，離心后，去盡殘液；重復(fù)上一步驟；用1.5 mL冰預(yù)冷10%甘油將菌體懸浮，并分裝（離心參數(shù)4℃，5 000 r·min-1和10 min）。

1.2.2 敲除載體構(gòu)建

提取pUC-mrp2質(zhì)粒，NcoI單酶切，將酶切后4.4 kb片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，25℃連接2 h。取適量連接體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)后挑取陽性重組子，酶切驗(yàn)證。

為獲得含有mrp2兩側(cè)同源臂片段（截短的mr?pA′和截短的mrpG，即△mrp2）敲除載體，對(duì)pUC-mrp2-NcoⅠ和pK18mobsacB質(zhì)粒分別作SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切，經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞和培養(yǎng)后挑取陽性重組子，雙酶切驗(yàn)證，用于后續(xù)研究。

1.2.3 穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2構(gòu)建

對(duì)穿梭載體pBBR1-MCS5和pUC-mrp2質(zhì)粒分別SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，雙酶切驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒pBBR1-MCS5-mrp2。

1.2.4 mrp2敲除菌株構(gòu)建及驗(yàn)證

為獲得mrp2敲除菌株，通過電轉(zhuǎn)化將pK18 mobsacB-mrp2-NcoI導(dǎo)入NEAU-ST10-39T感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為2 500 V、5 ms；在含卡那霉素（50 μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上篩選單交換菌株，35℃過夜培養(yǎng)；逐個(gè)挑取菌落分別接入不含有和含有卡那霉素（50μg·mL-1）、10%蔗糖和3%NaCl的HLB培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)位置，35℃過夜培養(yǎng)，挑取發(fā)生雙交換菌落菌種保存用于后續(xù)研究。

選擇mrp2操縱子兩端（截短的mrp A′上游和mrpG下游）設(shè)計(jì)引物，對(duì)敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI（△mrp2正對(duì)照）、雙交換菌株NEAUST10-39T-△mrp2-3、NEAU-ST10-39T-△mrp2-4、重組質(zhì)粒pUC-mrp2（mrp2操縱子的正對(duì)照）和野生型菌株NEAU-ST10-39T作PCR驗(yàn)證，體系見表2；經(jīng)初步驗(yàn)證正確后，送北京華大基因股份有限公司測(cè)序，驗(yàn)證敲除正確性。

表2 驗(yàn)證NEAU-ST10-39T-mrp2的PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction mixture of NEAU-ST10-39T-mrp2

1.2.5 mrp2敲除菌株轉(zhuǎn)化子獲得及驗(yàn)證

按上述方法，將pBBR1-MCS5-mrp2電轉(zhuǎn)化敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2感受態(tài)細(xì)胞系列篩選，獲得NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。提取質(zhì)粒，通過酶切驗(yàn)證其正確性。

1.2.6 耐鹽堿分析

野生型菌株耐鹽分析：將野生型菌株NEAUST10-39T接種于分別含有0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、6.0%、9.0%、12.0%、15.0%、16.0%和20%NaCl HLB培養(yǎng)基（pH 7），確定野生型菌株在HLB液體培養(yǎng)基中耐鹽范圍。

敲除菌株耐鹽分析：野生型菌株、NEAUST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和基因敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2分別接種于含有2.0%、6.0%和16.0%NaCl的HLB培養(yǎng)基中（pH 7），檢測(cè)其對(duì)NaCl耐受差異性。

敲除菌株耐堿分析：將野生型菌株、NEAUST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和基因敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2分別接種于含2%NaCl不同pH（5～10）HLB培養(yǎng)基，檢測(cè)其對(duì)堿性pH耐受差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI構(gòu)建

為構(gòu)建mrp2操縱子敲除載體，應(yīng)用DNAman 6.0分析pUC-mrp2和自殺質(zhì)粒pK18mobsacB酶切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)mrp2含多個(gè)Nco I酶切位點(diǎn)，而pUC18載體上無NcoⅠ酶切位點(diǎn)（圖1 A）；且通過SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切可將含有mrp2兩側(cè)同源臂（截短的mrpA′和mrpG，即△mrp2）構(gòu)建到pK18mobsacB相同酶切位點(diǎn)。因此，通過使用NcoⅠ內(nèi)切酶完全酶切pUC-mrp2，膠回收5 kb最大片段（含△mrp2 pUC18載體）并用T4 DNA連接酶自連（見圖2 A），最終獲含mrp2兩側(cè)同源臂（△mrp2）自連質(zhì)粒pUC-mrp2-NcoⅠ（見圖1A、圖2A）。在此基礎(chǔ)上，用SalⅠ和Eco RⅠ對(duì)pUC-mrp2-NcoⅠ和pK18mobsacB作雙酶切，將pUC-mrp2-NcoⅠ酶切產(chǎn)物的1.8 kb小片段（△mrp2）與pK18mobsacB雙酶切產(chǎn)物（1個(gè)5.7 kb載體片段）連接，最后獲得mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoⅠ（圖1A、圖2A）。經(jīng)SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗(yàn)證，該載體構(gòu)建正確（見圖2A）。

圖1 松嫩鹽單胞菌NEAU-ST10-39T中mrp2操縱子敲除Fig.1 Schematicsillustrating theknockout of mrp2 operon from Halomonassongnenensis NEAU-ST10-39T

圖2 自殺載體p K18mobsacB-mrp2-NcoⅠ構(gòu)建及其雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Construction of thesuicideplasmid p K18mobsacB-mrp2-NcoⅠand itsverification by doubleenzymatic digestion

2.2 穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2構(gòu)建

分析DNAman 6.0對(duì)pUC-mrp2和穿梭質(zhì)粒pB?BR1MCS-5酶切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)可通過SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切將pUC-mrp2中帶有啟動(dòng)子和終止子mrp2操縱子構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pBBR1-MCS5。因此，用SalⅠ和Eco RⅠ分別對(duì)pUC-mrp2和pBBR1-MCS5雙酶切（見圖3A），回收pUC-mrp2雙酶切大片段（6.7 kb）和pBBR1-MCS5雙酶切片段（4.8 kb）并用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌（E.coli）KNabc，最后獲得穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2（見圖3A）。經(jīng)SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗(yàn)證，證明該載體構(gòu)建正確（見圖2B）。

2.3 mrp2單交換菌株篩選

為構(gòu)建mrp2的敲除菌株，首先誘導(dǎo)mrp2兩側(cè)同源臂片段（△mrp2）與野生型菌株同源序列單交換（原理如圖1B～C）。為此，mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入野生型菌株NEAU-ST10-39T感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化子及未經(jīng)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（負(fù)對(duì)照）均勻涂布在含卡那霉素（50 μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上，經(jīng)過35℃過夜培養(yǎng)，在涂布轉(zhuǎn)化子平板上出現(xiàn)幾十個(gè)扁平、光滑、不透明黃色菌落，與野生型菌株NEAU-ST10-39T菌落特征一致；對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在涂布未經(jīng)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞平板上，無菌落出現(xiàn)。表明mrp2兩側(cè)同源臂片段（△mrp2）與野生型菌株同源序列發(fā)生單交換，即第1次同源重組（原理見圖2C）。

2.4 mrp2雙交換菌株篩選

為最終構(gòu)建mrp2敲除菌株，需用10%蔗糖篩選壓力脅迫單交換菌株發(fā)生雙交換，促使突變株清除其基因組中自殺質(zhì)粒pK18mobsacB（原理見圖1D）。為此，挑取生長(zhǎng)菌落一一對(duì)應(yīng)分別接種在含有卡那霉素（50μg·mL-1）、10%蔗糖和3%NaCl的HLB固體平板上（見圖4A）和含有10%蔗糖和3%NaCl的HLB固體平板上（見圖4B），35℃培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)菌落在圖4A所示平板上不生長(zhǎng)，在圖4B所示相應(yīng)位置上生長(zhǎng)良好，表明這2個(gè)菌落為雙交換菌株，按其接種順序命名為NEAUST10-39T-△mrp2-3和NEAU-ST10-39T-△mrp2-4，挑取菌落并接種于含有3%NaCl的HLB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后收集菌體保存于-80℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 穿梭載體p BBR1-MCS5-mrp2的構(gòu)建及其雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Construction of the recombinant plasmid p BBR1-MCS5-mrp2 and itsverification by doubleenzymatic digestion

圖4 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子敲除菌株篩選Fig.4 Screening of the mrp2-knockout mutantsof NEAU-ST10-39T

2.5 mrp2的敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證

為驗(yàn)證所獲雙交換菌株是否為mrp2敲除菌株，設(shè)計(jì)引物（見表1）對(duì)敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI（△mrp2正對(duì)照）、雙交換菌株NEAUST10-39T-△mrp2-3、NEAU-ST10-39T-△mrp2-4、重組質(zhì)粒pUC-mrp2（mrp2操縱子正對(duì)照）和野生菌NEAU-ST10-39T作PCR驗(yàn)證（見圖5）。發(fā)現(xiàn)pK18 mobsacB-mrp2-Nco I（△mrp2正對(duì)照）、NEAU-ST10-39T-△mrp2-3和NEAU-ST10-39T-△mrp2-4的PCR產(chǎn)物均約為700 bp；pUC-mrp2（mrp2操縱子正對(duì)照）和NEAU-ST10-39TPCR產(chǎn)物均約為5 600 bp。為進(jìn)一步驗(yàn)證以上2株雙交換株是否為mrp2敲除菌株，最后將NEAU-ST10-39T-△mrp2-3和NEAUST10-39T-△mrp2-4的PCR產(chǎn)物送至北京華大基因股份有限公司測(cè)序，序列結(jié)果用DNAman 6.0作比對(duì)分析，最終確定均為mrp2敲除菌株。選取NEAU-ST10-39T-△mrp2-3命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2，作為mrp2的敲除菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子的敲除菌株的PCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of the mrp2-knockout mutant of NEAU-ST10-39T by PCR

2.6 轉(zhuǎn)化子NEAU-ST10-39T-mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2構(gòu)建

為進(jìn)一步驗(yàn)證NEAU-ST10-39T-△mrp2是否為mrp2的敲除菌株，需分析mrp2操縱子是否可互補(bǔ)該突變株。為此，將pBBR1-MCS5-mrp2電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入NEAU-ST10-39T-△mrp2感受態(tài)細(xì)胞，在含有慶大霉素（50μg·mL-1）和3%NaCl的HLB固體平板上，挑取單菌落提取質(zhì)粒，并經(jīng)SalⅠ和Eco RⅠ雙酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子構(gòu)建正確，將其命名為NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2。

2.7 耐鹽堿分析

為分析野生型菌株的耐鹽能力，將野生型菌株NEAU-ST10-39T接種于分別含有不同濃度NaCl的HLB培養(yǎng)基（pH 7），確定野生型菌株在HLB液體培養(yǎng)基耐鹽范圍為0.5%～16%NaCl（見圖6A）。在此基礎(chǔ)上，分別分析野生型菌株、NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2和敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2對(duì)NaCl和堿性pH耐受差異性。發(fā)現(xiàn)NEAU-ST10-39T-△mrp2/pBBR1-MCS5-mrp2表現(xiàn)出與野生型菌株類似耐鹽能力（見圖6B、6C），進(jìn)一步證實(shí)敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2構(gòu)建正確。在pH 7，2.0%NaCl濃度條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2的生長(zhǎng)情況與野生型菌株、NEAU-ST10-39T-△mrp2/pB?BR1-MCS5-mrp2生長(zhǎng)情況無差異；6.0%和16.0%NaCl濃度時(shí)，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長(zhǎng)情況受抑制（見圖6B），表明mrp2對(duì)宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽條件下生長(zhǎng)具有重要作用。在含有2%NaCl的HLB培養(yǎng)基中，pH 6、7條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2與野生型菌株NEAU-ST10-39T生長(zhǎng)表現(xiàn)無差異；pH 8條件下，敲除菌株NEAU-ST10-39T-△mrp2生長(zhǎng)受抑制（見圖6C），表明mrp2對(duì)宿主菌NEAU-ST10-39T在堿性條件下生長(zhǎng)具有重要作用。

圖6 NEAU-ST10-39T的mrp2操縱子的敲除菌株耐鹽堿測(cè)試Fig.6 Growth test for salt toleranceand alkalinep H resistanceof the mrp2-knockout mutant of NEAU-ST10-39T

3 討論與結(jié)論

中度嗜鹽菌基因敲除十分困難，尤其是革蘭氏陽性中度嗜鹽菌。目前，基因敲除成功僅限于革蘭氏陰性鹽單胞菌屬（Halomonas），并利用三親本接合方式導(dǎo)入外源基因[14]，使用電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入方式敲除未見報(bào)道。三親本接合轉(zhuǎn)化敲除質(zhì)粒方法，可避免導(dǎo)入雙鏈DNA易被受體菌限制性內(nèi)切酶降解風(fēng)險(xiǎn)，但所用受體菌必須具有抗生素抗性，難以實(shí)現(xiàn)敲除菌株與大腸桿菌分離純化。電轉(zhuǎn)化方法操作可避免操作過程中大腸桿菌污染，操作簡(jiǎn)單，工作強(qiáng)度小，試驗(yàn)周期較短。目前，一般使用S-G培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜鹽菌，利于嗜鹽菌快速生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在S-G培養(yǎng)基嗜鹽菌形成細(xì)胞壁較厚，阻礙質(zhì)粒等外源DNA轉(zhuǎn)化[18]。因此，本研究在參照革蘭氏陰性菌和鹽單胞菌的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備方法基礎(chǔ)上[19-20]，選擇含3%NaCl的HLB培養(yǎng)基制備NEAU-ST10-39T電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，成功將敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoⅠ并使穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2導(dǎo)入野生型菌株。本研究將電轉(zhuǎn)化方法首次應(yīng)用于鹽單胞菌基因敲除，對(duì)敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因具有重要指導(dǎo)意義。

松嫩鹽單胞菌（Halomonas songnenensis）NEAUST10-39T是一株可在16%NaCl及pH 8堿性環(huán)境下生長(zhǎng)中的度嗜鹽菌[17]。為分析其高效耐鹽堿機(jī)制，篩選耐鹽堿基因，發(fā)現(xiàn)mrp2是一個(gè)編碼Group 2型Mrp系統(tǒng)操縱子，其在異源宿主大腸桿菌（Esche?richia coli）中表現(xiàn)高效耐鹽堿能力，與已報(bào)道的多亞基鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Mrp系統(tǒng)的同源物）Sa_Mnh[9]、 Bh_Mrp[11]、 Bs_Mrp[10,12]、 Hz_Mrp[13]、Hs_Mrp[14]、Sm_Pha1[15]一致。

為進(jìn)一步探究mrp2在宿主菌中生理功能，本研究構(gòu)建mrp2敲除載體pK18mobsacB-mrp2-NcoI，采用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入野生型菌株NEAUST10-39T，通過PCR驗(yàn)證和穿梭載體pBBR1-MCS5-mrp2互補(bǔ)試驗(yàn)，成功構(gòu)建敲除菌株NEAUST10-39T-△mrp2。耐鹽堿分析，發(fā)現(xiàn)mrp2操縱子對(duì)宿主菌NEAU-ST10-39T在高鹽堿條件下生長(zhǎng)具有重要作用。在非嗜鹽菌和耐鹽菌中，Mrp系統(tǒng)敲除顯著影響其生理功能，如Bs_ Mrp[10,12]、Sm_Pha1等敲除導(dǎo)致耐鹽堿能力顯著下降，甚至喪失[15]。然而，革蘭氏陰性中度嗜鹽菌的鹽單胞菌Y2敲除Mrp系統(tǒng)，使宿主在高鹽堿條件下生長(zhǎng)受到顯著抑制。與本研究結(jié)果一致，因中度嗜鹽菌長(zhǎng)期處于高鹽堿環(huán)境，被迫進(jìn)化更多數(shù)量和類型鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白應(yīng)對(duì)外界極端環(huán)境變化。因此，NEAU-ST10-39T-△mrp2成功構(gòu)建，為敲除鹽單胞菌中其他耐鹽堿基因和揭示基因耐鹽堿機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[1] Ventosa A,Nieto J J,Oren A.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62(2):504-544.

[2] 王爽,楊謙,孫磊,等.鹽堿土中可培養(yǎng)中度嗜鹽菌的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(8):37-42.

[3] 王爽,王玉峰.嗜鹽嗜堿菌株20-13的生物學(xué)特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(2):42-46.

[4] Sarvari S,Seyedjafari E,Amoozgar MA,et al.Theeffect of moder?ately halophilic bacteria supernatant on proliferation and apopto?sis of cancer cells and mesenchymal stem cells[J].Cellular and Molecular Biology,2015,61(3):30-34.

[5] Gomaa E Z.Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by exopolymers synthesized by moderately halophilic bacteria:Chemical composition and functional properties[J].Journal of Polymers and the Environment,2013,21(2):495-503.

[6] Bajpai P.Microbial degradation of pollutants in pulp mill effluents[J].Advancesin Appllied Microbiology,2001,48:79-134.

[7] Swartz TH,Ikewada S,Ishikawa O,et al.The Mrp system:A giant among monovalent cation/proton antiporters?[J].Extremophiles,2005,9(5):345-354.

[8] Krulwich TA,Hicks D B,Ito M.Cation/proton antiporter comple?ments of bacteria:Why so large and diverse?[J].Molecular Micro?biology,2009,74(2):257-260.

[9] Swartz TH,Ito M,Ohira T,et al.Catalytic propertiesof Staphylo?coccus aureus and Bacillus members of the secondary cation/pro?ton antiporter-3(Mrp)family are revealed by an optimized assay in an Escherichia coli host[J].Journal of Bacteriology,2007,189(8):3081-3090.

[10] Ito M,Guffanti A A,Oudega B,Krulwich TA.mrp,a multigene,multifunctional locus in Bacillus subtilis with roles in resistance to cholate and to Na+and in pH homeostasis[J].Journal of Bacteriology,1999,181(8):2394-2402.

[11] Hamamoto T,Hashimoto M,Hino M,et al.Characterization of a gene responsible for the Na+/H+antiporter system of alkalophilic Bacillus species strain C-125[J].Molecular Microbiology,1994,14(5):939-946.

[12] Kajiyama Y,Otagiri M,Sekiguchi J,et al.Complex formation by the mrpABCDEFG gene products,which constitute a principal Na+/H+antiporter in Bacillus subtilis[J].Journal of Bacteriology,2007,189(20):7511-7514.

[13] Meng L,Hong S,Liu H,et al.Cloning and identification of Group 1 mrp operon encoding a novel monovalent cation/proton antiport?er system from the moderate halophile Halomonas zhaodongensis[J].Extremophiles,2014,18(6):963-972.

[14] Cheng B,Meng Y,Cui Y,et al.Alkaline response of a halotoler?ant alkaliphilic Halomonas strain and functional diversity of its Na+(K+)/H+antiporters[J].Journal of Biological Chemistry,2016,291(50):26056-26065.

[15] Putnoky P,Kereszt A,Nakamura T,et al.The pha gene cluster of Rhizobium meliloti involved in pH adaptation and symbiosis en?codes a novel type of K+efflux system[J].Molecular Microbiology,1998,28(6):1091-1101.

[16] Jiang J,Pan Y,Hu S,et al.Halomonas songnenensis sp.nov.,a moderately halophilic bacterium isolated from saline and alkaline soils[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Mi?crobiology,2014,64:1662-1669.

[17] Jiang J,Pan Y,Meng L,et al.Halomonas zhaodongensis sp.nov.,a slightly halophilic bacterium isolated from saline-alkaline soils in Zhaodong,China[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2013,104(5):685-694.

[18] Dzioba-Winogrodzki J,Winogrodzki O,Krulwich T A,et al.The Vibrio cholerae Mrp system:Cation/proton antiport properties and enhancement of bile salt resistance in a heterologous host[J].Jour?nal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2008,16(3-4):176-186.

[19]Harris J R,Lundgren B R,Grzeskowiak B R,et al.A rapid and efficient electroporation method for transformation of Halomonas sp.0-1[J].Journal of Microbiological Methods,2016,129:127-132.

[20] 徐蕊,張苓花.四氫嘧啶吸收缺陷突變株高效制備四氫嘧啶[J].微生物學(xué)報(bào),2012,55(5):661-667.

Construction of Group 2-mrp-knockout mutant of Halomonas songne?nensis and analysis on its halo-alkaline-tolerant capacity

/JIANG uquan,SUN Kaifu,YANG Lina,CHEN Jin,ZHANG Zhenglai
(School of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to analyze of the halo-alkaline-tolerant capacity of mrp2 operon encoding a Group 2 multi-subunit Na+/H+antiporter in the host Halomonas songnenensis NEAU-ST10-39T,the suicide plasmid of mrp2,p K18mobsac B-mrp2-NcoI,was constructed and then electroporated into the wild type NEAU-ST10-39T.Finally,the mrp2-knockout mutant designated NEAU-ST10-39T-△mrp2 wasobtained by using the homologous recombination and counter-selection on the plate containing 10%sucrose.PCR verification and sequencing analysis showed that mrp2 succeeded in being knockout in the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2.For the confirmation of this result,mrp2 was constructed into a broad-host-range shuttle vector,p BBR1-MCS5,and the resultant construct designated p BBR1-MCS5-mrp2 was electroporated into the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2.The resultant transformant was designated NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2.Growth test for the halo-alkaline tolerance showed that the transformant NEAU-ST10-39T-△mrp2/p BBR1-MCS5-mrp2 exhibited the similar growth to the wild type strain NEAU-ST10-39T.In contrast,the growth of the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2 was inhibited under the highly-saline or highly alkaline conditions,revealing that mrp2 played a critical role in the halo-alkaline tolerance of the host NEAU-ST10-39T.Successful application of gene knockout through the electroporation and construction of the mutant NEAU-ST10-39T-△mrp2 will be very helpful for carrying out the knockout of other halo-alkaline tolerant genes from Halomonas genus and further analysis of the halo-alkaline tolerance of mrp2 in the host NEAU-ST10-39T.

Halomonas songnenensis;Group 2 mrp;knockout;halo-alkaline-tolerance

Q933；Q751

A

1005-9369（2017）12-0011-10

時(shí)間2017-12-18 13:40:08 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171218.1339.006.html

姜巨全,孫開福,楊立娜,等.松嫩鹽單胞菌中Group 2 mrp操縱子敲除及突變株耐鹽堿分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(12):11-20.

Jiang Juquan,Sun Kaifu,Yang Lina,et al.Construction of Group 2-mrp-knockout mutant of Halomonas songnenensis and analysis on its halo-alkaline-tolerant capacity[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(12):11-20.(in Chinese with English abstract)

2017-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31570045）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201417）；博士后科研啟動(dòng)資金（LBH-Q14022）

姜巨全（1977-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向主要為分子微生物學(xué)與生物制藥。E-mail：jjqdainty@163.com.